Raumzeitlich kontrollierte nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit Käfig molekulare Leime als Photoactivatable Tags

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit Käfig molekularen Klebstoff-Tags. Diese Methode ist viel versprechend für Website-selektiv-targeting Drug-Delivery.

Zusammenfassung

Der Zellkern ist eines der wichtigsten Organellen als subzelluläre Drug Delivery-Ziel seit Modulation der gen-Replikation und Ausdruck ist wirksam zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten. Hier zeigen wir, dass Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste mit molekularen Klebstoff (^CagedKleber-R) Tags, sperrte deren mehrere Guanidinium Ion (Gu⁺) Anhänger von einer anionischen Photocleavable Gruppe (Butyrat-substituierten geschützt sind Nitroveratryloxycarbonyl; ^BA SVOC). Gäste, die mit dem Stichwort ^CagedKleber-R sind berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose und bleiben in Endosomen. Allerdings wird auf Photoirradiation, ^CagedKleber-R in uncaged molekularen Klebstoff (^UncagedKleber-R) tragen mehrere Gu⁺ Anhänger umgewandelt, die Endosomal entweichen und anschließenden nuklearen Translokation der Gäste erleichtert. Diese Methode ist vielversprechend für Website-selektiv-targeting Drug-Delivery, da tagged Gäste in das Zytoplasma, gefolgt von den Zellkern übergehen können nur dann, wenn Photoirradiated. ^{Im Käfig} Kleber-R Tags können makromolekularen Gäste wie Quantenpunkte (QDs) sowie kleine Molekül Gäste liefern. ^{Im Käfig} Kleber-R Tags sind uncaged mit nicht nur UV-Licht, sondern auch zwei-Photon Nah-Infrarot (NIR) Licht, das tief in das Gewebe eindringen kann.

Einleitung

Der Zellkern, der genetischen Information trägt, ist eines der wichtigsten Organellen als subzelluläre Drug Delivery-Ziel seit Modulation der gen-Replikation und Ausdruck ist wirksam zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs und genetische ^1,2,3-Störungen. Für nukleare Lieferung von Medikamenten Konjugation von Peptid Stichwörter wie nukleare Lokalisierung Signale (NLS)^4,5,6 allgemein untersucht worden ist. Um unerwünschte Nebenwirkungen zu reduzieren, ist jedoch räumlich-zeitliche Kontrolle der nuklearen Translokation notwendig.

Zuvor wurde Licht ausgelöst Translokation von Proteinen in den Zellkern mit Käfig NLS^7,8,9erreicht. NLS wandert in den Zellkern durch die Bindung an zytoplasmatischen Transport Proteine⁶. In den gemeldeten Methoden sind Gast Proteine mit Käfig NLS direkt in das Zytoplasma durch Mikroinjektion⁸ integriert oder in den Zielzellen mit einem genetischen Code Ausbau Technik⁹ausgedrückt. Daher ist eine Methode, die zelluläre Aufnahme und Foto-induzierte nuklearen Translokation erreichen kann vorteilhaft für praktische Anwendungen.

Hier beschreiben wir Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit dendritischen eingesperrte molekularen Klebstoff (^CagedKleber-R, Abb. 1) Tags. Wasserlösliche Leime molekulare^{10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23} mit mehreren Gu⁺ -Anhänger sind bereits entwickelt worden, die halten uns fest an Proteine^{11,12,13,14,15, 16,17}, Nukleinsäuren^18,19,20, Phospholipid-Membranen-²¹und Ton Nanosheets^22,23 durch die Bildung von zahlreichen Salz Brücken zwischen ihren Gu⁺ -Anhänger und Oxyanionic Gruppen auf die Ziele. Die Gu⁺ -Anhänger ^CagedKleber-r sind durch einen anionischen Photocleavable Gruppe, Butyrat ersetzt Nitroveratryloxycarbonyl (^BASVOC) geschützt. Gäste, die mit dem Stichwort ^CagedKleber-R sind berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose und Aufenthalt in Endosomen (Abbildung 2). Auf Photoirradiation sind die ^BASVOC Gruppen von ^CagedKleber-R freistehend ein uncaged molekularen Klebstoff (^UncagedKleber-R) tragen mehrere Gu⁺ Anhänger nachzugeben, dann die Migration von tagged Gast erleichtert in das Zytoplasma, gefolgt von den Zellkern (Abbildung 2). ^Caged-Kleber-R-Tag kann durch die Einwirkung von UV- oder zwei-Photon Nah-Infrarot (NIR) Licht ohne schwere Phototoxizität uncaged. Wir demonstrieren die raumzeitlich kontrollierte nukleare Lieferung von makromolekularen Gäste sowie kleine Molekül Gäste mit ^CagedKleber-R Tags Quantenpunkte (QDs) mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Nitrobenzoxadiazole; NBD), bzw. als Beispiele.

Abbildung 1: Schematische Strukturen der ^CagedKleber-R. Die 9 Guanidinium Ion (Gu⁺) Anhänger ^CagedKleber-r sind von einer Gruppe von Butyrat ersetzt Nitroveratryloxycarbonyl (^BASVOC) geschützt. Die ^BA-SVOC-Gruppen sind durch Bestrahlung mit UV- oder zwei-Photon NIR Licht gespalten. Die fokale Kern ^CagedKleber-R ist mit Nitrobenzoxadiazole (NBD) oder Dibenzocylooctyne (DBCO) funktionalisiert. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-²⁰. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Licht-ausgelösten nuklearen Translokation Gäste konjugiert mit einem ^CagedKleber-R Tag. Der Gast /^CagedKleber-R Konjugat berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose. Auf Photoirradiation ist das ^CagedKleber-R Tag uncaged die Bezeichnung für einen ^Uncaged-Kleber-R, weichen, der Endosomal Entweichen von der tagged Gast erleichtern kann. Anschließend wandert der tagged Gast in den Zellkern. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-²⁰. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protokoll

1. Vorbereitung der Gäste mit ^KäfigKleber-R Stichwörter

1. ^CagedKleber-NBD Lösung ansetzen.
   1. ^CagedKleber-NBD (Abbildung 1) nach dem Verfahren beschriebenen²⁰zu synthetisieren.
   2. Bereiten Sie eine Stammlösung ^CagedKleber-NBD (10 mM) in trockenen Dimethyl Sulfoxid (DMSO).
      Hinweis: Bewahren Sie die Stammlösung in Dunkelheit. Die Lösung kann mit wässrigen Puffer oder Zellkulturmedien nach Gebrauch verdünnt werden.
2. ^CagedKleber-QD Lösung ansetzen.
   1. Synthetisieren ^CagedKleber-Dibenzocylooctyne (^CagedKleber-DBCO) (Abbildung 1) nach den Verfahren zuvor²⁰beschrieben.
   2. Bereiten Sie eine Stammlösung ^CagedKleber-DBCO (10 mM) in trockenen DMSO.
   3. Für die Vorbereitung von ^CagedKleber-QD zuerst vorbereiten-Azid funktionalisiert QDs (Azid-QD; ( Abbildung 3). 400 µL einer DMF 100 µL einer Dimethyl Formamid (DMF, 125 µM) Lösung von Azid-PEG4-NHS Ester (Abbildung 3) hinzufügen (500 nM) Lösung von Quantenpunkten (QDs) beschichtet mit Amin funktionalisiert PEG (Amin-QD; ( Abbildung 3). Rühren Sie die Mischung für 1 h bei Raumtemperatur.
   4. Die resultierende Lösung für 24 h gegen 800 mL DMF 3.500 Molekulargewicht Cut-Off (MWCO) eine regenerierte Zellulose-Membran mit Dialyse.
   5. ^CagedKleber-DBCO bis 50 µM mit DMF-Stammlösung zu verdünnen. Die Post-Dialyse-Lösung (Abbildung 3) 200 µL der Lösung hinzu und rühren Sie die Mischung für 3 h bei Raumtemperatur.
   6. Die resultierende Lösung für 24 h gegen 800 mL DMF eine regenerierte Zellulose-Membran (25.000 MWCO) mit Dialyse.
   7. Verdünnen Sie die resultierende Lösung bis 200 nM mit DMF.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Zubereitung von ^CagedKleber-QD. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

2. Vorbereitung des Hep3B Zellprobe für mikroskopische Beobachtungen

1. Halten menschliche hepatozellulären Karzinom Hep3B Zellen in Adlers minimal wesentliche Medium (EMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) bei 37 ° C weniger als 5 % CO₂.
2. Samen der Zellen am Vortag das Experiment. 5.0 × 10³ Hep3B Samenzellen pro Bohrloch eine 8 Kammern Glassubstrat in EMEM (10 % FBS, 200 µL), und inkubieren Sie die Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO₂ für 24 h.
3. Entfernen Sie das Kulturmedium zu und spülen Sie die Zellprobe mit 100 µL Dulbeccos Phosphat-Puffer Kochsalzlösung (D-PBS) zweimal.

3. Beobachtung der nuklearen Translokation von Small-Molecule Gäste ausgelöst durch UV-Licht

1. Liefern die Zellprobe (vorbereitet in Schritt 2.3) mit 200 µL der FBS-freie EMEM mit ^CagedKleber-NBD (10 µM) und inkubieren Sie die daraus resultierenden Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO₂ für 3 h.
   Hinweis: Die Zellprobe in FBS-freie EMEM länger als 4 h Inkubation verursacht schwere Zellschäden.
2. Entfernen Sie das Kulturmedium zu und spülen Sie die Zellprobe mit 100 µL D-PBS zweimal.
3. Für die Visualisierung von den Endosomen, liefern die Zellprobe mit 200 µL EMEM (10 % FBS), einen rot-fluoreszierenden Farbstoff enthält (z. B.LysoTracker rot, 100 nM), und die daraus resultierende Zellprobe bei 37 ° C inkubieren unter 5 % CO₂ für 20 min. entfernen die Kultur Medium und spülen die Zellprobe mit 100 µL der D-PBS zweimal. Liefern die Zellprobe mit 200 µL EMEM (10 % FBS).
4. Setzen Sie für nukleare Translokation von ^CagedKleber-NBD die Zellprobe mit UV-Licht für 2 min. über eine optische Faser mit einer 100-W Xenon-Lichtquelle mit einem 365 nm Bandpass-Filter ausgestattet. Halten Sie für eine Referenzprobe Zelle ohne UV-Exposition die Zellprobe in Dunkelheit.
   Hinweis: Der Deckel der Glassubstrate kann für effiziente UV-Exposition abgenommen werden. Langjähriger Exposition gegenüber UV-Licht kann dazu führen, dass Zytotoxizität zu den Zellen.
5. Für die Visualisierung der Kerne, dem Kulturmedium 1 µL Hoechst 33342 (1 mg/mL) hinzu, und inkubieren Sie die daraus resultierenden Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO₂ 10 min. lang.
6. Unterliegt die Zellprobe konfokale Laser-scanning-Mikroskopie und erfassen die Mikrographen auf Anregung bei 488 nm (λ_Obs = 500-530 nm), 543 nm (λ_Obs = 565-620 nm), und 710 nm (zwei-Photon; Λ _OBS = 390-465 nm) für NBD, rot fluoreszierenden Farbstoff und Hoechst 33342, beziehungsweise.

4. Beobachtung des nuklearen Translokation von Small-Molecule Gäste durch zwei-Photonen-NIR Licht ausgelöst

1. Liefern die Zellprobe (vorbereitet in Schritt 2.3) mit 200 µL der FBS-freie EMEM mit ^CagedKleber-NBD (10 µM) und inkubieren Sie die daraus resultierenden Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO₂ für 3 h.
2. Entfernen Sie das Kulturmedium zu und spülen Sie die Zellprobe mit 100 µL D-PBS zweimal. Liefern die Zellprobe mit 200 µL EMEM (10 % FBS).
3. Unterliegt die Zellprobe konfokale Laser-scanning-Mikroskopie und erfassen die Mikrographen auf Anregung bei 488 nm (λ_Obs = 500-530 nm).
4. Für nukleare Translokation von ^CagedKleber-NBD, die Region, einschließlich der Zelle von Interesse mit einem zwei-Photon Erregung Laser zu bestrahlen (710 nm), als eine Lichtquelle in das Mikroskop für 2 min (30 s × 4) installiert. Beobachten Sie die Translokation, wie unter Punkt 4.3 beschrieben.

5. Beobachtung der nuklearen Translokation der makromolekularen Gäste ausgelöst durch UV-Licht

1. Liefern die Zellprobe (vorbereitet in Schritt 2.3) mit 200 µL der FBS-freie EMEM mit ^CagedKleber-QD (10 nM), und die daraus resultierende Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % inkubieren CO₂ für 3 h.
2. Entfernen Sie das Kulturmedium zu und spülen Sie die Zellprobe mit 100 µL D-PBS zweimal. Liefern die Zellprobe mit 200 µL EMEM (10 % FBS).
3. Setzen Sie für nukleare Translokation von ^CagedKleber-QD die Zellprobe mit UV-Licht für 2 min. über eine optische Faser mit einer 100-W Xenon-Lichtquelle mit einem 365 nm Bandpass-Filter ausgestattet. Halten Sie für eine Referenzprobe Zelle ohne UV-Exposition die Zellprobe in Dunkelheit.
4. Für die Visualisierung der Kerne, dem Kulturmedium 1 µL Hoechst 33342 (1 mg/mL) hinzu, und inkubieren Sie die daraus resultierenden Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO₂ 10 min. lang.
5. Unterliegt die Zellprobe konfokale Laser-scanning-Mikroskopie und Aufzeichnen der Mikrographen auf Anregung bei 405 nm (λ_Obs = 430-520 nm) und 488 nm (λ_Obs = 625-680 nm) für Hoechst 33342 und QDs, beziehungsweise.

6. Zelle Lebensfähigkeit Assay

1. Menschlichen hepatozellulären Karzinom Hep3B Zellen in EMEM pflegen (10 % FBS) bei 37 ° C weniger als 5 % CO₂.
2. Samen der Zellen am Vortag das Experiment. 5.0 × 10³ Hep3B Samenzellen pro Bohrloch einer 96-Well-Kultur-Platte in EMEM (10 % FBS, 200 µL), und inkubieren Sie die Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO₂ für 24 h.
3. Entfernen Sie das Kulturmedium zu und spülen Sie die Zellprobe mit 100 µL D-PBS zweimal.
4. Liefern die Zellprobe mit 200 µL der FBS-freie EMEM mit ^CagedKleber-NBD (0,1-100 µM) und inkubieren Sie die daraus resultierenden Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO₂ für 3 h.
5. Setzen Sie die Zellprobe mit UV-Licht für 2 min über eine optische Faser mit einer 100-W Xenon-Lichtquelle mit einem 365 nm Bandpass-Filter ausgestattet. Halten Sie für eine analoge Zellprobe ohne UV-Exposition die Zellprobe in Dunkelheit.
6. Das Kulturmedium 10 µL des Reagenz Zelle zählen Kit-8 (10 µL) hinzu und inkubieren Sie die daraus resultierenden Zellprobe bei 37 ° C weniger als 5 % CO₂ für 2 h.
7. Unterliegen die Zellprobe Absorption Spektroskopie (λ = 450 nm) mit einer Mikrotestplatte Reader.

Ergebnisse

Vor Photoirradiation, Hep3B Zellen inkubiert mit ^CagedKleber-NBD ausgestellt punctata Fluoreszenzemission von ihrem inneren (λ_Ext = 488 nm; Abbildungen 4A und 4 C, grün). Eine analoge Schliffbild erhielt nach Anregung bei 543 nm für rot fluoreszierenden Farbstoff (Zahlen 4 b und 4 C, rot), darauf hinweist, dass ^CagedKleber-NBD in den Endosomen lokalisiert. Dem...

Diskussion

Vorausgegangenen Untersuchungen Licht ausgelöst Translokation von Proteinen in den Zellkern sind mit Käfig NLS^7,8,9erreicht worden. Wie bereits erwähnt, erfordern diese Methoden zusätzliche Techniken, die NLS-markierten Proteine in das Zytoplasma zu integrieren. Im Gegensatz dazu ermöglicht unser ^Caged-Kleber-R-Tag nicht nur Foto-induzierte nuklearen Translokation, sondern auch zelluläre Aufnahme der Gäste. Die...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm