פרוטאומיקה כמותית באמצעות Reductive Dimethylation לתיוג איזוטופ יציב

Summary

תיוג איזוטופ יציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא אסטרטגיה מהירה וזולה לפרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסה מדויקת כמותית. כאן אנו מדגימים שיטה חזקה לעריכה ולניתוח של תערובות חלבון באמצעות הגישה רדה שניתן ליישם כמעט כל סוג מדגם.

Abstract

תיוג איזוטופ היציב של פפטידים על ידי dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא שיטה לכמת במדויק הבדלי ביטוי חלבון בין דגימות באמצעות ספקטרומטר מסה. תיוג רדה מבוצע באמצעות אחת רגיל (אור) או בצורות deuterated (כבדות) של cyanoborohydride פורמלדהיד ונתרן להוסיף שתי קבוצות מתיל לכל אמין בחינם. כאן אנו מדגימים פרוטוקול חזק לתיוג רדה והשוואה כמותית של תערובות חלבונים מורכבות. דגימות חלבון לשם השוואה מתעכלים לפפטידים, שכותרתו לשאת אור או תגי תיל כבדים, מעורב, ושיתוף נותח על ידי LC-MS/MS. שכיחותם חלבון יחסית הן לכמת על ידי השוואת אזורי שיא הכרומתוגרמה יון של גרסאות כבדות וקלות שכותרת של הפפטיד המכונן שחולץ מן MS הספקטרום המלא. השיטה המתוארת כאן כוללת הכנת מדגם על ידי מיצוי שלב מוצק התהפך שלב, תיוג רדה על הטור של פפטידים, חלוקה פפטיד ידי Rev-pH הבסיסיכרומטוגרפיה ersed-שלב (BPRP), וטיהור פפטיד StageTip. אנחנו דנים ביתרונות ומגבלות של תיוג רדה ביחס לשיטות אחרות לשילוב איזוטופ יציב. אנו מדגישים יישומי רומן באמצעות תיוג רדה כשיטת מהירה, זולה, ומדויקת כדי להשוות שכיחותם חלבון בכמעט כל סוג של מדגם.

Introduction

מדידת הבדלי ריכוז של חלבונים רבים בין דגימות מורכבות היא אתגר מרכזי בפרוטאומיקה. יותר ויותר, זה נעשה על ידי תיוג חלבונים בכל דגימה עם תגי איזוטופים שונים, המשלב דגימות, ובאמצעות ספקטרומטריית מסה לכמת הבדלי ריכוז. מספר שיטות קיימות לתיוג איזוטופי יציב של חלבונים ופפטידים. ¹⁵ N תיוג ¹ וSILAC ² להציג תוויות איזוטופי מטבולית in vivo, ואילו ³ ICAT, ⁴ iTRAQ, וdimethylation ההפחתה ⁵ להוסיף תגיות איזוטופ יציבים לאחר מיצוי חלבון ועיכול. בין השיטות הללו, dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) הוא צובר פופולריות כמו שיטה זולה, לשחזור לכמת הבדלי ריכוז חלבון בכמעט כל סוג של מדגם.

תיוג רדה כרוך פפטידים מגיבים עם פורמלדהיד כדי ליצור בסיס שיף, אשר לאחר מכן מצטמצםעל ידי cyanoborohydride. תגובה זו dimethylates קבוצות אמינו חופשיות ברשתות N-Termini והצד ליזין וmonomethylates prolines N-מסוף. הפרוטוקול המתואר כאן methylates פפטידים במדגם 1 עם תווית "קלה" באמצעות ריאגנטים עם אטומי מימן בתפוצתם הטבעית איזוטופי ומדגם 2 עם תווית "כבדה" באמצעות פורמלדהיד deuterated וcyanoborohydride (איור 1). כל קבוצת אמין dimethylated על תוצאות פפטיד בהבדל המוני של 6.0377 דה בין אור וצורות כבדות, אשר מועסקות להבחין בין שתי צורות באמצעות ספקטרומטר מסה. באופן ספציפי, שכיחותם היחסית פפטיד הן לכמת כיחס בין אזורי הכרומתוגרמה יון MS1 חילוץ (יחס אזור שיא MS1) של אור והגרסה כבדה לכל זוג יונים פפטיד. השפע היחסי של חלבון מחושב כיחס אזור שיא MS1 החציוני בין כל פפטידים בחלבון. בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול חזק על התנהגותing ניסויי תיוג רדה ידי LC-MS/MS הכולל חילוץ התהפך שלב פפטיד מוצק שלב, תיוג רדה על עמודות, חלוקה פפטיד על ידי pH הבסיסי התהפך שלב כרומטוגרפיה (BPRP), וטיהור של תערובות הפפטיד באמצעות StageTips (איור 2) . אנחנו דנים ביתרונות ומגבלות של שימוש בתיוג רדה לפרוטאומיקה כמותית.

Protocol

הערה: שיטה זו תוארה ¹² בעבר.

1. בידוד חלבון

הכן 1 מ"ג של חלבון תאי על ידי תאי lysing, רצוי בשיטות פיזיות, כגון עיתונות צרפתית, מכות חרוז, או sonication. הימנע תמוגה תא בתיווך ליזוזים כי האנזים לבלבל מדידות ספקטרומטריית מסה.

2. רטיבות TCA של חלבונים

הוספת חומצת 1 נפח trichloroacetic (TCA) לחלבון 4 כרכים ומקררים על קרח דק 10 כדי לזרז חלבונים. צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של אצטון קר כקרח וצנטריפוגות ב XG 12,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ולהפוך את הצינור על הספסל כדי לייבש את גלולה ל15 דקות. כדורי חלבון חנות ב -80 ° C.

3. חלבונים לפגל וצמצום חוב דיסולפיד

Reלהשעות את החלבונים ל~ 2 מ"ג / מיליליטר ב500 denaturation μl וחיץ ירידה (או אוריאה 4 M או 3% SDS ב50 HEPES מ"מ pH 8.5, 5 מ"מ DTT). לחלופין, כולל מעכבי פרוטאז במאגר. דגירה חלבונים ל30 דקות ב56 מעלות צלזיוס, ואחריו 10 דקות בטמפרטורת חדר.

4. Aklylate קבוצות sulfhydryl חינם לשבש גיבוש דיסולפיד בונד באופן בלתי הפיך

הכן iodoacetamide 0.3 M הטרי במים. זהירות! Iodoacetamide הוא רעיל ביותר. הוסף 25 μl 0.3 M iodoacetamide (ריכוז סופי 15 מ"מ) ל500 חלבון μl ודגירה של 20 דקות בחושך בטמפרטורת חדר. להרוות iodoacetamide ידי הוספת 10 μl של 300 מ"מ DTT (5 מ"מ ריכוז DTT סופי). אחסן את חלבוני alkylated ב -80 ° C.

5. עיכול חלבון

TCA לזרז חלבונים (כפי שמתואר בשלב 2) ו resuspend ב 1 מיליליטר של 50 HEPES מ"מ (pH 8.2), האוריאה ז 1. הכן פתרון מניות של endoprotein LysylASE (יס-C) במים בריכוז של 2 מיקרוגרם / μl ולהוסיף 5 μl לפתרון החלבון. דגירה את התערובת ל16 שעות בטמפרטורת חדר. להבטיח את הריכוז ליס-C הסופי הוא 10 ng / μl ויחס חלבון לLysC (w / w) הוא 1/50 עד 1/200. Resuspend 20 טריפסין הכיתה רצף מיקרוגרם ב40 μl של 50 מ"מ חומצה אצטית, להוסיף 5 μl (10 מיקרוגרם טריפסין) כדי לעכל יס-C, ודגירה במשך 6 שעות ב 37 ° C. להשתמש באותו ריכוז פרוטאז ויחסי פרוטאז לחלבון ליס-C כמשמש לטריפסין.

6. הפוך שלב פפטיד הפקה

1. להפוך לחומצת פפטידים על ידי הוספת חומצת trifluoroacetic (TFA) לריכוז סופי של .0.5% (pH ≈ 2). צרף עמודת C18 לסעפת חילוץ. השתמש בקצב הזרימה הגבוה ביותר האפשרי עבור כל השלבים מלבד טעינה וelution של פפטידים.
2. עמודה רטובה עם אצטוניטריל מיליליטר 6 (ACN). לשטוף טור עם 6 מיליליטר 80% ACN, TFA 0.1%, ולאחר מכן לאזן עם 6 מיליליטר 0.1% TFA. אל תאפשרעמודה לרוץ יבש בין שלבים.
3. תפסיק לחץ ואקום ולטעון 500 מיקרוגרם של פפטידים על הטור בקצב זרימה של כ 1 מיליליטר / דקה. ברגע שפפטידים שנקשרים לעמודה, הוואקום מחדש ולשטוף עם 6 מיליליטר 0.1% TFA, ולאחר מכן עם 3 מיליליטר של חיץ חומצת לימון (0.09 M חומצת לימון, 0.23 M Na ₂ HPO _4, pH 5.5).
   שים לב: יכולות להיות מתויגות כמויות פפטיד גבוהות אבל טור C18 מחייב קיבולת צריך להיות לפחות פי שתיים גבוהים יותר מכמות פפטיד כדי למנוע אובדן מדגם.

7. בעמודת פפטיד תיוג ידי Reductive Dimethylation (רדה תיוג)

לבצע שלב זה מתחת למכסת מנוע כימי כמו המימן ציאניד הוא שוחרר בריכוז נמוך במהלך תהליך התיוג.

1. הכן 12 מיליליטר של ומאגרי "אור", "כבדים" רדה לmethylate אמינים פפטיד בחינם. חיץ רדו אור מורכב מפורמלדהיד 0.8% ו0.12 ​​M cyanoborohydride נתרן נשא מימנים בההפצות EIR טבעיות איזוטופי במאגר חומצת לימון. חיץ רדה כבד מורכב מ0.8% פורמלדהיד deuterated ו0.12 ​​M cyanoborohydride נתרן deuterated במאגר חומצת לימון.
2. דגירה עמודה המכילה פפטידים על ידי הוספת 10 מיליליטר בהיר או חיץ רדה כבד לעמודות המכיל פפטיד בקצב זרימה של 1 מיליליטר / דקה וחזור על מנת להבטיח תיוג מלא. טור לשטוף עם 6 מיליליטר 0.1% TFA ולאחר מכן עם 1 מיליליטר 0.5% חומצה אצטית.
3. תפסיק ואקום וelute פפטידים שכותרתו ראשון עם 1 מיליליטר 40% ACN, 0.5% חומצה אצטית, ולאחר מכן עם 1 מיליליטר 80% ACN, 0.5% חומצה אצטית באמצעות קצב זרימה של כ 0.5 מיליליטר / דקה. אם תרצה, למדוד את יעילות התיוג של דגימות בודדות על ידי ספקטרומטריית מסה לפני הערבוב כבדה וקלות דגימות (ראה "נציג תוצאות"). מערבבים 01:01 דגימות פפטיד כבדות ושכותרתו אור כדי לכמת על ידי ספקטרומטריית מסה.

8. תערובת פפטיד נפרדת בשלב הבסיסי pH הפוך כרומטוגרפיה (BPRP)

pH הבסיסי התהפך כרומטוגרפיה שלב (BPRP) להפריד את תערובת פפטיד לשברים מרובים, אשר מנותחים באופן עצמאי על ידי LC-MS/MS להגדיל את כיסוי proteome.

1. Fractionate תערובת פפטיד על עמודת C18-HPLC ידי יישום הדרגתי של ריכוז ACN גובר ב10 מ"מ אמוניום ביקרבונט (pH 8). התחל עם 5% (v / v) ACN למשך 5 דקות, להגביר 35% ACN ב60 דקות, ולאחר מכן ל90% ACN בדקות 1. לשמר את ACN 90% למשך 4 דקות לפני הפחתת ACN עד 5% מחדש לאזן את העמודה במשך 9 דקות. לאסוף 96 שברים של נפח שווה בצלחת 96 היטב (A1 לH12). לפקח על חלוקה באמצעות גלאי UV ב220 ננומטר ואילו פפטידים משחררי את הטור (10-70 דקות לתנאים שתוארו כאן).
2. שלב את השברים מבארות A1, C1, E1, ו-G1 (A1 שבריר), מB1 בארות, D1, F1, וH1 (B1 שבריר), מבארות A2, C2, E2, ו G2 (A2 שבריר) ובהתאם ל שברים שנותרו. הסר את solvenלא באמצעות צנטריפוגות ואקום. פפטידים resuspend משברי A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11, ו-B12 ב130 μl של 1% urea/0.5 M TFA ולטהר באמצעות StageTips כמתואר בשלב 9. חנות שברים B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, וA12 ב -20 º C.

9. לטהר פפטידים על ידי להפסיק וללכת חילוץ (StageTips)

הכן ⁷ microcolumns C18-StageTip ידי אריזת 200 טיפים פיפטה μl עם שני C18 דיסקים עם קוטר פנימי (ID) של 1.07 מ"מ. שים טיפים שלב לתוך צינורות Eppendorf. השתמש microcentrifuge לשטוף טיפים עם 130 μl של מתנול, ולאחר מכן 130 80% ul ACN, 0.5% חומצה אצטית. לאזן StageTips עם 130 μl 0.1% TFA. העבר את תערובת פפטיד לStageTips ולשטוף עם 130 μl 0.1% TFA, אז 40 μl 0.1% TFA, אז 40 μl 0.5% חומצה אצטית. Elute פפטידים ראשון עם 20 μl 40% ACN, 0.5% חומצה אצטית, אז 20 μl 80% ACN, 0.5% חומצה אצטית. שלב eluatesnd יבש על ידי סינון ואקום.

