La proteomica quantitativa, utilizzando riduttiva dimethylation per Stable Isotope Labeling

Riepilogo

Etichettatura isotopi stabili di peptidi da dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un rapido strategia economica per proteomica accurate di massa a base di spettrometria-quantitativi. Qui mostriamo un metodo efficace per la preparazione e l'analisi di miscele proteiche che utilizzano l'approccio Redi che può essere applicato a quasi qualsiasi tipo di campione.

Abstract

Etichettatura isotopi stabili di peptidi di dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) è un metodo per quantificare con precisione le differenze di espressione proteica tra campioni utilizzando la spettrometria di massa. Etichettatura Redi viene eseguita utilizzando sia regolare (luce) o deuterati (pesanti) forme di formaldeide e sodio cianoboroidruro di aggiungere due gruppi metilici ad ogni ammina libera. Qui mostriamo un protocollo robusto per l'etichettatura Redi e comparazione quantitativa di miscele di proteine ​​complesse. Campioni di proteine ​​di confronto vengono digeriti in peptidi, etichettati a portare luce o tag metilici pesanti, mescolato, e co-analizzati mediante LC-MS/MS. Abbondanze relative di proteina sono quantificate confrontando le aree di picco di ioni cromatogramma delle versioni etichettate pesanti e leggeri del peptide costituente estratto dalla piena MS spettri. Il metodo qui descritto comprende la preparazione del campione mediante estrazione in fase solida in fase inversa, etichettatura Redi on-column di peptidi, peptide frazionamento da pH rev basefase ersed (BPRP) cromatografia, e StageTip depurazione peptide. Discutiamo vantaggi ei limiti di etichettatura Redi rispetto ad altri metodi per isotopi stabili incorporazione. Evidenziamo nuove applicazioni utilizzando etichettatura Redi come un metodo rapido, economico e preciso per confrontare le abbondanze di proteine ​​in quasi ogni tipo di campione.

Introduzione

Misurare differenze di concentrazione di molte proteine ​​tra i campioni complessi è una sfida centrale in proteomica. Sempre più spesso, questo viene fatto etichettando le proteine ​​in ogni campione con diversi tag isotopiche, mescolando i campioni, e l'utilizzo di spettrometria di massa per quantificare le differenze di concentrazione. Esistono diversi metodi per l'etichettatura isotopica stabile di proteine ​​e peptidi. ¹⁵ N etichettatura ¹ e ² SILAC introdurre etichette isotopiche metabolicamente in vivo, che iCAT ^3, iTRAQ ^4, e la riduzione dimethylation ⁵ aggiungere tag isotopi stabili dopo l'estrazione delle proteine ​​e la digestione. Tra questi metodi, dimethylation riduttiva (etichettatura Redi) sta guadagnando popolarità come un poco costoso, metodo riproducibile per quantificare le differenze di concentrazione di proteine ​​in quasi ogni tipo di campione.

Etichettatura REDI comporta peptidi che reagiscono con formaldeide per formare una base di Schiff, che viene poi ridottoda cianoboroidruro. Questa reazione dimethylates gruppi amminici liberi su N-Termini e laterali lisina catene e monomethylates proline N-terminale. Il protocollo qui descritto metila peptidi nel campione 1 con un'etichetta "luce" utilizzando reagenti con atomi di idrogeno nella loro distribuzione isotopica naturale e campione 2 con un'etichetta "pesante" utilizzando formaldeide deuterato e cianoboroidruro (Figura 1). Ogni gruppo amminico dimetilato su un peptide provoca una differenza di massa di 6,0377 Da tra luce e forme pesanti, che viene impiegata per distinguere tra i due moduli utilizzando uno spettrometro di massa. In particolare, abbondanze peptide relativi vengono quantificati come rapporto delle aree cromatogramma ionico MS1 estratti (MS1 rapporto dell'area di picco) di luce e versione pesante per ogni coppia peptide ione. L'abbondanza relativa di una proteina è calcolato come rapporto mediano area del picco MS1 tra tutti i peptidi della proteina. In questo rapporto, descriviamo un protocollo robusto per comportamentozione esperimenti di marcatura Redi da LC-MS/MS che include peptide estrazione a fase inversa in fase solida, etichettatura on-column Redi, peptide frazionamento da pH basico fase (BPRP) cromatografia inversa, e la purificazione di miscele di peptidi utilizzando StageTips (Figura 2) . Discutiamo vantaggi ei limiti di utilizzo etichettatura redi per proteomica quantitativa.

Protocollo

NOTA: Questo metodo è stato descritto in precedenza ^12.

1. Proteina Isolamento

Preparare 1 mg di proteina cellulare da parte delle cellule di lisi, preferibilmente con metodi fisici come stampa francese, perlina percosse, o ultrasuoni. Evitare di lisozima-lisi cellulare mediata perché l'enzima si confondono misure di spettrometria di massa.

2. TCA precipitazione delle proteine

Aggiungere acido tricloroacetico 1 volume (TCA) a 4 volumi di proteine ​​e freddo in ghiaccio per 10 minuti per precipitare le proteine. Centrifugare a 12.000 xg per 5 minuti a 4 ° C e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet in 1 ml di acetone ghiacciato e centrifugare a 12.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e invertire il tubo sul banco per asciugare il pellet per 15 min. Pellets proteine ​​Conservare a -80 ° C.

3. Denaturare le proteine ​​e ridurre disolfuro Obbligazioni

Resospendere proteine ​​a ~ 2 mg / ml in 500 microlitri tampone di denaturazione e riduzione (o 4 M urea o 3% SDS in 50 mM HEPES pH 8,5, 5 mM DTT). Facoltativamente, includere un inibitore della proteasi nel buffer. Incubare proteine ​​per 30 min a 56 ° C, seguita da 10 minuti a temperatura ambiente.

4. Aklylate gratis solfidrile Gruppi di interrompere Irreversibilmente legame disolfuro Formazione

Preparare fresco 0.3 M iodoacetamide in acqua. ATTENZIONE! Iodoacetamide è altamente tossico. Aggiungere 25 microlitri 0,3 M iodoacetamide (15 mm concentrazione finale) a 500 microlitri di proteine ​​e incubare per 20 minuti al buio a temperatura ambiente. Placare iodoacetamide con l'aggiunta di 10 ml di 300 mM DTT (5 mM concentrazione finale DTT). Conservare le proteine ​​alchilati a -80 ° C.

5. Digestione delle proteine

TCA precipitare le proteine ​​(come descritto al punto 2) e risospendere in 1 ml di HEPES 50 mM (pH 8.2), 1 M urea. Preparare una soluzione stock di Lysyl endoproteinase (Lys-C) in acqua ad una concentrazione di 2 mg / mL e aggiungere 5 ml della soluzione proteica. Incubare la miscela per 16 ore a temperatura ambiente. Garantire la concentrazione finale Lys-C è 10 ng / ml e il rapporto proteina-to-lysC (w / w) è 1/50 a 1/200. Risospendere 20 mcg sequenziamento grado tripsina in 40 ml di 50 mM di acido acetico, aggiungere 5 ml (10 mg tripsina) alla Lys-C digest, e incubare per 6 ore a 37 ° C. Utilizzare la stessa concentrazione proteasi e rapporti proteasi-to-proteina per Lys-C come usato per la tripsina.

6. Fase inversa Peptide Estrazione

1. Acidificare peptidi aggiungendo acido trifluoroacetico (TFA) a una concentrazione finale di 0,5% (pH ≈ 2). Attaccare una colonna C18 a un collettore di aspirazione. Usare la massima portata possibile per tutti i passaggi tranne carico e eluizione dei peptidi.
2. Colonna bagnato con 6 ml di acetonitrile (ACN). Lavare colonna con 6 ml 80% ACN, 0,1% TFA, poi equilibrare con 6 ml 0,1% TFA. Non permettere che lacolonna di funzionare a secco tra i passaggi.
3. Arrestare pressione di vuoto e carica 500 pg di peptidi sulla colonna ad una velocità di flusso di circa 1 ml / min. Una volta peptidi hanno legato alla colonna, riavvio vuoto e lavare con 6 ml 0,1% TFA, poi con 3 ml di tampone di acido citrico (0,09 M di acido citrico, 0.23 M Na ₂ HPO _4, pH 5.5).
   Nota: gli importi più elevati di peptide possono essere etichettati ma la colonna C18 capacità di legame dovrebbero essere almeno due volte più elevate rispetto alla quantità peptide per evitare la perdita del campione.

7. On-colonna Peptide Labeling da riduttiva dimethylation (Redi Labeling)

Eseguire questo passaggio sotto una cappa chimica cianuro di idrogeno viene rilasciato in bassa concentrazione durante il processo di etichettatura.

1. Preparare 12 ml di "leggere" e "pesanti" buffer Redi a metilare ammine peptide gratuiti. Tampone Redi Luce si compone di 0,8% di formaldeide e 0,12 M sodiocianoboroidruro trasportano idrogeno in thEIR distribuzioni isotopiche naturali in tampone acido citrico. Tampone REDI pesante consiste di 0,8% di formaldeide deuterato e 0,12 M sodiocianoboroidruro deuterato in tampone acido citrico.
2. Incubare colonna contenente peptidi aggiungendo 10 ml luce o tampone Redi pesante alle colonne contenenti peptidi a portata di 1 ml / min e ripetere garantire un'etichettatura completa. Lavare colonna con 6 ml 0,1% TFA e poi con 1 ml di 0,5% acido acetico.
3. Arrestare vuoto ed eluire prima peptidi marcati con 1 ml di 40% ACN, 0,5% di acido acetico, poi con 1 ml di 80% ACN, 0,5% di acido acetico utilizzando una portata di circa 0,5 ml / min. Se lo si desidera, misurare l'efficienza etichettatura dei singoli campioni mediante spettrometria di massa prima della miscelazione campioni pesanti e leggeri (vedi "Rappresentante dei risultati"). Mescolare 01:01 campioni peptide pesanti e leggeri etichettati per essere quantificata mediante spettrometria di massa.

8. Peptide separato miscela in base pH fase reversibile (BPRP) Cromatografia

PH basico fase inversa (BPRP) cromatografia per separare la miscela di peptidi in più frazioni, che vengono analizzati in modo indipendente da LC-MS/MS per aumentare la copertura proteoma.

1. Frazionare la miscela peptidica su una colonna C18-HPLC applicando un gradiente di concentrazione crescente ACN in 10 mM di bicarbonato di ammonio (pH 8). Iniziare con 5% (v / v) ACN per 5 min, aumentare al 35% ACN, in 60 minuti, e poi al 90% ACN in 1 min. Conservare il ACN 90% per 4 minuti prima di ridurre l'ACN al 5% di riequilibrare la colonna per 9 min. Raccogliere 96 frazioni di pari volume in una piastra a 96 pozzetti (da A1 a H12). Monitorare il frazionamento utilizzando un rivelatore UV a 220 nm, mentre i peptidi sono eluizione largo della colonna (10-70 min per le condizioni qui descritte).
2. Combina frazioni da pozzi A1, C1, E1 e G1 (frazione A1), da pozzi B1, D1, F1, e H1 (frazione B1), da pozzi A2, C2, E2, e G2 (frazione A2) e di conseguenza per l' restanti frazioni. Rimuovere il solvent utilizzando una centrifuga a vuoto. Peptidi Risospendere da frazioni A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 e B12 in 130 ml di 1 M urea/0.5% TFA e purificare usando StageTips come descritto al punto 9. Negozio frazioni B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11 e A12 a -20 ° C.

9. Purify peptidi da Stop and Go estrazione (StageTips)

Preparare C18-StageTip ⁷ microcolonne da imballaggio 200 ml punte per pipette con due C18 dischi con un diametro interno (ID) di 1,07 mm. Mettere Fase Consigli in tubi Eppendorf. Utilizzare una microcentrifuga per lavare punte con 130 ml di metanolo, quindi 130 ul 80% ACN, 0,5% di acido acetico. Equilibrare StageTips con 130 microlitri 0,1% TFA. Trasferire la miscela di peptidi a StageTips e lavare con 130 microlitri 0,1% TFA, quindi 40 microlitri 0,1% TFA, quindi 40 microlitri 0,5% di acido acetico. Eluire peptidi prima con il 20 microlitri 40% ACN, 0,5% di acido acetico, poi 20 l 80% ACN, 0,5% di acido acetico. Combina eluati unnd secco mediante filtrazione sotto vuoto.

10. Microcapillare LC-MS/MS

1. Sciogliere peptidi in 1-5 ml di acido formico al 5%, 5% ACN ad una concentrazione di circa 1 mg / mL. Risolvere ~ 1 mg peptidi su un 100 pm × 20 cm C18-invertiti colonna HPLC in fase con gradiente 6-22% in ACN 0,125% acido formico ripartiti lungo 75 o 100 minuti ad una portata di ~ 300 Nl / min.
2. Identificare i peptidi utilizzando un LTQ Orbitrap Velos ¹² o simile piattaforma liquido cromatografia-spettrometria di massa con uno spettrometro di massa che preveda ad alta risoluzione ed elevata accuratezza di massa. Azionare lo spettrometro di massa in modalità dati-dipendente con un full MS scansione (risoluzione di 60.000), acquisita nel analizzatore Orbitrap. Generare trappola ionica lineare MS / MS spettri per i 20 ioni più abbondanti rilevati nello spettro completo di MS. Impostare il controllo automatico del guadagno (AGC) target a 1 x 10 ⁶ per la piena SM e 2000 per MS / MS. Impostare tempi massimi di accumulo di ioni a 1.000 msecper la SM e 150 msec per MS / MS. Escludi frammentate ioni peptide precursore di un'ulteriore selezione da MS / MS per 20-60 sec.

11. MS / MS Acquisizione Dati

Identificare peptidi confrontando file RAW spettri MS / MS ad un database teorico con un algoritmo come SEQUEST ⁸ utilizzando questi parametri (Tabella 1).

Tabella 1. Peptide ricerca database dei parametri.

Parametri generali	digestione completamente trittico con un massimo di 2 perdere fratture
	25 ppm tolleranza ione precursore
	1.0 Da tolleranza agli ioni frammento
Modifiche statici	57,02146 Da sulla cisteina, carboxyamidomethylation
	28,03130 Da sulla lisina e il peptide N-terminale, etichetta dimethylation luce
Modifiche dinamici	Da 15,99,491 mila su metionina, ossidazione
	6,03766 Da sulla lisina e il peptide N-terminale, etichetta dimethylation pesante

1. Filtra peptidi ad aliquote scoperta falso 1% con un metodo quale il ⁹ strategia target-richiamo utilizzando un database di open reading frames negli orientamenti attuali e invertiti.

12. Peptide Quantificazione

Calcolare le aree di coppie pesanti e leggeri di MS1 estratti ioni cromatogrammi (aree di picco MS1) e peptide segnale-rumore (S / N) Formati ^10. Includi coppie peptide solo quando il loro segnale medio-to-noirapporto se è superiore a cinque. Quantificare abbondanza relativa di un peptide nei due campioni come il rapporto delle aree dei picchi MS1 di versioni pesanti e leggere dello stesso peptide (MS1 rapporto dell'area di picco). Calcola abbondanze proteici relativamente come mediana rapporto area del picco MS1 per tutti i peptidi della proteina.

Risultati

Abbiamo valutato l'accuratezza, la precisione e riproducibilità di etichettatura Redi utilizzando Saccharomyces cerevisiae e Clostridium phytofermentans lisati cellulari interi. In primo luogo abbiamo quantificato l'efficienza etichettatura Redi di un mix di C. phytofermentans lisati proteici da cellulosa (pesante etichetta, H) e glucosio (etichetta luce, L) culture. Quando filtrato per un peptide tasso di scoperta di falsi 1%, questo campione conteneva 11.194 sequenze peptidiche unic...

Discussione

Numerosi punti fanno etichettatura isotopo stabile di peptidi utilizzando un metodo interessante per la proteomica quantitativa dimethylation riduttiva (etichettatura Redi): reagenti poco costosi di etichettatura (reagenti costano meno di $ 1 per esempio), velocità di reazione rapida (~ 10 min), assenza di prodotti collaterali, alte riproducibilità (figure 3, 4), prodotti di reazione stabili, capacità di utilizzare qualsiasi proteasi e ad alta efficienza di ionizzazione dei peptidi marcati. Etichetta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	protein precipitation
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71736	denature, reduce protein
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	denature, reduce protein
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125	alkylate protein
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	resuspend, extract, label protein
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	resuspend protein
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	protein digestion
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	protein digestion
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	protein digestion
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537	Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges	Waters	WAT054960	Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifold	Waters	WAT200609	Reversed-phase peptide extraction
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	14261	various
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	“light” peptide labeling
Cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	“light” peptide labeling
Deuterated formaldehyde	Sigma-Aldrich	492620	“heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuteride	CDN isotopes	D-1797	“heavy” peptide labeling
MES	Sigma-Aldrich	M3671	peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size)	Agilent	770450-902	basic pH reversed-phase chromatography
Formic acid	Sigma-Aldrich	399388	various
C18 Empore Disks	3M	14-386-3	STAGE tips
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE tips