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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe translocación nuclear activada por luz de huéspedes en las células vivas utilizando etiquetas enjaulado pegamento molecular. Este método es prometedor para la entrega de drogas dirigidas a nuclear sitio selectivo.

Resumen

El núcleo es uno de los orgánulos más importantes como objetivo subcelular-administración de fármacos, desde la modulación de la replicación de genes y expresión es eficaz para tratar diversas enfermedades. Aquí, demostramos enjaulado de translocación nuclear activada por la luz de los huéspedes que utilicen etiquetas pegamento molecular (enjauladopegamento-R), cuyos múltiples colgantes de ion (Gu+) Guanidinio están protegidos por un grupo de photocleavable aniónico (butirato-sustituido nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Los huéspedes etiquetados Cagedpegamento-R se toman en la vida las células mediante endocitosis y permanecer en endosomas. Sin embargo, en photoirradiation, Cagedpegamento-R se convierte en uncaged molecular pegamento (pegamento deUncaged-R) llevar varios colgantes de Gu+ , que facilita el escape endosomal y la subsecuente translocación nuclear de los invitados. Este método es prometedor para selectivo sitio nuclear contra entrega de la droga, ya que los invitados etiquetados pueden migrar en el citoplasma, seguido por el núcleo celular sólo cuando photoirradiated. Enjaulado Etiquetas cola-R pueden ofrecer a invitados macromoleculares como puntos cuánticos (QDs) así como huéspedes de moléculas pequeñas. Enjaulado Etiquetas cola-R pueden ser uncaged con luz UV, pero también dos fotones (NIR) la luz infrarroja, que puede penetrar profundamente en el tejido.

Introducción

El núcleo de la célula, que lleva la información genética, es uno de los orgánulos más importantes como objetivo subcelular-administración de fármacos, desde la modulación de la replicación de genes y expresión es eficaz para el tratamiento de varias enfermedades incluyendo el cáncer y genética trastornos1,2,3. Para nuclear entrega de medicamentos, Conjugación de péptidos etiquetas tales como localización nuclear (NLS) de señales4,5,6 ha sido ampliamente investigada. Sin embargo, para reducir efectos colaterales no deseados, es necesario el control espacio-temporal de la translocación nuclear.

Previamente, activadas por luz desplazamiento de proteínas en el núcleo celular se ha logrado utilizando jaulas NLS7,8,9. NLS emigra en el núcleo de la célula atando a transporte citoplásmico proteínas6. En los métodos divulgados, proteínas huésped teniendo enjaulados NLS directamente incorporadas en el citoplasma por microinyección8 o expresadas en las células diana mediante un código genético expansión técnica9. Por lo tanto, un método que puede lograr la absorción celular y translocación nuclear foto-inducida es ventajoso para aplicaciones prácticas.

Adjunto, describimos desplazamiento nuclear activada por la luz de los huéspedes en las células vivas utilizando etiquetas dendríticas pegamento molecular enjaulado (Cagedpegamento-R, figura 1). Pega molecular solubles en agua10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 cojinete varios colgantes de Gu+ se han desarrollado anteriormente que se adhieren firmemente a proteínas11,12,13,14,15, 16,17, los ácidos nucleic18,19,20, fosfolípido de las membranas21y arcilla nanosheets22,23 a través de la formación de múltiples puentes de sal entre sus colgantes de Gu+ y grupos oxyanionic en los objetivos. Los colgantes de Gu+ de Cagedpegamento-R están protegidos por un grupo de photocleavable aniónico, nitroveratryloxycarbonyl butirato-sustituido (BANVOC). Los huéspedes etiquetados Cagedpegamento-R se toman en la vida de las células mediante endocitosis y estancia en endosomas (figura 2). En photoirradiation, los grupos NVOC BAde Cagedpegamento-R son despegados para rendir un uncaged molecular pegamento (pegamento deUncaged-R) llevar varios colgantes de Gu+ , que luego facilita la migración de la huésped de etiquetado en el citoplasma, seguido por el núcleo de la célula (figura 2). La etiqueta de Cagedpegamento-R puede ser uncaged por la exposición a UV o dos fotones la luz de infrarrojo cercano (NIR) sin fototoxicidad grave. Demostramos la entrega nuclear spatiotemporally controlada de huéspedes macromoleculares como los huéspedes de molécula pequeña con las etiquetas de cola-R Caged, usando puntos cuánticos (QDs) y un colorante fluorescente (nitrobenzoxadiazole; Al siguiente día laborable), respectivamente, como ejemplos.

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Figura 1: Estructuras esquemáticas del Cagedpegamento-R. Los colgantes de ion (Gu+) Guanidinio 9 de Cagedpegamento-R están protegidos por un grupo de nitroveratryloxycarbonyl butirato-sustituido (BANVOC). Los grupos NVOC BAson troceados por la irradiación con UV o luz NIR dos fotones. El núcleo focal de Cagedpegamento-R es functionalized con nitrobenzoxadiazole (NBD) o dibenzocylooctyne (DBCO). Reimpreso con el permiso de referencia20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Ilustración esquemática de translocación nuclear activada por la luz de los huéspedes conjugado con una etiqueta de Cagedpegamento-R. El invitado /Cagedconjugado de pegamento-R es tomado en la vida de las células mediante endocitosis. En photoirradiation, el Cagedpegamento-R es uncaged para obtener una etiqueta de pegamento-R Uncaged, que puede facilitar el escape endosomal de la huésped de etiquetado. Posteriormente, el huésped etiquetado emigra en el núcleo celular. Reimpreso con el permiso de referencia20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

1. preparación de los huéspedes con pegamento-R enjauladoclave

  1. Preparar la solución de pegamento-NBD Caged.
    1. Sintetizar el Cagedpegamento-NBD (figura 1) siguiendo los procedimientos previamente descritos20.
    2. Preparar una solución stock de Cagedpegamento-al siguiente día laborable (10 mM) en seco de dimetilsulfóxido (DMSO).
      Nota: Almacene la solución en oscuridad. La solución puede diluirse con buffers acuosos o medios de cultivo celular en uso.
  2. Preparar la solución de pegamento-QD Caged.
    1. Sintetizar Cagedpegamento-dibenzocylooctyne (Cagedpegamento-DBCO) (figura 1) siguiendo los procedimientos anteriormente descritos20.
    2. Preparar una solución stock de Cagedpegamento-DBCO (10 mM) en DMSO seco.
    3. Para la preparación de Cagedpegamento-QD, primero preparar QDs funcionalizados azida (azida-QD; Figura 3). Añadir 100 μl de una solución de dimetil formamida (DMF, 125 μm) de azida-PEG4-NHS éster (figura 3) a 400 μL de un DMF (500 nM) solución de puntos cuánticos (QDs) con PEG funcionalizados de Amina (amina-QD; Figura 3). Removemos la mezcla durante 1 hora a temperatura ambiente.
    4. Dializan la solución resultante para 24 h contra 800 mL de DMF usando una membrana de celulosa regenerada con 3.500 corte de peso molecular (MWCO).
    5. Diluir la solución madre de Cagedpegamento-DBCO a 50 μm con DMF. Añadir 200 μL de la solución a la solución de diálisis posterior (figura 3) y removemos la mezcla durante 3 horas a temperatura ambiente.
    6. Dializan la solución resultante para 24 h contra 800 mL de DMF usando una membrana de celulosa regenerada (25.000 MWCO).
    7. Diluir la solución resultante a 200 nM con DMF.

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Figura 3: ilustración esquemática de la preparación de Cagedpegamento-QD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. preparación de muestra de células Hep3B para observaciones microscópicas

  1. Mantener las células del carcinoma Hep3B hepatocelular humano en mínimo medio esencial del águila (EMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C debajo del 5% CO2.
  2. Las células de la semilla el día antes del experimento. Células de3 Hep3B semilla 5.0 × 10 por bien de un sustrato de vidrio de 8 cámaras en EMEM (10% FBS, 200 μL) e incubar la muestra de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 24 h.
  3. Retire el medio de cultivo y enjuague dos veces la muestra de células con 100 μl de una solución salina fosfato buffer de Dulbecco (D-PBS).

3. observación de la translocación Nuclear de los huéspedes de molécula pequeña accionada por la luz UV

  1. Suministrar la muestra de células (preparado en paso 2.3) con 200 μL de EMEM FBS-libre que contiene pegamento Caged-NBD (10 μm) e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 3 horas.
    Nota: La incubación de la muestra de células en EMEM FBS-libre por más de 4 h causa daño celular grave.
  2. Quite el medio de cultivo y enjuague la muestra de células con 100 μl de PBS D dos veces.
  3. Para la visualización de los endosomas, fuente de la muestra de células con 200 μL de EMEM (10% SBF) que contienen un tinte rojo fluorescente (p. ej., LysoTracker rojo, 100 nM) e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 20 min Quite la cultura medio y enjuagar la muestra de células con 100 μl de PBS D dos veces. La celda muestra con 200 μL de EMEM (10% FBS).
  4. Para la translocación nuclear de Cagedpegamento-NBD, exponer la muestra de células a la luz de 2 minutos a través de una fibra óptica con una fuente de luz de xenon 100 W equipada con un filtro de paso de banda 365 nm UV. Para una muestra de células de referencia sin exposición a UV, mantener la muestra de células en oscuridad.
    Nota: La tapa de los substratos de cristal puede quitarse para eficiente exposición Ultravioleta. Desde hace mucho tiempo exposición a la luz UV puede causar citotoxicidad a las células.
  5. Para la visualización de los núcleos, añadir 1 μl de Hoechst 33342 (1 mg/mL) al medio de cultivo e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 10 minutos.
  6. Someter la muestra de células para la microscopía de láser confocal y grabar las micrografías en excitación a 488 nm (λobs = 500-530 nm), 543 nm (λobs = 565-620 nm) y 710 nm (dos fotones; Λ OBS = 390 465 nm) para el NBD, tinte rojo fluorescente y Hoechst 33342, respectivamente.

4. observación de translocación Nuclear de los huéspedes de molécula pequeña por NIR dos fotones de luz

  1. Suministrar la muestra de células (preparado en paso 2.3) con 200 μL de EMEM FBS-libre que contiene pegamento Caged-NBD (10 μm) e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 3 horas.
  2. Quite el medio de cultivo y enjuague la muestra de células con 100 μl de PBS D dos veces. La celda muestra con 200 μL de EMEM (10% FBS).
  3. Someter la muestra de células para la microscopía de láser confocal y grabar las micrografías en excitación a 488 nm (λobs = 500-530 nm).
  4. Para la translocación nuclear de Cagedpegamento-NBD, irradiar la región incluyendo la célula de interés con un láser de excitación de dos fotones (710 nm), instalada como una fuente de luz en el microscopio, por 2 min (30 s × 4). Observar el desplazamiento como se describe en el paso 4.3.

5. observación de la translocación Nuclear de huéspedes Macromolecular accionado por la luz UV

  1. Suministrar la muestra de células (preparado en paso 2.3) con 200 μL de EMEM FBS-libre que contiene pegamento Caged-QD (10 nM) e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 3 horas.
  2. Quite el medio de cultivo y enjuague la muestra de células con 100 μl de PBS D dos veces. La celda muestra con 200 μL de EMEM (10% FBS).
  3. Para la translocación nuclear de Cagedpegamento-QD, exponer la muestra de células a la luz de 2 minutos a través de una fibra óptica con una fuente de luz de xenon 100 W equipada con un filtro de paso de banda 365 nm UV. Para una muestra de células de referencia sin exposición a UV, mantener la muestra de células en oscuridad.
  4. Para la visualización de los núcleos, añadir 1 μl de Hoechst 33342 (1 mg/mL) al medio de cultivo e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 10 minutos.
  5. Someter la muestra de células para la microscopía de láser confocal y grabar las micrografías en excitación a 405 nm (λobs = 430-520 nm) y 488 nm (λobs = 625-680 nm) para Hoechst 33342 y QDs, respectivamente.

6. Análisis de viabilidad de la célula

  1. Mantener humano hepatocelular carcinoma Hep3B células en EMEM (10% SBF) a 37 ° C debajo del 5% CO2.
  2. Las células de la semilla el día antes del experimento. Células de3 Hep3B semilla 5.0 × 10 por pozo de una placa de cultivo de 96 pozos en EMEM (10% FBS, 200 μL) e incubar la muestra de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 24 h.
  3. Quite el medio de cultivo y enjuague la muestra de células con 100 μl de PBS D dos veces.
  4. La célula muestra con 200 μL de EMEM FBS-libre que contiene pegamento Caged-NBD (0.1-100 μm) e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% de CO2 durante 3 horas.
  5. Exponer la muestra de células a la luz UV por 2 minutos a través de una fibra óptica con una fuente de luz de xenon 100 W equipada con un filtro de paso de banda 365 nm. Para una muestra de células análogo sin exposición a UV, mantener la muestra de células en oscuridad.
  6. Añadir 10 μl de reactivo (10 μl) de la célula contando Kit-8 al medio de cultivo e incubar la muestra resultante de células a 37 ° C debajo del 5% CO2 h 2.
  7. Sujetos de la muestra de células para espectroscopia de absorción (λ = 450 nm) usando un lector de microplacas.

Resultados

Antes de photoirradiation, células Hep3B incubadas con Cagedpegamento-NBD exhibieron emisión de fluorescencia punteado desde su interior (λext = 488 nm; Figuras 4A y 4C, verde). Una micrografía análogo se obtuvo con excitación a 543 nm para el rojo fluorescente tinte (figuras 4B y 4C, rojo), indicando que el Cagedpegamento-NBD localizada en los endosomas. E...

Discusión

Investigaciones anteriores de activadas por luz desplazamiento de proteínas en el núcleo celular se han logrado utilizando jaulas NLS7,8,9. Como se mencionó anteriormente, estos métodos requieren técnicas adicionales para incorporar las proteínas etiquetadas de NLS en el citoplasma. En cambio, nuestra etiqueta de pegamento-R Cagedpermite la translocación nuclear foto-inducida, sino también la absorción celula...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Reconocemos el centro para la integración de NanoBio, la Universidad de Tokio. Este trabajo fue apoyado por subvenciones para jóvenes científicos (B) (26810046) K.O. y parcialmente financiado por subvenciones de investigación promovido especialmente (25000005) a T.A. R.M. gracias la becas de investigación de la sociedad de Japón para la promoción de la ciencia (JSPS ) para jóvenes científicos y el programa de líderes en las escuelas de posgrado (GPLLI).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Azide-PEG4-NHS esterClick Chemistry ToolsAZ103
Q-dot 655 ITKInvitrogenQ21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)NIPPON GeneticsTOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)Harvard Apparatus7425-RC25K
Hep3B CellsATCCHB-8064
8-chambered glass substrateNunc155411JP
96-well culture plateNunc167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)Thermo Fisher Scientific10370-021
Fetal bovine serum (FBS)GE HealthcareSH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)Wako Pure Chemical Industries045-29795
LysoTracker RedLonza WalkersvillePA-3015
Hoechst 33342DojindoH342
Cell Counting Kit-8DojindoCK04
Confocal laser scanning microscopeCarl-ZeissLSM 510Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscopeLeicaTCS SP8
Xenon light sourceAsahi SpectraLAX-102
Microplate readerMolecular DevicesSpectraMax Paradigm

Referencias

  1. Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
  2. Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
  3. Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
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  5. Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
  6. Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
  7. Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
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  9. Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
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  24. Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
  25. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  26. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

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