10. LC-MS/MS microcapillary

1. ממיסים פפטידים ב1-5 μl 5% חומצה פורמית, 5% ACN לריכוז של כ 1 מיקרוגרם / μl. לפתור ~ 1 מיקרוגרם פפטידים על 100 מיקרומטר × 20 סנטימטר עמודת HPLC שלב עם שיפוע של 6-22% ACN ב0.125% חומצה פורמית, התהפך C18 להחיל על 75 או 100 דקות בקצב זרימה של ~ 300 / דקות NL.
2. לזהות פפטידים באמצעות LTQ Orbitrap ולוס ¹² או פלטפורמה דומה נוזל כרומטוגרפיה מסת ספקטרומטריית עם ספקטרומטר מסת מתן ברזולוציה גבוהה ודיוק מסה גבוה. הפעל את ספקטרומטר מסת נתונים במצב תלוי עם מלאה MS סריקה (ברזולוציה של 60,000) שנרכשה במנתח Orbitrap. ליצור מלכודת היונים יניארי MS / MS ספקטרום ל20 יונים הנפוצים ביותר שזוהו בספקטרום MS המלא. הגדרת שליטה אוטומטית מטרות (AGC) עד 1 x 10 ⁶ עבור MS המלא ו -2,000 עבור MS / MS. הגדר פעמים הצטברות יון המרביות ל1,000 אלפיות שנייםלטרשת נפוצה ו150 msec עבור MS / MS. תכלול יונים מבשר פפטיד מקוטעים מבחירה נוספת מ-MS / MS ל20-60 שניות.

11. MS / MS רכישת נתונים

לזהות פפטידים על ידי השוואת קבצי RAW MS / MS ספקטרום למסד נתונים תיאורטי עם אלגוריתם כגון SEQUEST ⁸ שימוש בפרמטרים (טבלת 1).

טבלה 1. חיפוש פרמטרים למסד פפטיד.

פרמטרים כלליים	עיכול tryptic באופן מלא עם עד 2 החמיץ שסעים
	25 סובלנות יון מבשר עמודים לדקה
	1.0 סובלנות יון שבר דה
שינויי סטטי	57.02146 דה בציסטאין, carboxyamidomethylation
	28.03130 דה בליזין ופפטיד N-הסופית, תווית dimethylation אור
שינויים דינמיים	15.99491 דה במתיונין, חמצון
	6.03766 דה בליזין ופפטיד N-הסופית, תווית dimethylation כבדה

1. פפטידים מסנן כדי 1% שיעור גילוי שווא עם שיטה כגון אסטרטגית ⁹ יעד דמה באמצעות מסד נתונים של מסגרות קריאה פתוחות באורינטציות בפועל והתהפכו.

12. פפטיד כימות

לחשב את התחומים כבדים וקלים זוגות MS1 חילוץ יון chromatograms (אזורי שיא MS1) ויחסי פפטיד אות לרעש (S / N) ^10. כוללים זוגות פפטיד רק כאשר ממוצע אות לnoiיחס se הוא מעל חמש. לכמת שפע יחסי של פפטיד בשתי דגימות כיחס בין אזורי שיא של MS1 כבדים וקלות גרסאות של אותו פפטיד (יחס אזור שיא MS1). חישוב שכיחות חלבון יחסי כיחס אזור שיא MS1 החציוני לפפטידים בחלבון.

תוצאות

הערכנו את הדיוק, הדיוק, ושחזור של תיוג רדה באמצעות שמר האפייה וClostridium phytofermentans lysates תא כולו. אנו לכמת את יעילות התיוג רדה מתערובת של ג הראשון phytofermentans lysates חלבון מתאי (שכותרתו כבדה, H) וגלוקוז (תווית אור, L) תרבויות. כאשר מסונן לשיעור גילוי 1% פפטיד שווא, מדגם ז...

Discussion

כמה נקודות לעשות תיוג איזוטופ יציב של פפטידים באמצעות dimethylation רדוקטיבי (תיוג רדה) שיטה אטרקטיבית לפרוטאומיקה כמותיים: ריאגנטים זולים תיוג (ריאגנטים עולים פחות מ 1 $ לדגימה), קצב תגובה מהיר (10 דקות ~), היעדר מוצרי לוואי, גבוהים שחזור (איורים 3, 4), תוצרי תגובה יציבה,...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	protein precipitation
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71736	denature, reduce protein
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	denature, reduce protein
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125	alkylate protein
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	resuspend, extract, label protein
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	resuspend protein
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	protein digestion
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	protein digestion
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	protein digestion
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537	Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges	Waters	WAT054960	Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifold	Waters	WAT200609	Reversed-phase peptide extraction
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	14261	various
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	“light” peptide labeling
Cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	“light” peptide labeling
Deuterated formaldehyde	Sigma-Aldrich	492620	“heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuteride	CDN isotopes	D-1797	“heavy” peptide labeling
MES	Sigma-Aldrich	M3671	peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size)	Agilent	770450-902	basic pH reversed-phase chromatography
Formic acid	Sigma-Aldrich	399388	various
C18 Empore Disks	3M	14-386-3	STAGE tips
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE tips