Spatiotemporally controllato traslocazione nucleare di ospiti in cellule viventi utilizzando colle molecolare in gabbia come tag fuse

Riepilogo

Questo protocollo descrive la traslocazione nucleare attivato luce di ospiti in cellule viventi utilizzando tag colla molecolare in gabbia. Questo metodo è promettente per il nucleare-targeting selettivo sito drug delivery.

Abstract

Il nucleo cellulare è uno degli organelli più importanti come obiettivo subcellulare della droga consegna, dalla modulazione della replica di gene ed espressione è efficace per il trattamento di varie malattie. Qui, dimostriamo che la traslocazione nucleare attivato luce degli ospiti usando in gabbia Tag colla molecolare (^Cagedcolla-R), cui più pendenti di guanidinium ione (Gu⁺) sono protetti da un gruppo di photocleavable anionici (butirrato-sostituiti nitroveratryloxycarbonyl; ^BA NVOC). Gli ospiti con etichettati ^Cagedcolla-R sono presi in vita le cellule tramite endocitosi e rimangono in endosomi. Tuttavia, al momento photoirradiation, ^Cagedcolla-R è convertito in uncaged molecolare colla (^Uncagedcolla-R) che trasportano più pendenti Gu⁺ , che facilita la fuga endosomal e conseguente traslocazione nucleare degli ospiti. Questo metodo è promettente per il nucleare-targeting selettivo sito drug delivery, poiché gli ospiti con tag possono migrare nel citoplasma seguito da nucleo cellulare solo quando photoirradiated. ^{In gabbia} Tag: colla-R in grado di fornire macromolecolari ospiti come punti quantici (QD) così come gli ospiti della piccolo-molecola. ^{In gabbia} Tag: colla-R può essere uncaged con non solo luce UV, ma anche luce di due fotoni vicino infrarosso (NIR), che possa penetrare in profondità nel tessuto.

Introduzione

Il nucleo delle cellule, che porta le informazioni genetiche, è uno degli organelli più importanti come obiettivo subcellulare della droga consegna, dalla modulazione della replica di gene ed espressione è efficace per il trattamento di varie malattie tra cui il cancro e genetica disordini di^1,2,3. Per consegna nucleare delle droghe, coniugazione di peptide tag come localizzazione nucleare (NLS) di segnali^4,5,6 è stato ampiamente studiato. Tuttavia, al fine di ridurre gli effetti collaterali indesiderati, controllo spazio-temporale della traslocazione nucleare è necessario.

In precedenza, ha attivato luce traslocazione delle proteine nel nucleo delle cellule è stato raggiunto utilizzando in gabbia NLS^7,8,9. NLS migra nel nucleo cellulare legandosi a proteine di trasporto citoplasmico⁶. Nei metodi segnalati, proteine ospite NLS in gabbia del cuscinetto sono direttamente incorporati nel citoplasma di microiniezione⁸ o espresso nelle celle di destinazione utilizzando un codice genetico espansione tecnica⁹. Pertanto, un metodo che si può raggiungere sia l'assorbimento cellulare e traslocazione nucleare foto-indotta è vantaggioso per applicazioni pratiche.

Qui, descriviamo la traslocazione nucleare attivato luce di ospiti in cellule viventi utilizzando tag dendritiche colla molecolare in gabbia (^Cagedcolla-R, Figura 1). Solubile in acqua molecolare Colle^{10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23} cuscinetto più pendenti Gu⁺ sono stati sviluppati in precedenza, cui aderiscono strettamente al proteine^{11,12,13,14,15, 16,17}, acidi nucleici^18,19,20, fosfolipide membrane²¹e argilla nanosheets^22,23 attraverso la Formazione di ponti più sale tra loro pendenti Gu⁺ e oxyanionic gruppi sugli obiettivi. I pendenti di Gu⁺ di ^Cagedcolla-R sono protetti da un gruppo di photocleavable anionici, nitroveratryloxycarbonyl butirrato-sostituiti (^BANVOC). Gli ospiti con etichettati ^Cagedcolla-R sono presi in vita le cellule tramite endocitosi e soggiorno in endosomi (Figura 2). Al momento photoirradiation, i gruppi NVOC ^BAdi ^Cagedcolla-R sono staccati per produrre una uncaged molecolare colla (^Uncagedcolla-R) che trasportano più pendenti Gu⁺ , che poi facilita la migrazione dell'ospite con tag nel citoplasma seguito dal nucleo della cellula (Figura 2). Il tag di colla-R ^Cagedpuò essere uncaged da esposizione a UV o due-fotone vicino infrarosso (NIR) luce senza serio fototossicità. Dimostriamo la consegna nucleare spatiotemporally controllata di ospiti macromolecolari, nonché ospiti della piccolo-molecola con ^CagedTag colla-R, utilizzando punti quantici (QD) ed un colorante fluorescente (nitrobenzoxadiazole; NBD), rispettivamente, come esempi.

