JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı ışık tetiklemeli nükleer translocation kafesli moleküler tutkal Etiketler kullanarak canlı hücreler Konuk açıklar. Bu yöntem site seçici hedefleme nükleer ilaç dağıtım için umut verici.

Özet

Hücre çekirdeği en önemli organellerin hücre altı ilaç dağıtım hedefi farklı gen çoğaltma modülasyon beri biridir ve ifade çeşitli hastalıkların tedavisinde etkilidir. Burada, biz ışık tetiklemeli nükleer translocation kullanarak Konuk moleküler tutkal (kafeslitutkal-R) Etiketler olan birden çok guanidinium iyon (Gu+) kolyeler anyonik photocleavable grupla (bütrat yerine korunur, Kafesli göstermek nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Kafeslitutkal-R ile öğesini konuklar kapladığı yaşam içine endositoz ile hücre ve endosomes içinde kalır. Ancak, photoirradiation, kafeslitutkal-R endosomal kaçış ve konukların sonraki nükleer translocation kolaylaştırır birden çok Gu+ kolye, taşıyan kokulum moleküler tutkal (Uncagedtutkal-R) dönüştürülür. Tagged konuklar hücre çekirdeği tarafından takip sitoplazma içine geçirebilirsiniz bu yana bu yöntem site seçici hedefleme nükleer ilaç dağıtım için umut verici sadece photoirradiated. Kafesli Tutkal-R Etiketler kuantum nokta (QDs) gibi makromoleküllerin Konuklar küçük molekül konuklar yanı sıra teslim edebilirsiniz. Kafesli Tutkal-R Etiketler sadece UV ışık aynı zamanda derin doku nüfuz edebilir iki fotonlu yakın kızılötesi (Nur) ışık ile kokulum olabilir.

Giriş

Genetik bilgi taşıyan, hücre çekirdeği en önemli organellerin hücre altı ilaç dağıtım hedefi farklı gen çoğaltma modülasyon beri biridir ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların tedavisinde etkili ve genetik ifadesidir 1,2,3bozuklukları. Gibi nükleer yerelleştirme sinyalleri (NLS)4,5,6 yaygın olarak araştırılması için nükleer teslimat ilaçların peptid konjugasyon Etiketler. Ancak, istenmeyen yan etkileri azaltmak için nükleer translocation kronolojik zamanmekansal kontrolü gereklidir.

Daha önce ışık tetiklemeli translocation proteinlerin hücre çekirdeği içine kafesli NLS7,8,9kullanılarak elde edilmiştir. NLS içine hücre çekirdeği sitoplazmik taşıma proteinleri6bağlama yaparak geçirir. Bildirilen yöntemlerde kafesli NLS taşıyan Konuk proteinler doğrudan mikroenjeksiyon8 tarafından sitoplazma dahil veya genetik kod genişleme teknik9kullanarak hedef hücrelerde dile getirdi. Bu nedenle, hücresel alımı ve nükleer translocation fotoğraf kaynaklı elde edebilirsiniz bir yöntem pratik uygulamalar için avantajlıdır.

Burada, nükleer translocation ışık tetiklemeli dendritik kafesli moleküler tutkal (kafeslitutkal-R, Şekil 1) Etiketler kullanarak canlı hücreler Konuk açıklar. Suda çözünen moleküler tutkallar10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , birden çok Gu+ kolye taşıyan 23 daha önce hangi sıkıca proteinler11,12,13,14,-15uygun geliştirilmiştir, 16,17, nükleik asitler18,19,20, fosfolipid membranlar21ve kil nanosheets22,23 üzerinden Gu+ kolye ve oxyanionic gruplarını temel hedefleri arasında birden fazla tuz köprüleri oluşumu. Kafeslitutkal-R Gu+ kolye bir anyonik photocleavable grup bütrat yerine nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) tarafından korunmaktadır. Kafeslitutkal-R ile öğesini konuklar kapladığı yaşam içine hücreleri ile endositoz've konaklama endosomes (Şekil 2). Photoirradiation, kafeslitutkal-R BANVOC grupları öğesini Konuk göç kolaylaştıran birden çok Gu+ kolye, taşıyan bir kokulum moleküler tutkal (Uncagedtutkal-R) vermeye ayrılır hücre çekirdeği (Şekil 2) tarafından takip sitoplazma. Kafeslitutkal-R etiket UV veya iki fotonlu yakın kızılötesi (Nur) ışık ciddi fototoksisite olmadan maruz kokulum olabilir. Biz spatiotemporally kontrollü nükleer teslimat makromoleküllerin konuklar hem de kuantum nokta (QDs) ve floresan boya (nitrobenzoxadiazole; kullanarak küçük molekül konuklar kafeslitutkal-R etiketlerle göstermek NBD), sırasıyla, örnek olarak.

