Quantitative Proteomics Mit reduktive Dimethylierung Stabile Isotope Labeling

Zusammenfassung

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) ist eine schnelle, kostengünstige Strategie für genaue Massenspektrometrie-basierte quantitative Proteomik. Hier zeigen wir ein robustes Verfahren für die Aufbereitung und Analyse von Proteingemischen mit Hilfe der redi Ansatz, der auf fast jedem Probentyp angewandt werden kann.

Zusammenfassung

Stabile Isotopenmarkierung von Peptiden durch reduktive Dimethylierung (Redi Kennzeichnung) ist eine Methode, um genau zu quantifizieren Proteinexpressionsunterschiede zwischen den Proben mit Hilfe der Massenspektrometrie. Redi Kennzeichnung erfolgt mit entweder regelmäßig (Licht) oder deuteriertes (Schwer-) Formen von Formaldehyd und Natriumcyanoborhydrid zu zwei Methylgruppen an jedem freien Amin hinzufügen. Hier zeigen wir, einen robusten Protokoll für REDi Kennzeichnung und quantitativen Vergleich von komplexen Proteingemischen. Proteinproben für den Vergleich sind in Peptide, beschriftet, entweder leicht oder schwer Methyl-Tags, gemischt und mittels LC-MS/MS analysiert Co-tragen verdaut. Relative Protein Häufigkeiten werden durch den Vergleich der Ionenchromatogramm Peakflächen von schweren und leichten markierten Versionen der Peptidbestandteil von der vollen MS-Spektren extrahiert quantifiziert. Das hier beschriebene Verfahren umfasst die Probenvorbereitung durch Umkehrphasen-Festphasenextraktion, On-Column-Redi Markierung von Peptiden, Peptid-Fraktionierung durch basischen pH-reversed-Phase (BPRP) Chromatographie und StageTip Peptidreinigung. Wir diskutieren Vorteile und Grenzen der redi Kennzeichnung gegenüber anderen Methoden zur stabilen Isotopen Gründung. Wir zeigen neue Anwendungen mit Redi Kennzeichnung als eine schnelle, kostengünstige und genaue Methode, um die Proteinhäufigkeiten in fast jeder Art von Probe zu vergleichen.

Einleitung

Messkonzentrationsunterschiede vieler Proteine ​​zwischen komplexen Proben ist eine zentrale Herausforderung in der Proteomik. Zunehmend wird dies durch Markierung von Proteinen in jeder Probe mit unterschiedlichen Isotopen-Tags, die Kombination der Proben und mit Hilfe der Massenspektrometrie, um Konzentrationsunterschiede zu quantifizieren getan. Es gibt verschiedene Verfahren für stabile Isotopenmarkierung von Proteinen und Peptiden. Kennzeichnung ¹⁵ N ¹ und ² SILAC vorstellen Isotopenmarkierungen metabolisch in vivo, während iCAT ^3, iTRAQ ^{4, 5} und Reduktion Dimethylierung nach der Proteinextraktion und Verdauung hinzufügen stabilen Isotopen-Tags. Unter diesen Verfahren wird die reduktive Dimethylierung (Redi-Markierung) an Popularität gewinnt als eine preiswerte, reproduzierbare Methode zur Proteinkonzentration Unterschiede in fast jeder Art von Probe zu quantifizieren.

REDi Markierung beinhaltet die Umsetzung von Peptiden mit Formaldehyd zu einer Schiffschen Base, die dann reduziert wird, zu bilden,von Cyanoborhydrid. Diese Reaktion dimethylates freien Aminogruppen auf N-Termini und Lysin-Seitenketten und monomethylates N-terminale Prolin. Das hier beschriebene Protokoll methyliert Peptide in Probe 1 mit einem "light"-Label unter Verwendung von Reagenzien mit Wasserstoffatomen in ihrer natürlichen Isotopenverteilung und Probe 2 mit einer "schweren" Etikett mit deuteriertem Formaldehyd und Cyanoborhydrid (Abbildung 1). Jeder dimethylierten Aminogruppe auf einem Peptid zu einer Massendifferenz von 6,0377 Da zwischen leichten und schweren Formen, die verwendet wird, um zwischen den beiden Formen mit einem Massenspektrometer zu unterscheiden. Insbesondere werden relativen Häufigkeiten Peptid als das Verhältnis der MS1 extrahiert Ionenchromatogramm Bereiche (Peakflächenverhältnis MS1) von leichten und schweren Version für jedes Peptid Ionenpaar quantifiziert. Die relative Menge eines Proteins wird als Median MS1 ​​Peakflächenverhältnis aller Peptide in dem Protein errechnet. In diesem Bericht beschreiben wir ein robustes Protokoll für das Verhaltening Redi Markierungsexperimente mit LC-MS/MS, die Umkehrphasen-Peptid-Festphasenextraktion, On-Column-Kennzeichnung redi-, Peptid-Fraktionierung durch basischen pH-Reversed-Phase (BPRP) Chromatographie und Reinigung der Peptidgemische mit StageTips (Abbildung 2) umfasst . Wir diskutieren Vor-und Nachteile der Verwendung von Redi Kennzeichnung für die quantitative Proteomik.

Protokoll

HINWEIS: Diese Methode wurde bereits beschrieben ^12.

1. Proteinisolierung

Herstellung von 1 mg Zellprotein durch Lysieren von Zellen, vorzugsweise durch physikalische Methoden wie Französisch Presse Wulst Schlagen oder Ultraschallbehandlung. Vermeiden Lysozym-vermittelte Zell-Lyse, weil das Enzym Massenspektrometrie Messungen zu verwechseln.

2. TCA-Fällung von Proteinen

1 Volumen Trichloressigsäure (TCA) bis 4 Volumen Protein-und Chill auf Eis für 10 min, um Proteine ​​zu fällen. Zentrifuge bei 12.000 × g für 5 min bei 4 ° C und Entfernen des Überstandes. Resuspendieren des Pellets in 1 ml eiskaltem Aceton und Zentrifuge bei 12.000 × g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und das Röhrchen auf der Bank, um das Pellet für 15 Minuten trocknen. Speicher Proteinpellets bei -80 ° C.

3. Proteine ​​denaturieren und die Reduzierung von Disulfidbrücken

ReProteine ​​aussetzen, um ~ 2 mg / ml in 500 ul Denaturierung und Reduktion Puffer (entweder 4 M Harnstoff, 3% SDS in 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT). Optional umfassen einen Proteaseinhibitor in Puffer. Proteine, Inkubation 30 min bei 56 ° C, gefolgt von 10 min bei Raumtemperatur.

4. Aklylate freien Sulfhydrylgruppen irreversibel stören Disulfidbindungsbildung

Bereiten Sie frischen 0,3 M iodoacetamide in Wasser. ACHTUNG! Iodacetamid ist hochgiftig. Hinzufügen von 25 &mgr; l 0,3 M Iodacetamid (15 mM Endkonzentration) zu 500 ul Protein und Inkubation für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Quench iodoacetamide durch Zugabe von 10 ul 300 mM DTT (5 mM DTT endgültige Konzentration). Speichern alkylierten Proteinen bei -80 ° C.

5. Protein Verdauung

TCA-Ausfällung Proteine ​​(wie in Schritt 2 beschrieben) und Resuspendieren in 1 ml 50 mM HEPES (pH 8,2), 1 M Harnstoff. Bereiten Sie eine Stammlösung von Lysyl endoproteinase (Lys-C) in Wasser bei einer Konzentration von 2 ug / ul und mit 5 &mgr; l der Proteinlösung. Inkubieren der Mischung für 16 Stunden bei Raumtemperatur. Sicherzustellen, dass die endgültige Lys-C-Konzentration 10 ng / &mgr; l, und das Protein-zu-LysC-Verhältnis (w / w) 1/50 bis 1/200 ist. Resuspendieren 20 ug Trypsin sequencing grade in 40 ul 50 mM Essigsäure werden 5 ul (10 ug Trypsin) an die Lys-C-Verdau und Inkubation für 6 h bei 37 ° C. Verwenden die gleiche Proteasekonzentration und Protease-zu-Protein-Verhältnisse für die Lys-C wie Trypsin verwendet.

6. Umkehrphasen-Peptid-Extraktion

1. Anzusäuern Peptide durch Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (pH ≈ 2). Bringen Sie eine C18-Säule einer Extraktion vielfältig. Verwenden Sie die höchste Durchflussrate für alle Schritte außer Be-und Elution der Peptide.
2. Nass Säule mit 6 ml Acetonitril (ACN). Waschen Säule mit 6 ml 80% ACN, 0,1% TFA, dann ins Gleichgewicht mit 6 ml 0,1% TFA. Lassen Sie dasSpalte trocken Schritte laufen.
3. Stoppen Vakuumdruck und Last 500 ug von Peptiden auf die Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 1 ml / min. Nachdem Peptide auf die Säule gebunden Neustart Vakuum und wäscht mit 6 ml 0,1% TFA, dann mit 3 ml Zitronensäurepuffer (0,09 M Zitronensäure, 0,23 M Na ₂ HPO _4, pH 5,5).
   Hinweis: Höhere Peptid-Mengen können markiert werden, aber die Bindungskapazität C18-Säule sollte mindestens zwei-fach höher als die Menge an Peptidprobenverlust zu vermeiden.

7. On-Spalte der Peptidmarkierung durch reduktive Dimethylierung (Redi Labeling)

Führen Sie diesen Schritt unter einer chemischen Abzugshaube als Cyanwasserstoff in geringer Konzentration während des Markierungsprozesses freigesetzt.

1. Bereiten Sie 12 ml "Licht" und "schwer" Redi Puffer Peptid freien Amine methylieren. Licht Redi Puffer besteht aus 0,8% Formaldehyd und 0,12 M Natriumcyanoborhydrid Durchführung Wasserstoffatome in their natürliche Isotopenverteilungen in Zitronensäure-Puffer. Schwere Redi Puffer besteht aus 0,8% deuteriertes Formaldehyd und 0,12 M deuteriertem Natriumcyanoborhydrid in Zitronensäure-Puffer.
2. Inkubieren Spalte Peptide durch Zugabe von 10 ml entweder leicht oder schwer Redi Puffer zu den Peptid-enthaltende Spalten am Flussrate von 1 ml / min, und wiederholen Sie die vollständige Kennzeichnung zu gewährleisten. Waschkolonne mit 6 ml 0,1% TFA und dann mit 1 ml 0,5% Essigsäure.
3. Stoppen Vakuum und markierte Peptide eluieren zuerst mit 1 ml 40% ACN, 0,5% Essigsäure, dann mit 1 ml 80% ACN, 0,5% Essigsäure mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,5 ml / min. Wenn gewünscht, messen Sie die Markierungseffizienz der einzelnen Proben mittels Massenspektrometrie vor dem Mischen der schweren und leichten Proben (siehe "Repräsentative Ergebnisse"). Mix 1.01 schweren und leichten markiertes Peptid Proben massenspektrometrisch quantifiziert werden.

8. Separate Peptidmischung von Basic pH Reversed Phase (BPRP) Chromatographie

Basischen pH-Reversed-Phase (BPRP) gereinigt, um die Peptid-Gemisch in mehrere Fraktionen, die unabhängig von LC-MS/MS analysiert werden Proteom-Abdeckung zu erhöhen trennen.

1. Fraktionierung der Peptidmischung auf einer C18-HPLC-Säule durch Anlegen eines Gradienten mit zunehmender ACN-Konzentration in 10 mM Ammoniumbicarbonat (pH 8). Beginnen mit 5% (v / v) ACN für 5 min, zu erhöhen, um 35% ACN in 60 min, und dann auf 90% ACN in 1 min. Bewahren Sie die 90% ACN für 4 min vor Verringerung der ACN zu 5% wieder ins Gleichgewicht die Spalte für 9 min. Sammeln 96 Fraktionen von gleichem Volumen in einer 96-Well-Platte (A1 bis H12). Überwachung der Fraktionierung unter Verwendung eines UV-Detektors bei 220 nm, während Peptide Elution von der Säule (10-70 min für den hier beschriebenen Bedingungen).
2. Kombinieren Fraktionen aus Vertiefungen A1, C1, E1 und G1 (Fraktion A1) aus den Vertiefungen B1, D1, F1 und H1 (Fraktion B1) aus den Vertiefungen A2, C2, E2 und G2 (Fraktion A2) und demgemäß für die restlichen Fraktionen. Entfernen Sie die Zahlungsfähigkeitt mit einer Vakuumzentrifuge. Resuspendieren Peptide von Fraktionen A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 und B12 in 130 ul 1 M urea/0.5% TFA und Reinigung mit StageTips wie in Schritt 9 beschrieben. Shop Fraktionen B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, A12 und bei -20 º C.

9. Purify Peptiden durch Stop and Go Extraction (StageTips)

Bereiten C18-StageTip ⁷ Mikrosäulen durch die Verpackung 200 ul Pipettenspitzen mit zwei C18-Festplatten mit einem Innendurchmesser (ID) von 1,07 mm. Setzen Bühnen Tipps in Eppendorf-Röhrchen. Verwenden Sie einen Mikro um Tipps mit 130 ul Methanol, dann 130 ul 80% ACN, 0,5% Essigsäure waschen. Ins Gleichgewicht StageTips mit 130 ul 0,1% TFA. Peptidgemisch zu übertragen StageTips und wäscht mit 130 ul 0,1% TFA, dann wurden 40 ul 0,1% TFA, dann 40 &mgr; l 0,5% Essigsäure. Peptide eluieren zuerst mit 20 ul 40% ACN, 0,5% Essigsäure, dann 20 ul 80% ACN, 0,5% Essigsäure. Kombinieren Sie ein Eluatend trockenen durch Vakuumfiltration.

10. Mikrokapillar LC-MS/MS

1. Lösen Peptide in 1-5 ul 5% Ameisensäure, 5% ACN in einer Konzentration von etwa 1 ug / ul. Beheben ~ 1 &mgr; g Peptide auf eine 100 &mgr; m × 20 cm C18-Umkehrphasen-HPLC-Säule mit einem Gradienten von 6-22% ACN in 0,125% Ameisensäure über 75 oder 100 min aufgebracht mit einer Flussrate von ca. 300 Nl / min.
2. Identifizieren Peptide mit Hilfe eines LTQ Orbitrap Velos ¹² oder ähnliche Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Plattform mit einem Massenspektrometer bietet hohe Auflösung und hohe Massengenauigkeit. Betreiben Sie das Massenspektrometer in den datenabhängigen Modus mit einem vollen MS-Scan (Auflösung von 60.000) in der Orbitrap Analysator erworben. Generieren linearen Ionenfalle MS / MS-Spektren für die 20 in der Voll MS-Spektrum erkannt häufigsten Ionen. Einstellen der automatischen Verstärkungsregelung (AGC) Ziele zu 1 × 10 ⁶ für die volle MS und 2.000 für MS / MS. Stellen Sie maximale Ionenakkumulationszeiten bis 1000 msfür MS und 150 ms für MS / MS. Ausschließen fragmentierten Peptid-Vorläufer-Ionen von der weiteren Auswahl von MS / MS für 20-60 sek.

11. MS / MS-Datenerfassung

Peptide zu identifizieren durch Vergleichen MS / MS-Spektren Rohdaten zu einem theoretischen Datenbank mit einem Algorithmus, wie SEQUEST ⁸ unter Verwendung dieser Parameter (Tabelle 1).

Tabelle 1. Peptid Datenbanksuchparameter.

Allgemeine Parameter	vollständig tryptischen Verdau mit bis zu 2 verpasst Spaltungen
	25 ppm Vorläuferionen Toleranz
	1.0 Da Fragmentionentoleranz
Statische Änderungen	57,02146 Da auf Cystein, Carboxyamidomethylierung
	28,03130 Da auf Lysin und dem Peptid N-Terminus, Licht Dimethylierung Label
Dynamische Änderungen	15,99491 Da an Methionin, Oxidation
	Da auf 6,03766 Lysin und dem Peptid N-Terminus, schwere Dimethylierung Label

1. Filter Peptide zu einer falschen Erkennungsrate von 1% mit einem Verfahren wie dem ^{Ziel-Decoy-9-Strategie} unter Verwendung einer Datenbank von offenen Leserahmen in den tatsächlichen und Orientierungen umgekehrt.

12. Peptid-Quantifizierung

Berechnen Sie die Bereiche der schweren und leichten Paare von MS1 extrahiert Ionenchromatogramme (MS1 Peakflächen) und Peptid-Signal-zu-Rauschen (S / N)-Verhältnisse ^10. Fügen Peptidpaare nur, wenn ihre durchschnittlichen Signal-noise Verhältnis über fünf. Quantifizierung der relativen Menge eines Peptids in den zwei Proben als das Verhältnis der Peakflächen MS1 ​​von schweren und leichten Varianten des gleichen Peptids (MS1 Peakflächenverhältnis). Berechnen relativer Häufigkeiten Protein als Median MS1 ​​Peakflächenverhältnis für alle Peptide in dem Protein.

Ergebnisse

Wir untersuchten die Genauigkeit, Präzision und Reproduzierbarkeit der redi Kennzeichnung mit Saccharomyces cerevisiae und Clostridium phytofermentans Ganzzelllysaten. Wir haben zuerst quantifiziert die redi Markierungseffizienz aus einer Mischung von C phytofermentans Proteinlysate aus Cellulose (schwere beschriftet, H) und Glucose (Licht-Label, L) Kulturen. Wenn ein Peptid False Discovery Rate 1% gefiltert, enthielt diese Probe 11.194 einzigartige Peptidsequenzen mit einer Redi Markierungse...

Diskussion

Einige Punkte machen stabilen Isotopenmarkierung von Peptiden mittels reduktiven Dimethylierung (Redi Kennzeichnung) eine attraktive Methode für die quantitative Proteomik: kostengünstige Markierungsreagenzien (Reagenzien kostet weniger als $ 1 pro Probe), schnelle Reaktionsgeschwindigkeit (~ 10 min), das Fehlen von Nebenprodukten, hohe Reproduzierbarkeit (Fig. 3, 4), stabiler Reaktionsprodukte, die Fähigkeit, eine beliebige Protease verwendet, und hohe Ionisierungseffizienz von markierten Peptiden. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	protein precipitation
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71736	denature, reduce protein
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	denature, reduce protein
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125	alkylate protein
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	resuspend, extract, label protein
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	resuspend protein
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	protein digestion
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	protein digestion
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	protein digestion
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537	Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges	Waters	WAT054960	Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifold	Waters	WAT200609	Reversed-phase peptide extraction
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	14261	various
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	“light” peptide labeling
Cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	“light” peptide labeling
Deuterated formaldehyde	Sigma-Aldrich	492620	“heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuteride	CDN isotopes	D-1797	“heavy” peptide labeling
MES	Sigma-Aldrich	M3671	peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size)	Agilent	770450-902	basic pH reversed-phase chromatography
Formic acid	Sigma-Aldrich	399388	various
C18 Empore Disks	3M	14-386-3	STAGE tips
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE tips