Figura 1: Strutture schematiche di ^Cagedcolla-R. I pendenti di ioni (Gu⁺) guanidinium 9 ^Cagedcolla-r sono protetti da un gruppo di nitroveratryloxycarbonyl butirrato-sostituiti (^BANVOC). I gruppi NVOC ^BAsono spaccati da irradiazione con UV o luce di due fotoni NIR. Il nucleo focale della colla ^Caged-R è funzionalizzato con nitrobenzoxadiazole (NBD) o dibenzocylooctyne (DBCO). Ristampato con il permesso di riferimento²⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Illustrazione schematica della traslocazione nucleare attivato luce degli ospiti coniugato con un tag di ^Cagedcolla-R. L'ospite / coniugato colla-R^Cagedè ripreso in vita le cellule tramite endocitosi. Su photoirradiation, il tag di colla-R ^Cagedè uncaged cedere un tag colla-R ^Uncaged, che può facilitare la fuga endosomal dell'ospite con tag. Successivamente, l'ospite con tag migra nel nucleo cellulare. Ristampato con il permesso di riferimento²⁰. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

1. preparazione degli ospiti con ^gabbiacolla-R Tag

1. Preparare la soluzione di colla-NBD ^Caged.
   1. Sintetizzare ^Cagedcolla-NBD (Figura 1) seguendo le procedure precedentemente descritte²⁰.
   2. Preparare una soluzione stock di ^Cagedcolla-NBD (10 mM) a secco dimetilsolfossido (DMSO).
      Nota: Conservare la soluzione magazzino buio. La soluzione può essere diluita con amplificatori acquosi o terreni di coltura delle cellule al momento di utilizzo.
2. Preparare la soluzione di colla-QD ^Caged.
   1. Sintetizzare ^Cagedcolla-dibenzocylooctyne (^Cagedcolla-DBCO) (Figura 1) seguendo le procedure precedentemente descritte²⁰.
   2. Preparare una soluzione stock di ^Cagedcolla-DBCO (10 mM) in DMSO asciutto.
   3. Per la preparazione di colla ^Caged-QD, innanzitutto preparare azide-funzionalizzate QD (Azide-QD; Figura 3). Aggiungere 100 µ l di una soluzione di dimetil formammide (DMF, 125 µM) di azide-PEG4-NHS estere (Figura 3) a 400 µ l di un DMF (500 nM) soluzione di punti quantici (QD) rivestito con ammina-funzionalizzate PEG (ammina-QD; Figura 3). Mescolare il composto per 1 h a temperatura ambiente.
   4. Dializzare la soluzione risultante per 24 h contro 800 mL di DMF utilizzando una membrana di cellulosa rigenerata con 3.500 peso molecolare cut-off (MWCO).
   5. Diluire la soluzione madre di ^Cagedcolla-DBCO a 50 µM con DMF. Aggiungere 200 µ l della soluzione alla soluzione post-dialisi (Figura 3) e mescolare il composto per 3 ore a temperatura ambiente.
   6. Dializzare la soluzione risultante per 24 h contro 800 mL di DMF utilizzando una membrana di cellulosa rigenerata (25.000 MWCO).
   7. Diluire la soluzione risultante a 200 nM con DMF.

Figura 3: illustrazione schematica della preparazione della colla ^Caged-QD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. preparazione del campione di cellule di Hep3B per osservazioni al microscopio

1. Mantenere le cellule di Hep3B il carcinoma epatocellulare umano in medium essenziale minimo di Eagle (EMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS) a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂.
2. Le cellule del seme il giorno prima dell'esperimento. Seme 5.0 × 10³ Hep3B cellule per pozzetto di un substrato di vetro 8-camerato in EMEM (10% FBS, 200 µ l) e incubare il campione di cellule a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ per 24 h.
3. Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare il campione di cellule con 100 µ l di soluzione salina tampone di fosfato di Dulbecco (D-PBS) due volte.

3. osservazione della traslocazione nucleare di piccole molecole ospiti attivati dalla luce UV

1. Fornire il campione di cellule (preparato in passaggio 2.3) con 200 µ l di FBS-libero EMEM contenente ^Cagedcolla-NBD (10 µM) ed incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ per 3 h.
   Nota: Incubazione del campione delle cellule in EMEM FBS-libero per più di 4 h provoca danni gravi delle cellule.
2. Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare il campione di cellule con 100 µ l di D-PBS due volte.
3. Per la visualizzazione degli endosomi, fornire il campione di cellule con 200 µ l di EMEM (10% FBS) contenente un colorante rosso fluorescente (ad es., LysoTracker rosso, 100 nM) e incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ per 20 minuti rimuovere la cultura medio e sciacquare il campione di cellule con 100 µ l di D-PBS due volte. Fornire il campione di cellule con 200 µ l di EMEM (10% FBS).
4. Per traslocazione nucleare di ^Cagedcolla-NBD, esporre il campione di cellule ai raggi UV per 2 min tramite una fibra ottica utilizzando una sorgente di luce allo xeno 100-W dotata di filtro passa-banda 365 nm. Per un esempio di cella di riferimento senza esposizione ai raggi UV, conservare il campione di cellule buio.
   Nota: Il coperchio dei substrati di vetro può essere tolto per efficiente esposizione ai raggi UV. Lunga esposizione ai raggi UV può causare citotossicità per le cellule.
5. Per la visualizzazione dei nuclei, aggiungere 1 µ l di Hoechst 33342 (1 mg/mL) al terreno di coltura e incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ per 10 min.
6. Sottoporre il campione di cellule per microscopia a scansione laser confocale e registrare le micrografie eccitazione a 488 nm (λ_obs = 500-530 nm), 543 nm (λ_obs = 565-620 nm) e 710 nm (due-fotone; Λ _OBS = 390-465 nm) per NBD, colorante rosso fluorescente e Hoechst 33342, rispettivamente.

4. osservazione della traslocazione nucleare di piccole molecole ospiti attivati dalla luce di due fotoni NIR

1. Fornire il campione di cellule (preparato in passaggio 2.3) con 200 µ l di FBS-libero EMEM contenente ^Cagedcolla-NBD (10 µM) ed incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ per 3 h.
2. Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare il campione di cellule con 100 µ l di D-PBS due volte. Fornire il campione di cellule con 200 µ l di EMEM (10% FBS).
3. Sottoporre il campione di cellule per microscopia a scansione laser confocale e registrare le micrografie eccitazione a 488 nm (λ_obs = 500-530 nm).
4. Per traslocazione nucleare di ^Cagedcolla-NBD, irradiare la regione inclusa la cella di interesse con un laser di eccitazione del due-fotone (710 nm), installato come fonte luminosa del microscopio, per 2 min (30 s × 4). Osservare la traslocazione come descritto al punto 4.3.

5. osservazione della traslocazione nucleare di ospiti macromolecolari attivati dalla luce UV

1. Fornire il campione di cellule (preparato in passaggio 2.3) con 200 µ l di FBS-libero EMEM contenente ^Cagedcolla-QD (10 nM) e incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ per 3 h.
2. Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare il campione di cellule con 100 µ l di D-PBS due volte. Fornire il campione di cellule con 200 µ l di EMEM (10% FBS).
3. Per traslocazione nucleare di ^Cagedcolla-QD, esporre il campione di cellule ai raggi UV per 2 min tramite una fibra ottica utilizzando una sorgente di luce allo xeno 100-W dotata di filtro passa-banda 365 nm. Per un esempio di cella di riferimento senza esposizione ai raggi UV, conservare il campione di cellule buio.
4. Per la visualizzazione dei nuclei, aggiungere 1 µ l di Hoechst 33342 (1 mg/mL) al terreno di coltura e incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ per 10 min.
5. Sottoporre il campione di cellule per microscopia a scansione laser confocale e registrare le micrografie eccitazione a 405 nm (λ_obs = 430-520 nm) e 488 nm (λ_obs = 625-680 nm) per Hoechst 33342 e QD, rispettivamente.

6. cellule

1. Mantenere le cellule di Hep3B il carcinoma epatocellulare umano in EMEM (10% FBS) a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂.
2. Le cellule del seme il giorno prima dell'esperimento. Cellule di³ Hep3B seme 5.0 × 10 per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti cultura in EMEM (10% FBS, 200 µ l) e incubare il campione di cellule a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ per 24 h.
3. Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare il campione di cellule con 100 µ l di D-PBS due volte.
4. Fornire il campione di cellule con 200 µ l di FBS-libero EMEM contenente ^Cagedcolla-NBD (0.1-100 µM) e incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ per 3 h.
5. Esporre il campione di cellule a luce UV per 2 min tramite una fibra ottica utilizzando una sorgente di luce allo xeno 100-W dotata di filtro passa-banda 365 nm. Per un esempio di cella analoga senza esposizione ai raggi UV, conservare il campione di cellule buio.
6. Aggiungere 10 µ l di reagente di cella contando Kit-8 (10 µ l) al terreno di coltura e incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ per 2 h.
7. Sottoporre il campione di cellule a spettroscopia di assorbimento (λ = 450 nm) utilizzando un lettore di micropiastre.

Risultati

Prima photoirradiation, Hep3B cellule incubate con ^Cagedcolla-NBD ha esibito l'emissione di fluorescenza punctate dal loro interno (λ_ext = 488 nm; Figure 4A e 4C, verde). Un Micrografo analogo è stato ottenuto al momento di eccitazione a 543 nm per colorante rosso fluorescente (figure 4B e 4C, rosso), che indica che il ^Cagedcolla-NBD localizzata negli endosomi....

Discussione

Le indagini precedenti di luce-attivato traslocazione delle proteine nel nucleo delle cellule sono stati raggiunti utilizzando in gabbia NLS^7,8,9. Come accennato in precedenza, questi metodi richiedono tecniche aggiuntive per incorporare le proteine NLS-etichettate nel citoplasma. Al contrario, nostro tag colla-R ^Cagedconsente non solo la traslocazione nucleare indotta da foto, ma anche l'assorbimento cellulare degli ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm