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Method Article
Etichettatura isotopi stabili di peptidi da dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un rapido strategia economica per proteomica accurate di massa a base di spettrometria-quantitativi. Qui mostriamo un metodo efficace per la preparazione e l'analisi di miscele proteiche che utilizzano l'approccio Redi che può essere applicato a quasi qualsiasi tipo di campione.
Etichettatura isotopi stabili di peptidi di dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un metodo per quantificare con precisione le differenze di espressione proteica tra campioni utilizzando la spettrometria di massa. Etichettatura Redi viene eseguita utilizzando sia regolare (luce) o deuterati (pesanti) forme di formaldeide e sodio cianoboroidruro di aggiungere due gruppi metilici ad ogni ammina libera. Qui mostriamo un protocollo robusto per l'etichettatura Redi e comparazione quantitativa di miscele di proteine complesse. Campioni di proteine di confronto vengono digeriti in peptidi, etichettati a portare luce o tag metilici pesanti, mescolato, e co-analizzati mediante LC-MS/MS. Abbondanze relative di proteina sono quantificate confrontando le aree di picco di ioni cromatogramma delle versioni etichettate pesanti e leggeri del peptide costituente estratto dalla piena MS spettri. Il metodo qui descritto comprende la preparazione del campione mediante estrazione in fase solida in fase inversa, etichettatura Redi on-column di peptidi, peptide frazionamento da pH rev basefase ersed (BPRP) cromatografia, e StageTip depurazione peptide. Discutiamo vantaggi ei limiti di etichettatura Redi rispetto ad altri metodi per isotopi stabili incorporazione. Evidenziamo nuove applicazioni utilizzando etichettatura Redi come un metodo rapido, economico e preciso per confrontare le abbondanze di proteine in quasi ogni tipo di campione.
Misurare differenze di concentrazione di molte proteine tra i campioni complessi è una sfida centrale in proteomica. Sempre più spesso, questo viene fatto etichettando le proteine in ogni campione con diversi tag isotopiche, mescolando i campioni, e l'utilizzo di spettrometria di massa per quantificare le differenze di concentrazione. Esistono diversi metodi per l'etichettatura isotopica stabile di proteine e peptidi. 15 N etichettatura 1 e 2 SILAC introdurre etichette isotopiche metabolicamente in vivo, che iCAT 3, iTRAQ 4, e la riduzione dimethylation 5 aggiungere tag isotopi stabili dopo l'estrazione delle proteine e la digestione. Tra questi metodi, dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) sta guadagnando popolarità come un poco costoso, metodo riproducibile per quantificare le differenze di concentrazione di proteine in quasi ogni tipo di campione.
Etichettatura REDI comporta peptidi che reagiscono con formaldeide per formare una base di Schiff, che viene poi ridottoda cianoboroidruro. Questa reazione dimethylates gruppi amminici liberi su N-Termini e laterali lisina catene e monomethylates proline N-terminale. Il protocollo qui descritto metila peptidi nel campione 1 con un'etichetta "luce" utilizzando reagenti con atomi di idrogeno nella loro distribuzione isotopica naturale e campione 2 con un'etichetta "pesante" utilizzando formaldeide deuterato e cianoboroidruro (Figura 1). Ogni gruppo amminico dimetilato su un peptide provoca una differenza di massa di 6,0377 Da tra luce e forme pesanti, che viene impiegata per distinguere tra i due moduli utilizzando uno spettrometro di massa. In particolare, abbondanze peptide relativi vengono quantificati come rapporto delle aree cromatogramma ionico MS1 estratti (MS1 rapporto dell'area di picco) di luce e versione pesante per ogni coppia peptide ione. L'abbondanza relativa di una proteina è calcolato come rapporto mediano area del picco MS1 tra tutti i peptidi della proteina. In questo rapporto, descriviamo un protocollo robusto per comportamentozione esperimenti di marcatura Redi da LC-MS/MS che include peptide estrazione a fase inversa in fase solida, etichettatura on-column Redi, peptide frazionamento da pH basico fase (BPRP) cromatografia inversa, e la purificazione di miscele di peptidi utilizzando StageTips (Figura 2) . Discutiamo vantaggi ei limiti di utilizzo etichettatura redi per proteomica quantitativa.
NOTA: Questo metodo è stato descritto in precedenza 12.
1. Proteina Isolamento
Preparare 1 mg di proteina cellulare da parte delle cellule di lisi, preferibilmente con metodi fisici come stampa francese, perlina percosse, o ultrasuoni. Evitare di lisozima-lisi cellulare mediata perché l'enzima si confondono misure di spettrometria di massa.
2. TCA precipitazione delle proteine
Aggiungere acido tricloroacetico 1 volume (TCA) a 4 volumi di proteine e freddo in ghiaccio per 10 minuti per precipitare le proteine. Centrifugare a 12.000 xg per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in 1 ml di acetone ghiacciato e centrifugare a 12.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e invertire il tubo sul banco per asciugare il pellet per 15 min. Pellets proteine Conservare a -80 ° C.
3. Denaturare le proteine e ridurre disolfuro Obbligazioni
Resospendere proteine a ~ 2 mg / ml in 500 microlitri tampone di denaturazione e riduzione (o 4 M urea o 3% SDS in 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT). Facoltativamente, includere un inibitore della proteasi nel buffer. Incubare proteine per 30 min a 56 ° C, seguita da 10 minuti a temperatura ambiente.
4. Aklylate gratis solfidrile Gruppi di interrompere Irreversibilmente legame disolfuro Formazione
Preparare fresco 0.3 M iodoacetamide in acqua. ATTENZIONE! Iodoacetamide è altamente tossico. Aggiungere 25 microlitri 0,3 M iodoacetamide (15 mm concentrazione finale) a 500 microlitri di proteine e incubare per 20 minuti al buio a temperatura ambiente. Placare iodoacetamide con l'aggiunta di 10 ml di 300 mM DTT (5 mM concentrazione finale DTT). Conservare le proteine alchilati a -80 ° C.
5. Digestione delle proteine
TCA precipitare le proteine (come descritto al punto 2) e risospendere in 1 ml di HEPES 50 mM (pH 8.2), 1 M urea. Preparare una soluzione stock di Lysyl endoproteinase (Lys-C) in acqua ad una concentrazione di 2 mg / mL e aggiungere 5 ml della soluzione proteica. Incubare la miscela per 16 ore a temperatura ambiente. Garantire la concentrazione finale Lys-C è 10 ng / ml e il rapporto proteina-to-lysC (w / w) è 1/50 a 1/200. Risospendere 20 mcg sequenziamento grado tripsina in 40 ml di 50 mM di acido acetico, aggiungere 5 ml (10 mg tripsina) alla Lys-C digest, e incubare per 6 ore a 37 ° C. Utilizzare la stessa concentrazione proteasi e rapporti proteasi-to-proteina per Lys-C come usato per la tripsina.
6. Fase inversa Peptide Estrazione
7. On-colonna Peptide Labeling da riduttiva dimethylation (Redi Labeling)
Eseguire questo passaggio sotto una cappa chimica cianuro di idrogeno viene rilasciato in bassa concentrazione durante il processo di etichettatura.
8. Peptide separato miscela in base pH fase reversibile (BPRP) Cromatografia
PH basico fase inversa (BPRP) cromatografia per separare la miscela di peptidi in più frazioni, che vengono analizzati in modo indipendente da LC-MS/MS per aumentare la copertura proteoma.
9. Purify peptidi da Stop and Go estrazione (StageTips)
Preparare C18-StageTip 7 microcolonne da imballaggio 200 ml punte per pipette con due C18 dischi con un diametro interno (ID) di 1,07 mm. Mettere Fase Consigli in tubi Eppendorf. Utilizzare una microcentrifuga per lavare punte con 130 ml di metanolo, quindi 130 ul 80% ACN, 0,5% di acido acetico. Equilibrare StageTips con 130 microlitri 0,1% TFA. Trasferire la miscela di peptidi a StageTips e lavare con 130 microlitri 0,1% TFA, quindi 40 microlitri 0,1% TFA, quindi 40 microlitri 0,5% di acido acetico. Eluire peptidi prima con il 20 microlitri 40% ACN, 0,5% di acido acetico, poi 20 l 80% ACN, 0,5% di acido acetico. Combina eluati unnd secco mediante filtrazione sotto vuoto.
10. Microcapillare LC-MS/MS
11. MS / MS Acquisizione Dati
Identificare peptidi confrontando file RAW spettri MS / MS ad un database teorico con un algoritmo come SEQUEST 8 utilizzando questi parametri (Tabella 1).
Tabella 1. Peptide ricerca database dei parametri.
Parametri generali | digestione completamente trittico con un massimo di 2 perdere fratture |
25 ppm tolleranza ione precursore | |
1.0 Da tolleranza agli ioni frammento | |
Modifiche statici | 57,02146 Da sulla cisteina, carboxyamidomethylation |
28,03130 Da sulla lisina e il peptide N-terminale, etichetta dimethylation luce | |
Modifiche dinamici | Da 15,99,491 mila su metionina, ossidazione |
6,03766 Da sulla lisina e il peptide N-terminale, etichetta dimethylation pesante |
12. Peptide Quantificazione
Calcolare le aree di coppie pesanti e leggeri di MS1 estratti ioni cromatogrammi (aree di picco MS1) e peptide segnale-rumore (S / N) Formati 10. Includi coppie peptide solo quando il loro segnale medio-to-noirapporto se è superiore a cinque. Quantificare abbondanza relativa di un peptide nei due campioni come il rapporto delle aree dei picchi MS1 di versioni pesanti e leggere dello stesso peptide (MS1 rapporto dell'area di picco). Calcola abbondanze proteici relativamente come mediana rapporto area del picco MS1 per tutti i peptidi della proteina.
Abbiamo valutato l'accuratezza, la precisione e riproducibilità di etichettatura Redi utilizzando Saccharomyces cerevisiae e Clostridium phytofermentans lisati cellulari interi. In primo luogo abbiamo quantificato l'efficienza etichettatura Redi di un mix di C. phytofermentans lisati proteici da cellulosa (pesante etichetta, H) e glucosio (etichetta luce, L) culture. Quando filtrato per un peptide tasso di scoperta di falsi 1%, questo campione conteneva 11.194 sequenze peptidiche unic...
Numerosi punti fanno etichettatura isotopo stabile di peptidi utilizzando un metodo interessante per la proteomica quantitativa dimethylation riduttiva (etichettatura Redi): reagenti poco costosi di etichettatura (reagenti costano meno di $ 1 per esempio), velocità di reazione rapida (~ 10 min), assenza di prodotti collaterali, alte riproducibilità (figure 3, 4), prodotti di reazione stabili, capacità di utilizzare qualsiasi proteasi e ad alta efficienza di ionizzazione dei peptidi marcati. Etichetta...
Gli autori dichiarano di non interessi finanziari concorrenti o altri conflitti di interesse.
We thank SP Gygi and GM Church for help and guidance. This work was supported by a CNRS chaire d'excellence to ACT.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | protein precipitation |
acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | protein precipitation |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 71736 | denature, reduce protein |
sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | denature, reduce protein |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43816 | denature, reduce, alkylate protein |
protease Inhibitor Complete Mini Cocktail | Roche | 4693124001 | denature, reduce protein |
iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | alkylate protein |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | resuspend, extract, label protein |
calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | resuspend protein |
Lysyl Endoprotease | Wako Chemicals | 129-02541 | protein digestion |
sequencing grade trypsin | Promega | V5111 | protein digestion |
acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | protein digestion |
trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537 | Reversed-phase peptide extraction |
tC18 Sep-Pak C18 cartridges | Waters | WAT054960 | Reversed-phase peptide extraction |
extraction manifold | Waters | WAT200609 | Reversed-phase peptide extraction |
acetonitrile | Sigma-Aldrich | 14261 | various |
formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | “light” peptide labeling |
cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | “light” peptide labeling |
deuterated formaldehyde | Sigma-Aldrich | 492620 | “heavy” peptide labeling |
sodium cyanoborodeuteride | CDN isotopes | D-1797 | “heavy” peptide labeling |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | peptide labeling |
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size) | Agilent | 770450-902 | basic pH reversed-phase chromatography |
formic acid | Sigma-Aldrich | 399388 | various |
C18 Empore Disks | 3M | 14-386-3 | STAGE tips |
methanol | Sigma-Aldrich | 494437 | STAGE tips |
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