figure-introduction-4038
Resim 1: Şematik yapıları kafeslitutkal-r. 9 guanidinium iyon (Gu+) kolyeler kafeslitutkal-r bütrat yerine nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) grubu tarafından korunmaktadır. BANVOC grupları ile UV veya iki fotonlu nur ışık tarafından i ciddi. Kafeslitutkal-R odak özünü nitrobenzoxadiazole (NBD) veya dibenzocylooctyne (DBCO) ile functionalized. Başvuru20izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-introduction-4837
Resim 2: Işık tetiklemeli nükleer translocation Konuk şematik gösterimi Birleşik bir kafeslitutkal-R etiketiyle. Konuk /kafeslitutkal-R eşlenik yaşam içine alınır endositoz ile hücre. Photoirradiation, kafeslitutkal-R endosomal kaçış tagged Konuk kolaylaştırabilir bir Uncagedtutkal-R etiketi verim kokulum etikettir. Daha sonra tagged Konuk hücre çekirdeği geçirir. Başvuru20izni ile yayımlanmaktadır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protokol

1. hazırlanması konuklar kafeslitutkal-R ile Etiketler

  1. Kafeslitutkal-NBD çözüm hazırlamak.
    1. Kafeslitutkal-NBD (Şekil 1) aşağıdaki yordamlar yukarıda açıklanan20sentez.
    2. Kafeslitutkal-NBD (10 mM) Kuru dimetil sülfoksit (DMSO) içinde stok çözeltisi hazırlamak.
      Not: stok çözüm karanlıkta saklamak. Çözüm sulu arabellekleri veya hücre kültür medya kullanımı üzerine ile seyreltilmiş.
  2. Kafeslitutkal-QD çözüm hazırlamak.
    1. Kafeslitutkal-dibenzocylooctyne (kafeslitutkal-DBCO) sentez (Şekil 1) aşağıdaki yordamları daha önce açıklanan20.
    2. Kafeslitutkal-DBCO (10 mM) Kuru DMSO içinde stok çözeltisi hazırlamak.
    3. Kafeslitutkal-QD hazırlanması için ilk azid functionalized QDs (azid-QD; hazırlamak Şekil 3). Bir DMF 400 µL için 100 µL azid-PEG4-NHS ester (Şekil 3) dimetil formamide (DMF, 125 µM) çözeltisi ekleyin (500 nM) Amin functionalized PEG (Amin-QD; ile kaplı çözüm kuantum nokta (QDs) Şekil 3). 1s için karışımı oda sıcaklığında ilave edin.
    4. DMF rejenere selüloz membran 3.500 molekül ağırlığı kesme (MWCO) ile kullanarak 800 mL karşı 24 h için elde edilen çözüm diyaliz.
    5. Kafeslitutkal-DBCO için 50 µM DMF ile hisse senedi çözüm sulandırmak. 200 µL çözüm sonrası diyaliz (Şekil 3) ekleyin ve karışımı 3 h için oda sıcaklığında ilave edin.
    6. DMF rejenere selüloz membran (25.000 MWCO) kullanarak 800 mL karşı 24 h için elde edilen çözüm diyaliz.
    7. 200 için elde edilen çözüm seyreltik nM DMF ile.

figure-protocol-1957
Şekil 3: şematik kafeslitutkal-QD hazırlanması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. mikroskobik gözlemler için Hep3B hücre örnek hazırlanması

  1. Altında %5 37 ° C'de % 10 fetal Sığır serum (FBS) içeren kartal'ın en az gerekli Orta (EMEM) insan hepatosellüler karsinom Hep3B hücreleri korumak CO2.
  2. Tohum hücreleri bir gün önce deney. Bir 8 odalı cam alt katman içinde EMEM kuyu başına tohum 5.0 × 103 Hep3B hücreleri (% 10 FBS, 200 µL) ve hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 24 h için.
  3. Kültür orta kaldırmak ve hücre örnek 100 µL Dulbecco'nın fosfat tampon salin (D-PBS) ile iki kez yıkayın.

