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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des clients dans l’utilisation des balises de "cage" colle moléculaire des cellules vivantes. Cette méthode est prometteuse pour administration de médicaments sélectifs site nucléaire de ciblage.

Résumé

Le noyau de la cellule est l’un des principaux organites comme une cible de délivrance de médicaments subcellulaires, depuis la modulation de la réplication des gènes et expression est efficace pour le traitement de diverses maladies. Ici, nous démontrons la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des invités à l’aide de cage tags colle moléculaire (Cagedcolle-R), dont plusieurs pendentifs ion (Gu+) de guanidinium sont protégés par un groupe de photoclivables anionique (butyrate-substitués nitroveratryloxycarbonyl ; BA CONV). Invités le tag Cagedcolle-R sont absorbées dans la vie des cellules par endocytose et restent dans les endosomes. Toutefois, dès lors, Cagedcolle-R est converti en uncaged moléculaire colle (colle-RUncaged) transportant plusieurs pendentifs Gu+ , qui facilite l’évasion endosomal et translocation nucléaire subséquente des invités. Cette méthode est prometteuse pour site sélectif nucléaire ciblage administration de médicaments, puisque les invités marquées peuvent migrer dans le cytoplasme, suivi par le noyau de la cellule uniquement lorsque photoirradiated. Avec cage Tags de colle-R peuvent livrer macromoléculaires invités tels que boîtes quantiques (QDs) ainsi que de petites molécules hôtes. Avec cage Étiquettes de colle-R peuvent être uncaged avec non seulement les rayons UV, mais aussi les deux photons proche infrarouge (NIR) lumière qui peut pénétrer profondément dans les tissus.

Introduction

Le noyau de la cellule, qui contient des informations génétiques, est l’un des principaux organites comme une cible de délivrance de médicaments subcellulaires, depuis modulation de la réplication des gènes et expression est efficace pour le traitement de diverses maladies dont le cancer et génétique les troubles de1,2,3. Pour nucléaire livraison de médicaments, conjugaison de peptide balises telles que la localisation nucléaire signaux (NLS)4,5,6 a été largement étudiée. Toutefois, afin de réduire les effets secondaires indésirables, contrôle spatio-temporelle de la translocation nucléaire est nécessaire.

Auparavant, lumière déclenchée la translocation des protéines dans le noyau de la cellule a été réalisée à l’aide de "cage" NLS7,8,9. NLS migre dans le noyau de la cellule en se liant aux protéines de transport cytoplasmique6. Dans les méthodes signalées, protéines de commentaires portant "cage" NLS sont directement incorporés dans le cytoplasme par microinjection8 ou exprimées dans les cellules cibles à l’aide d’un code génétique expansion technique9. Par conséquent, une méthode qui peut atteindre l’absorption cellulaire et translocation nucléaire photoinduit est avantageuse pour des applications pratiques.

Ici, nous décrivons la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des invités dans les cellules vivantes à l’aide de balises dendritiques colle moléculaire en cage (Cagedcolle-R, Figure 1). Les colles moléculaire solubles dans l’eau10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 portant plusieurs pendentifs Gu+ a été développé, qui adhèrent fermement à protéines11,12,13,14,15, 16,17, acides nucléiques18,19,20, de membranes phospholipidiques21et argile nanofeuillets22,23 à la formation de multiples ponts salins entre leurs pendentifs Gu+ et oxyanionic des groupes sur les cibles. Les pendentifs de Gu+ du Cagedcolle-R sont protégés par un groupe de photoclivables anionique, nitroveratryloxycarbonyl substitués butyrate (convBA). Invités le tag Cagedcolle-R sont absorbées dans la vie des cellules par endocytose et séjour dans les endosomes (Figure 2). Dès lors, les groupes de conv BAdu Cagedcolle-R sont détachés pour produire une uncaged moléculaire colle (colle-RUncaged) transportant plusieurs pendentifs Gu+ , qui facilite ensuite la migration de l’invité étiquetée dans le cytoplasme, suivi par le noyau de la cellule (Figure 2). La balise de colle-R Cagedpeut être uncaged par l’exposition aux UV ou deux photons proche infrarouge (NIR) lumière sans phototoxicité grave. Nous démontrons l’administration nucléaire spatio-temporelle controlee de macromoléculaires invités ainsi que des invités de petites molécules avec Cagedtags de colle-R, en utilisant des points quantiques (QDs) et un colorant fluorescent (nitrobenzoxadiazole ; NBD), respectivement, à titre d’exemples.

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Figure 1 : Structures schématiques Cagedcolle-r Les 9 pendentifs ion (Gu+) de guanidinium de Cagedcolle-R sont protégés par un groupe de nitroveratryloxycarbonyl substitués butyrate (convBA). Les groupes de conv BAsont clivés par irradiation UV ou lumière NIR deux photons. Le noyau central de Cagedcolle-R est fonctionnalisé avec nitrobenzoxadiazole (NBD) ou dibenzocylooctyne (DBCO). Réimprimé avec la permission de référence20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Illustration schématique de la translocation nucléaire déclenchée à la lumière des invités conjugué avec une balise de colle-R Caged. L’invité /Cagedconjugué de colle-R est absorbé dans la vie des cellules par endocytose. Dès lors, la balise de colle-R Cagedest uncaged pour produire une balise de colle-R Uncagedqui peut faciliter l’évasion endosomal de l’invité étiquetée. Par la suite, l’invité tagged migre dans le noyau de la cellule. Réimprimé avec la permission de référence20. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Protocole

1. préparation des invités avec cagecolle-R Tags

  1. Préparer la solution de colle-NBD Caged.
    1. Une synthèse suivant les procédures décrites précédemment20 Cagedcolle-NBD (Figure 1).
    2. Préparer une solution de colle Caged-NBD (10 mM) dans le sec diméthylsulfoxyde (DMSO).
      Note : Stocker la solution dans l’obscurité. La solution peut être diluée avec tampons aqueux ou de milieux de culture cellulaire à son utilisation.
  2. Préparer la solution de colle-QD Caged.
    1. Synthétiser le Cagedcolle-dibenzocylooctyne (Cagedcolle-DBCO) (Figure 1) suivant la procédure précédemment décrite20.
    2. Préparer une solution de colle Caged-DBCO (10 mM) dans le DMSO sec.
    3. Pour la préparation du Cagedcolle-QD, préparer d’abord QDs azoture fonctionnalisés (Azide-QD ; La figure 3). Ajouter 100 µL de solution diméthyl formamide (DMF, 125 µM) d’azoture-PEG4-NHS ester (Figure 3) à 400 µL d’une FMM (500 nM) solution des points quantiques (QDs) recouverte de PEG fonctionnalisés amine (Amine-QD ; La figure 3). Agiter le mélange pendant 1 h à température ambiante.
    4. Dialyser la solution obtenue pendant 24 h contre 800 mL de DMF à l’aide d’une membrane de cellulose régénérée avec 3 500 poids moléculaire limite (MWCO).
    5. Diluer la solution mère de Cagedcolle-DBCO à 50 µM avec DMF. Ajouter 200 µL de la solution à la solution de dialyse après (Figure 3) et agiter le mélange pendant 3 h à température ambiante.
    6. Dialyser la solution obtenue pendant 24 h contre 800 mL de DMF à l’aide d’une membrane de cellulose régénérée (25 000 MWCO).
    7. Diluer la solution obtenue à 200 nM avec DMF.

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Figure 3 : illustration schématique de la préparation du Cagedcolle-QD. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. préparation de l’échantillon de cellules Hep3B pour l’observation au microscope

  1. Maintenir les cellules de carcinome Hep3B hépatocellulaire humaine en milieu essentiel minimal aigle (EMEM) contenant 10 % sérum fœtal (SVF) à 37 ° C de moins de 5 % de CO2.
  2. Les cellules des graines la veille de l’expérience. Semences 5,0 × 103 Hep3B cellules / puits d’un substrat de verre 8-chambré en EMEM (10 % FBS, 200 µL) et incuber l’échantillon de cellules à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 24 h.
  3. Enlever le milieu de culture et rincer l’échantillon cellulaire avec 100 µL de solution saline tampon phosphate de Dulbecco (D-PBS) deux fois.

3. observation de Translocation nucléaire de petites molécules hôtes déclenchée par la lumière UV

  1. Fournir l’échantillon de la cellule (document établi en étape 2.3) avec 200 µL de FBS-free EMEM contenant Cagedcolle-NBD (10 µM) et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 3 h.
    Remarque : L’Incubation de l’échantillon de cellules en EMEM FBS-libre pendant plus de 4 h provoque des dommages cellulaires graves.
  2. Enlever le milieu de culture et rincer l’échantillon cellulaire avec 100 µL de PBS-D deux fois.
  3. Pour visualiser les endosomes, fournir l’échantillon de cellules avec 200 µL de ha ha ha (10 % FBS) contenant un colorant fluorescent rouge (p. ex., LysoTracker rouge, 100 nM) et incuber l’échantillon de cellules qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 20 min. enlever la culture support et rincer l’échantillon cellulaire avec 100 µL de PBS-D deux fois. Fournir l’échantillon de cellules avec 200 µL de ha ha ha (10 % FBS).
  4. Pour la translocation nucléaire du Cagedcolle-NBD, exposer l’échantillon cellulaire aux UV pour 2 min via une fibre optique à l’aide d’une source lumineuse de 100 W xénon équipée de filtre passe-bande 365 nm. Pour un échantillon de cellules de référence sans exposition aux rayons UV, garder l’échantillon cellulaire dans l’obscurité.
    Remarque : Le couvercle les substrats de verre peut être enlevé pour l’exposition UV efficace. Longue exposition aux rayons ultraviolets peut provoquer la cytotoxicité pour les cellules.
  5. Pour la visualisation des noyaux, ajouter 1 µL de Hoechst 33342 (1 mg/mL) au milieu de culture et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 10 min.
  6. Sous réserve de l’échantillon de cellules laser confocal, microscopie à balayage et enregistrer les micrographies sur excitation à 488 nm (λobs = 500-530 nm), 543 nm (λobs = 565-620 nm) et 710 nm (deux photons ; Λ OBS = 390-465 nm) pour le jour ouvrable suivant, colorant rouge fluorescente et Hoechst 33342, respectivement.

4. l’observation de la Translocation nucléaire de petites molécules hôtes déclenchée par la lumière de deux photons NIR

  1. Fournir l’échantillon de la cellule (document établi en étape 2.3) avec 200 µL de FBS-free EMEM contenant Cagedcolle-NBD (10 µM) et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 3 h.
  2. Enlever le milieu de culture et rincer l’échantillon cellulaire avec 100 µL de PBS-D deux fois. Fournir l’échantillon de cellules avec 200 µL de ha ha ha (10 % FBS).
  3. Sous réserve de l’échantillon de cellules laser confocal, microscopie à balayage et enregistrer les micrographies sur excitation à 488 nm (λobs = 500-530 nm).
  4. Pour la translocation nucléaire du Cagedcolle-NBD, irradier la région y compris la cellule d’intérêt avec un laser d’excitation biphotonique (710 nm), installé comme une source de lumière dans le microscope, pendant 2 min (30 s × 4). Observer la translocation comme indiqué au point 4.3.

5. observation de Translocation nucléaire d’invités macromoléculaires déclenchée par la lumière UV

  1. Fournir l’échantillon de la cellule (document établi en étape 2.3) avec 200 µL de FBS-free EMEM contenant Cagedcolle-QD (10 nM) et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 3 h.
  2. Enlever le milieu de culture et rincer l’échantillon cellulaire avec 100 µL de PBS-D deux fois. Fournir l’échantillon de cellules avec 200 µL de ha ha ha (10 % FBS).
  3. Pour la translocation nucléaire du Cagedcolle-QD, exposer l’échantillon cellulaire aux UV pour 2 min via une fibre optique à l’aide d’une source lumineuse de 100 W xénon équipée de filtre passe-bande 365 nm. Pour un échantillon de cellules de référence sans exposition aux rayons UV, garder l’échantillon cellulaire dans l’obscurité.
  4. Pour la visualisation des noyaux, ajouter 1 µL de Hoechst 33342 (1 mg/mL) au milieu de culture et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 10 min.
  5. Sous réserve de l’échantillon de cellules laser confocal, microscopie à balayage et enregistrer les micrographies sur excitation à 405 nm (λobs = 430-520 nm) et 488 nm (λobs = 625-680 nm) pour Hoechst 33342 et QDs, respectivement.

6. analyse de viabilité de cellules

  1. Maintenir les cellules de carcinome Hep3B hépatocellulaire humaine en EMEM (10 % FBS) à 37 ° C moins de 5 % de CO2.
  2. Les cellules des graines la veille de l’expérience. Semences 5,0 × 103 Hep3B cellules / puits d’une plaque 96 puits de culture en EMEM (10 % FBS, 200 µL) et incuber l’échantillon de cellules à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 24 h.
  3. Enlever le milieu de culture et rincer l’échantillon cellulaire avec 100 µL de PBS-D deux fois.
  4. Fournir l’échantillon de cellules avec 200 µL de FBS-free EMEM contenant Cagedcolle-NBD (0,1 à 100 µM) et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 3 h.
  5. Exposer l’échantillon cellulaire à la lumière UV pour 2 min via une fibre optique à l’aide d’une source lumineuse de 100 W xénon équipée de filtre passe-bande 365 nm. Pour un échantillon de cellules analogues sans exposition aux rayons UV, garder l’échantillon cellulaire dans l’obscurité.
  6. Ajouter 10 µL de réactif de cellule comptage Kit-8 (10 µL) dans le milieu de culture et incuber l’échantillon cellulaire qui en résulte à 37 ° C moins de 5 % de CO2 pendant 2 h.
  7. Sous réserve de l’échantillon de cellules de spectroscopie d’absorption (λ = 450 nm) à l’aide d’un lecteur de microplaques.

Résultats

Avant photo-irradiation, cellules Hep3B incubées avec Cagedcolle-NBD exposées émission de fluorescence ponctuée de leur intérieur (λext = 488 nm ; Figures 4 a et 4 C, vert). Une micrographie analogue a été obtenue sur l’excitation 543 nm pour le colorant rouge fluorescente (Figures 4 b et 4C, rouge), indiquant que le Cagedcolle-NBD localisée dans les ...

Discussion

Les enquêtes précédentes de lumière déclenchée la translocation des protéines dans le noyau de la cellule ont été obtenus à l’aide de "cage" NLS7,8,9. Comme mentionné précédemment, ces méthodes nécessitent des techniques supplémentaires pour incorporer les NLS-protéines dans le cytoplasme. En revanche, notre balise de colle-R Cagedpermet non seulement translocation nucléaire induite par la photo, m...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous reconnaissons le centre pour l’intégration de NanoBio, l’Université de Tokyo. Ce travail a été soutenu par la subvention pour jeunes scientifiques (B) (26810046) à K.O. et partiellement pris en charge par subvention de recherche spécialement favorisé (25000005) à Mr T.A. Merci les bourses de recherche de la société japonaise pour la Promotion of Science (JSPS ) pour les jeunes scientifiques et le programme Leading Graduate Schools (GPLLI).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Azide-PEG4-NHS esterClick Chemistry ToolsAZ103
Q-dot 655 ITKInvitrogenQ21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)NIPPON GeneticsTOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)Harvard Apparatus7425-RC25K
Hep3B CellsATCCHB-8064
8-chambered glass substrateNunc155411JP
96-well culture plateNunc167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)Thermo Fisher Scientific10370-021
Fetal bovine serum (FBS)GE HealthcareSH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)Wako Pure Chemical Industries045-29795
LysoTracker RedLonza WalkersvillePA-3015
Hoechst 33342DojindoH342
Cell Counting Kit-8DojindoCK04
Confocal laser scanning microscopeCarl-ZeissLSM 510Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscopeLeicaTCS SP8
Xenon light sourceAsahi SpectraLAX-102
Microplate readerMolecular DevicesSpectraMax Paradigm

Références

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  26. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).

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