Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Özet

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi tabanlı nicel Proteomikte için hızlı, ucuz bir stratejidir. Burada, hemen hemen her tür örnek uygulanabilir Redi yaklaşım kullanılarak protein karışımlarının hazırlanması ve analizi için güçlü bir yöntem ortaya koymaktadır.

Özet

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi kullanılarak örnekler arasında protein ekspresyon farklılıkları ölçmek için bir yöntemdir. Redi etiketleme her bir serbest amin için iki metil grubu eklemek için düzenli olarak (ışık) veya formaldehid ve sodyum siyanoborohidrid döteryumlanmış (ağır) formları kullanılarak gerçekleştirilir. Burada Redi etiketleme ve kompleks protein karışımları kantitatif karşılaştırılması için sağlam bir protokol göstermektedir. Karşılaştırma için Protein örnekleri hafif ya da ağır metil etiketler, karıştırılmış ve LC-MS/MS ile ko-analiz ya da taşımak için etiketli peptidler içine sindirilir. Bağıl protein bolluğu tam MS spektrumları elde oluşturucu peptidin ağır ve hafif olarak işaretlenmiş versiyonlarının iyon kromatogram tepe alanlarının karşılaştırılması ile nicelendirilir. Burada tarif edilen yöntem örnek ters-fazlı, katı faz ekstraksiyonu ile hazırlama, peptidlerin üzerinde kolon Redi etiketleme, bazik pH rev tarafından peptid içerir fraksiyonasyonersed faz (BPRP) kromatografi ve StageTip peptid saflaştırma. Biz kararlı izotop birleşme için diğer yöntemlere göre Redi etiketleme avantajları ve sınırlamaları tartışmak. Biz örnek hemen hemen her tür protein zengindi karşılaştırmak için, hızlı, ucuz ve doğru yöntem olarak Redi etiketleme kullanarak yeni uygulamalarını vurgulayın.

Giriş

Karmaşık numuneler arasında birçok proteinin konsantrasyonu farklılıklarını ölçme proteomikteki merkezi bir sorundur. Giderek, bu farklı izotopik etiketler, her numune proteinlerin etiketleme örnekleri birleştirilmesi ve konsantrasyon farkları ölçmek için kütle spektrometresi kullanılarak yapılmaktadır. Çeşitli yöntemler, protein ve peptid kararlı izotopik etiketleme için vardır. ICAT ^{3, 4} iTRAQ ve indirgeme dimetilasyonu ⁵ protein ekstraksiyonu ve sindirim sonra izotop etiketleri ekleme ise ¹⁵ N etiketleme ¹ ve SILAC ^2, in vivo olarak metabolik izotopik etiketler tanıtmak. Bu yöntemler arasında, indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) numune hemen hemen her tür protein konsantrasyonu farklılıkları ölçmek için ucuz, tekrarlanabilir bir yöntem olarak popülerlik kazanıyor.

Redi etiketleme düşürülür bir Schiff bazı oluşturmak üzere formaldehit ile reaksiyona sokulmasını içerir peptidlerisiyanoborohidrit. Bu reaksiyon, N-termini ve lisin yan zincirleri ve monomethylates N-terminal prolinler on serbest amino grupları dimethylates. Burada açıklanan protokol döteryumlu formaldehit ve siyanoborohidrit (Şekil 1) kullanılarak bir "ağır" etiketli doğal izotopik dağıtım ve örnek 2 hidrojen atomuna sahip reaktifler kullanılarak bir "ışık" etiketi ile örnek 1 'de peptidler metile. Işık ve bir kütle spektrometresi kullanılarak, iki form arasında ayırt etmek için kullanılır ağır biçimleri arasında, 6,0377 Da'lık bir kütle farkı, bir peptit sonuçlarına her dimetile amino grubudur. Özel olarak, nispi bolluk peptid ışığın MS1 ​​ekstre iyon kromatogram alanlarında oranında (MS1 alan doruk olan oranı) ve her bir peptit iyon çifti için ağır bir versiyonu olarak nicelendirilir. Bir proteinin nispi bolluk, proteinin tüm peptidler arasında orta MS1 tepe alanı oranı olarak hesaplanır. Bu yazıda, davranış için sağlam bir protokol açıklarters-faz peptid katı faz ekstraksiyonu, kolon Redi etiketleme, peptid fraksiyonasyon bazik pH fazı (BPRP) kromatografi tersine ve StageTips kullanarak peptid karışımları saflaştırılmasını (Şekil 2) içerir LC-MS/MS ile Redi etiketleme deneyleri ing . Biz kantitatif Proteomikte için Redi etiketleme kullanmanın avantajları ve sınırlamaları tartışmak.

Protokol

NOT: Bu yöntem daha önce ¹² tarif edilmiştir.

1.. Protein İzolasyonu

Tercihen, French pres, boncuk dayak veya sonikasyon gibi fiziksel yöntemlerle, yokedici hücreler tarafından hücre protein 1 mg hazırlayın. Enzim kütle spektrometresi ölçümleri bulandırabilir çünkü lizozim-aracılı hücre parçalanmasını önlemek.

Proteinlerin 2. TCA Yağış

Proteinlerini çöktürmek için 10 dakika süre ile buz üzerinde 4 hacim protein ve soğuk 1 hacim trikloroasetik asit (TCA) ilave edin. Santrifüj, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 12,000 x g ve supernatant çıkarın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 12,000 xg'de buz soğukluğunda aseton ve santrifüj 1 ml pelletini Süpernatantı ve 15 dakika boyunca pelet kurumaya bankta tüp ters. -80 ° C'de saklayın protein granül

3.. Doğasını Proteinler ve disülfıt bağlarını azaltır

Reproteinler askıya 500 ul denatürasyon ve indirgeme tamponu içinde ~ 2 mg / ml (50 mM HEPES pH 8.5, 5 mM DTT, 4 M üre ya da 3 ya da% SDS) için. İsteğe bağlı olarak, tampon maddesi içinde bir proteaz inhibitörü içerir. Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile 56 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin proteinleri.

4. Aklylate Ücretsiz Sülfhidril Gruplar geri dönüşü olmayan disülfit bağ oluşumu bozacak

Taze su içinde 0.3 M iodoasetamid hazırlayın. DİKKAT! Iodoacetamide son derece zehirlidir. 500 ul protein için 25 ul 0.3 M iodoasetamid (15 mM nihai konsantrasyon) ilave edin ve oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. 300 mM DTT (5 mM DTT nihai konsantrasyon) ve 10 ul kadar iyodoasetamid eklenerek söndürülür. -80 ° C'de saklayın alkile proteinleri

5.. Protein Sindirim

TCA proteinleri çökeltmek (aşama 2'de tarif edildiği gibi) ve 50 mM HEPES (pH 8.2), 1 ml, 1 M üre içinde tekrar süspansiyon. Lisil endoprotein bir stok solüsyonu hazırlayın2 ug / ul 'lik bir konsantrasyonda ve protein solüsyonuna 5 ul ekle suda ase (Lys-C). Oda sıcaklığında 16 saat boyunca karışımın inkübe edin. Nihai Lys-C konsantrasyonu, 10 ng / ml ve protein-to-lysC oranı (a / a) 1/200 ile 1/50 olduğu olduğundan emin olun. , 50 mM asetik asit, 40 ul içinde 20 ug tripsin dizileme gradlı yeniden süspanse Lys-C ile sindirilmiş 5 ul (10 ug tripsin) ekleyin ve 37 ° C de 6 saat inkübe Tripsin için kullanıldığı gibi Lys-C için aynı proteaz konsantrasyon ve proteaz-to-protein oranları kullanın.

6.. Ters-faz peptid Ekstraksiyon

1. % 0.5 'lik bir nihai konsantrasyona (pH ≈ 2), trifluoroasetik asit (TFA) eklenmesi ile peptidleri asitlendirilir. Bir ekstre manifolduna Bir C 18 sütunu takın. Peptidlerin yükleme ve elüsyon dışında tüm adımlar için mümkün olan en yüksek akış hızı kullanın.
2. 6 ml asetonitril (ACN) ile ıslak kolon. 6 ml% 80 ACN,% 0.1 TFA ile kolondan yıkanır, daha sonra 6 ml% 0.1 TFA ile dengeye getirin. Izin vermeyinadımlar arasında kuru çalıştırmak için sütun.
3. Vakum basıncı durdurmak ve yaklaşık olarak 1 ml / dk 'lık bir akış hızında kolona 500 ug peptidlerin yükleyin. Peptidler, kolon, yeniden vakum bağlanmıştır ve sonra, (0.09 M sitrik asit, 0.23 M Na ₂ HPO _4, pH 5.5), sitrik asit tamponu, 3 ml ile, 6 ml% 0.1 TFA ile yıkayınız sonra.
   Not: Yüksek miktarda etiketli peptid edilebilir, ancak bağlama kapasitesi C18 kolon, en azından örnek kaybını önlemek için peptid miktarına göre iki kat daha yüksek olması gerekir.

7. On-kolonu İndirgemeli dimetilasyonu tarafından Peptit Etiketleme (Redi Etiketleme)

Hidrojen siyanür Etiketleme işlemi sırasında düşük bir konsantrasyonda serbest olarak kimyasal bir başlık altında bu adımı gerçekleştirin.

1. Peptid serbest aminler metillenmesi "hafif" ve "ağır" Redi tampon 12 ml hazırlayın. Işık Redi tamponu% 0.8 formaldehit ve inci hidrojeni taşıyan 0.12 M sodyumsiyanoborhidrid oluşursitrik asit tampon maddesi içinde EIR doğal izotopik dağılımları. Ağır Redi tamponu% 0.8 döteryumlu formaldehit ve sitrik asit tampon maddesi içinde 0.12 M döteryumlu sodyum siyanoborohidrid oluşur.
2. 1 ml / dakika akış hızında, peptid ihtiva eden sütunlar 10 ml hafif ya da ağır Redi tampon ya da eklenmesi ile peptidleri ihtiva eden bir sütun inkübe edin ve tam etiketleme sağlamak için tekrarlayın. Yıkama 6 ml% 0.1 TFA ile kolon ve daha sonra 1 ml% 0.5 asetik asit ile.
3. Vakum durdurmak ve yaklaşık olarak 0.5 ml / dk 'lık bir akış oranı kullanılarak, daha sonra 1 ml% 80 ACN ile% 0.5 asetik asit 1 ml% 40 ACN,% 0.5 asetik asit ile ilk işaretli peptidlerin elüsyonu. Eğer istenirse, ağır ve hafif örnekler karıştırma önce kütle spektrometresi ile bireysel örneklerin etiketleme verimliliği ölçmek ("Temsilci Sonuçları" bakın). Kütle spektrometresi ile belirlenebilir 1:1 ağır ve hafif-etiketli peptid örnekleri karıştırın.

Temel pH Ters Faz (BPRP) kromatografi <8. Ayrı Peptide Karışım/ P>

Temel pH bağımsız bir şekilde, proteom kapsamını arttırmak için LC-MS/MS ile analiz edilir çok sayıda kısmın içine peptid karışımını ayırmak için aşama (BPRP) kromatografisi.

1. 10 mM amonyum bikarbonat (pH 8) içinde artan ACN konsantrasyon gradyanı uygulanarak bir C18-HPLC kolonu üzerinde peptit karışımının fraksiyonlanması. 5 dakika için% 5 (v / v) ACN ile başlayın, 60 dakika içinde,% 35 ACN artması ve daha sonra 1 dakika içinde% 90 ACN. 9 dakika boyunca yeniden dengeye sütun için% 5 ACN indirgeme önce, 4 dakika boyunca% 90 ACN saklayın. 96 oyuklu bir plaka (H12 için A1) eşit hacimde 96 fraksiyonları toplayın. Peptidler kolonu (burada tarif edilen koşullar için 10-70 dakika) kapalı elüsyon ise 220 nm'de bir UV detektör kullanılarak fraksiyonasyon izleyin.
2. Kuyu A2, C2, E2, ve G2 (fraksiyon A2) için ve buna bağlı olarak için, kuyular, B1, D1, F1 ve H1 (fraksiyon B1) için, kuyu A1, C1, E1 ve G1 (fraksiyon A1) ikinci kısımları birleştiriniz Geri kalan kısımlar. Solvent çıkarınbir vakum santrifüj kullanılarak t. Fraksiyonlardan peptitler tekrar A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 ve B12 1 M urea/0.5% TFA 130 ul ve aşama 9'da tarif edildiği gibi StageTips kullanılarak arındırmak. Mağazası fraksiyonlar B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, ve -20 ° C de A12

9. Stop and Go Ekstraksiyon tarafından Arındırmak peptidler (StageTips)

1.07 mm iç çapı (ID) ile iki C18 diskler ile 200 ul pipet uçları ambalaj ile C18-StageTip ⁷ microcolumns hazırlayın. Eppendorf tüpleri içine Sahne ipuçları koydu. 130 | il metanol, daha sonra 130 ul% 80 ACN,% 0.5 asetik asit ile ipuçları yıkamak için, bir mikro santrifüj kullanın. 130 ul% 0.1 TFA ile StageTips dengelenmesi. StageTips peptit karışımı aktarın ve 40 ul,% 0.5 asetik asit, daha sonra 40 ul% 0.1 TFA, daha sonra 130 ul% 0.1 TFA ile yıkayın. 20 ul% 40 ACN,% 0.5 asetik asit, daha sonra 20 ul% 80 ACN,% 0.5 asetik asit ile ilk Peptidlerin elüsyonu. Kombine eluatlar and vakumla süzme ile kuru.

10. Microcapillary LC-MS/MS

1. , Yaklaşık 1 ug / ul 'lik bir konsantrasyona 1-5 ul,% 5 formik asit,% 5 ACN peptitler çözülür. On ~ 1 ug peptidler gidermek bir 100 um x C18-ters 0.125% formik asit içinde% 6-22 ACN gradyanı ile faz HPLC kolonu ~ 300 nl / dk 'lık bir akış oranında, 75 veya 100 dakikalık bir süre içinde tatbik 20 cm.
2. Bir LTQ Orbitrap Velos ¹² veya kütle spektrometresi, yüksek çözünürlük ve yüksek kütle doğruluğu sağlayarak benzer sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi platformunu kullanarak peptidler tanımlayın. Orbitrap analizörü edinilen tam bir MS tarama (60.000 çözünürlük) ile veri-bağımlı modunda kütle spektrometresi çalıştırın. Tam MS spektrum tespit 20 en bol bulunan iyonlar için lineer iyon kapanı MS / MS spektrumunu üretir. MS / MS için 1 x 10 tam MS için ⁶ ve 2000 için otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefleri ayarlayın. 1000 msn maksimum iyon birikimi kez ayarlayabilirsinizMS ve MS / MS için 150 msn için. 20-60 sn MS / MS uzak seçimden parçalanmış peptid öncüsü iyonları dışlamak.

11. MS / MS Veri Toplama

Bu parametreleri (Tablo 1) kullanılarak bu SEQUEST ⁸ gibi bir algoritma ile bir teorik veritabanı MS / MS spektrumları RAW dosyaları karşılaştırarak peptidler tanımlamak.

Tablo 1. Peptit Veritabanı Arama Parametreleri.

Genel Parametreler	kadar 2 ile tam triptik sindirim bölünmelere kaçırdı
	25 ppm öncül iyon tolerans
	1.0 Da fragman iyonu tolerans
Statik Değişiklikler	Sistein, carboxyamidomethylation üzerinde 57,02146 Da
	Lisin ve peptid N-terminalinde on 28,03130 Da, hafif dimetilasyonu etiket
Dinamik Değişiklikler	Metiyonin, oksidasyonu üzerindeki 15,99491 Da
	Lisin ve peptid N-terminalinde, ağır dimetilasyonu etikette 6,03766 Da

1. Fiili ve ters yönlerde açık okuma çerçevelerinin bir veri tabanı kullanılarak bu tür hedef yem ⁹ strateji olarak bir yöntem ile,% 1 yanlış keşif oranına filtre peptidler.

12. Peptide Kantitasyonu

Hesaplayın MS1 ağır ve hafif çiftlerinin alanlar iyon kromatogramları (MS1 pik alanları) ekstre edilmiş ve peptid sinyal-gürültü (S / N) oranları ^10. Peptid çiftleri içerir yalnızca onların ortalama sinyal-noise oranı beş üzerindedir. Aynı peptid (MS1 tepe alanı oranı) ağır ve hafif versiyonlarının MS1 ​​pik alanlarının oranı olarak, iki örnekteki nispi bir peptidin bolluk ölçmek. Proteinin tüm peptidler için ortalama MS1 tepe alanı oranı olarak görece protein zengindi hesaplayın.

Sonuçlar

Biz Saccharomyces cerevisiae kullanılarak doğruluk, kesinlik ve Redi etiketleme tekrarlanabilirliği değerlendirildi ve Clostridium tüm hücre lizatlarını phytofermentans. Önce C bir karışımı Redi etiketleme verimliliği sayılabilir selüloz (ağır etiketli, H) ve glukoz (açık etiketli, L) kültürler protein lizatları phytofermentans. Bir% 1 peptit yanlış keşif orana süzüldü, bu örnek, bir% 98 verimle Redi etiketleme 11194 benzersiz peptid dizilerini i...

Tartışmalar

Yüksek ucuz etiketleme reaktifleri (reaktif numune başına 1 dolardan daha az maliyeti), hızlı reaksiyon hızı (~ 10 dk), yan ürünlerin yokluğu: Birkaç puan nicel Proteomikte için cazip bir yöntem indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) kullanılarak peptidlerin kararlı izotop etiketleme yapmak tekrarlanabilirliği (Şekil 3, 4), sabit reaksiyon ürünleri, bir proteaz kullanma yeteneği ve işaretli peptidlerin yüksek iyonlaşma verim. Bir sentetik ortam üzerinde spesifik amino asit o...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	protein precipitation
Acetone	Sigma-Aldrich	650501	protein precipitation
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71736	denature, reduce protein
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045	denature, reduce protein
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	43816	denature, reduce, alkylate protein
Protease Inhibitor Complete Mini Cocktail	Roche	4693124001	denature, reduce protein
Iodoacetamide	Sigma-Aldrich	I6125	alkylate protein
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	resuspend, extract, label protein
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670	resuspend protein
Lysyl Endoprotease	Wako Chemicals	129-02541	protein digestion
Sequencing grade trypsin	Promega	V5111	protein digestion
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	protein digestion
Trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	299537	Reversed-phase peptide extraction
tC18 Sep-Pak C18 cartridges	Waters	WAT054960	Reversed-phase peptide extraction
Extraction manifold	Waters	WAT200609	Reversed-phase peptide extraction
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	14261	various
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	“light” peptide labeling
Cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	“light” peptide labeling
Deuterated formaldehyde	Sigma-Aldrich	492620	“heavy” peptide labeling
Sodium cyanoborodeuteride	CDN isotopes	D-1797	“heavy” peptide labeling
MES	Sigma-Aldrich	M3671	peptide labeling
C18-HPLC column (4.6 x 250 mm, 5 µm particle size)	Agilent	770450-902	basic pH reversed-phase chromatography
Formic acid	Sigma-Aldrich	399388	various
C18 Empore Disks	3M	14-386-3	STAGE tips
Methanol	Sigma-Aldrich	494437	STAGE tips