3. küçük molekül Konuk UV ışık tarafından tetiklenen nükleer Translocation gözlenmesi

  1. (Hazırlanan adım 2.3) hücre örnekle FBS ücretsiz EMEM kafeslitutkal-NBD içeren 200 µL tedarik (10 µM) ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 3 h için.
    Not: Kuluçka FBS ücretsiz EMEM 4 h daha uzun süre içinde hücre örneğinin ciddi hücre hasarı neden olur.
  2. Kültür orta kaldırmak ve hücre örneği D-PBS 100 µL ile iki kez yıkayın.
  3. Endosomes görselleştirme için hücre örnek EMEM 200 µL ile tedarik (% 10 FBS) kırmızı-floresan boya içeren (Örneğin, LysoTracker kırmızı, 100 nM) ve elde edilen hücre örneği 37 ° C'kuluçkaya altında %5 20 dakika süreyle CO2 ' yi kaldırmak kültür Orta ve durulama ile iki kez 100 µL D-PBS, hücre örnek. Hücre örneği EMEM 200 µL ile tedarik (% 10 FBS).
  4. İçin nükleer translocation kafeslitutkal-NBD, UV ışığı için 2 dk üzerinden fiber optik bir 365 nm bant filtre ile donatılmış 100-W xenon ışık kaynağı kullanarak bir hücre örneğine maruz. Hücre örneği için UV Işınlarına maruz kalma olmadan, hücre örnek karanlıkta bırakın.
    Not: Cam yüzeylerde kapak için etkili UV Işınlarına maruz kalma kapalı alınabilir. UV ışık uzun süre maruz sitotoksisite hücrelere neden olabilir.
  5. Çekirdeklerin görselleştirme, kültür ortamına Höchst 33342 (1 mg/mL) 1 µL eklemek ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 10 dk için.
  6. Hücre örnek mikroskobu tarama confocal lazer konu ve filmler uyarma 488, üzerine kayıt nm (λobs 500-530 nm =), 543 nm (λobs 565-620 nm =) ve 710 nm (iki fotonlu; λ OBS 390-465 nm =) için NBD, kırmızı-floresan boya ve Höchst 33342, anılan sıraya göre.

4. küçük molekül Konuk iki fotonlu nur ışık tarafından tetiklenen nükleer Translocation gözlenmesi

  1. (Hazırlanan adım 2.3) hücre örnekle FBS ücretsiz EMEM kafeslitutkal-NBD içeren 200 µL tedarik (10 µM) ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 3 h için.
  2. Kültür orta kaldırmak ve hücre örneği D-PBS 100 µL ile iki kez yıkayın. Hücre örneği EMEM 200 µL ile tedarik (% 10 FBS).
  3. Hücre örnek mikroskobu tarama confocal lazer konu ve filmler uyarma 488, üzerine kayıt nm (λobs 500-530 nm =).
  4. İki fotonlu uyarma lazer ile ilgi hücre de dahil olmak üzere bölge için nükleer translocation kafeslitutkal-NBD, ışınlatayım (710 nm), yüklü bir ışık kaynağı olarak 2 dk (30 s × 4) için mikroskop. Translocation 4.3 adımda anlatıldığı gibi gözlemlemek.

5. makromoleküllerin Konuk UV ışık tarafından tetiklenen nükleer Translocation gözlenmesi

  1. (Hazırlanan adım 2.3) hücre örnekle FBS ücretsiz EMEM kafeslitutkal-QD içeren 200 µL tedarik (10 nM) ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 3 h için.
  2. Kültür orta kaldırmak ve hücre örneği D-PBS 100 µL ile iki kez yıkayın. Hücre örneği EMEM 200 µL ile tedarik (% 10 FBS).
  3. İçin nükleer translocation kafeslitutkal-QD, UV ışığı için 2 dk üzerinden fiber optik bir 365 nm bant filtre ile donatılmış 100-W xenon ışık kaynağı kullanarak bir hücre örneğine maruz. Hücre örneği için UV Işınlarına maruz kalma olmadan, hücre örnek karanlıkta bırakın.
  4. Çekirdeklerin görselleştirme, kültür ortamına Höchst 33342 (1 mg/mL) 1 µL eklemek ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 10 dk için.
  5. Hücre örnek mikroskobu tarama confocal lazer konu ve filmler uyarma 405, üzerine kayıt nm (λobs 430-520 nm =) ve 488 nm (λobs 625-680 nm =) Höchst 33342 ve QDs, anılan sıraya göre.

6. hücre canlılığı tahlil

  1. İnsan hepatosellüler karsinom Hep3B hücrelerde EMEM korumak (% 10 FBS) 37 ° c altında %5 CO2.
  2. Tohum hücreleri bir gün önce deney. Bir 96-şey kültür tabağına EMEM kuyu başına tohum 5.0 × 103 Hep3B hücreleri (% 10 FBS, 200 µL) ve hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 24 h için.
  3. Kültür orta kaldırmak ve hücre örneği D-PBS 100 µL ile iki kez yıkayın.
  4. Hücre örneği FBS ücretsiz EMEM kafeslitutkal-NBD içeren 200 µL ile tedarik (0,1-100 µM) ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 3 h için.
  5. UV ışık için 2 dk yolu ile hücre örneğe fiber optik bir 365 nm bant filtre ile donatılmış 100-W xenon ışık kaynağı kullanarak bir ifşa. UV Işınlarına maruz kalma olmadan bir benzer hücre örnek için hücre örnek karanlıkta bırakın.
  6. Hücre sayımı Kit-8 reaktif (10 µL) 10 µL kültür ortamına Ekle ve elde edilen hücre örneği 37 ° C altında 5 %'kuluçkaya CO2 2 h için.
  7. Hücre örnek soğurma spektroskopisi için konu (λ = 450 nm) bir Mikroplaka Okuyucu kullanarak.

Sonuçlar

Photoirradiation önce onların iç punctate floresan emisyon kafeslitutkal-NBD ile inkübe Hep3B hücreleri sergilenen (λext 488 = nm; Rakamlar 4A ve 4 C, yeşil). Benzer bir test uyarma, 543 üzerine elde edildi kafeslitutkal-NBD endosomes içinde lokalize gösteren nm kırmızı-floresan boya (rakamlar 4B ve 4 C, kırmızı). Buna göre floresans emisyon

Tartışmalar

Önceki araştırmalar, ışık tetiklemeli translocation proteinlerin hücre çekirdeği içine kafesli NLS7,8,9kullanılarak elde edilmiştir. Daha önce belirtildiği gibi bu yöntemler NLS öğesini proteinler sitoplazma dahil etmek için ek teknikler gerektirir. Buna ek olarak, bizim kafeslitutkal-R etiketi sadece nükleer translocation fotoğraf kaynaklı aynı zamanda misafir hücresel alımını sağlar. Bu ö...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

NanoBio entegrasyonu için Tokyo Üniversitesi Merkezi anıyoruz. Bu eser için genç bilim adamları (B) (26810046) K.O. Grant-in-Aid tarafından desteklenen ve Grant-in-Aid tarafından özel olarak terfi için araştırma (25000005) ta RM sayesinde araştırma bursu Japonya Derneği promosyon, bilim (JSP'ler için kısmen destekleniyor ) genç bilim adamları ve önde gelen Enstitüler (GPLLI) için Program için.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Azide-PEG4-NHS esterClick Chemistry ToolsAZ103
Q-dot 655 ITKInvitrogenQ21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)NIPPON GeneticsTOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)Harvard Apparatus7425-RC25K
Hep3B CellsATCCHB-8064
8-chambered glass substrateNunc155411JP
96-well culture plateNunc167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)Thermo Fisher Scientific10370-021
Fetal bovine serum (FBS)GE HealthcareSH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)Wako Pure Chemical Industries045-29795
LysoTracker RedLonza WalkersvillePA-3015
Hoechst 33342DojindoH342
Cell Counting Kit-8DojindoCK04
Confocal laser scanning microscopeCarl-ZeissLSM 510Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscopeLeicaTCS SP8
Xenon light sourceAsahi SpectraLAX-102
Microplate readerMolecular DevicesSpectraMax Paradigm

Referanslar

  1. Miller, A. D. Human gene therapy comes of age. Nature. 357, 455-460 (1992).
  2. Roth, J. A., Cristiano, R. J. Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going. Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).
  3. Verma, I. M., Weitzman, M. D. GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine. Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).
  4. Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences. Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).
  5. Martin, R. M., et al. Principles of protein targeting to the nucleolus. Nucleus. 6, 314-325 (2015).
  6. Sun, Y., et al. Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals. Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).
  7. Ventura, B. D., Kuhlman, B. Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization. Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).
  8. Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells. FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).
  9. Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. Control of Protein Function through Optochemical Translocation. ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).
  10. Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. Guanidinium-based "molecular glues" for modulation of biomolecular functions. Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).
  11. Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization. Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).
  12. Okuro, K., et al. Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic "Molecular Glue" on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin. Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).
  13. Uchida, N., et al. Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids. Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).
  14. Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies. ACS Nano. 8, 904-914 (2014).
  15. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues. Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).
  16. Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes. Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).
  17. Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions. Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).
  18. Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization. Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).
  19. Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues. Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).
  20. Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).
  21. Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation. Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).
  22. Wang, Q., et al. High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder. Nature. 463, 339-343 (2010).
  23. Tamesue, S., et al. Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants. Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).
  24. Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes. EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).
  25. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  26. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kimyasay 143molek ler tutkallarphotoactivationh cre ekirde iendosomal kan kleer translocationiki fotonlu uyarmakuantum nokta

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır