Photoactivatable 태그 갇힌된 분자 접착제를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 spatiotemporally 제어

요약

이 프로토콜에 갇힌된 분자 접착제 태그를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌를 빛 트리거 설명 합니다. 이 방법은 사이트 선택적 핵 타겟팅 약물 전달에 대 한 약속입니다.

초록

세포 핵 하나 가장 중요 한 세포의 subcellular 마약 배달 대상으로 유전자 복제의 이후 이며 식 다양 한 질병 치료에 효과적입니다. 여기, 우리를 사용 하 여 고객님의 핵 전 좌 빛 트리거 갇힌 분자 접착제 (^갇힌접착제-R) 태그, 그 여러 guanidinium 이온 (⁺번) 펜 던 트 (낙 산 염 대신 음이온 photocleavable 그룹에 의해 보호 됩니다 설명 nitroveratryloxycarbonyl; ^바 NVOC)입니다. ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그로 손님을 생활 고려 통해 endocytosis 세포 및 endosomes. 그러나, photoirradiation, 시 ^{우리에 갇힌}접착제-R uncaged 분자 접착제 (^Uncaged접착제-R) 여러 번⁺ 펜 던 트를 들고 endosomal 탈출 및 손님 들의 후속 핵 전 좌 용이로 변환 됩니다. 이 방법은 사이트 선택적 핵 타겟팅 약물 전달에 대 한 약속 때문에 태그 손님 세포질 세포 핵 다음으로 마이그레이션할 수 있습니다 경우에만 photoirradiated. ^갇힌 접착제-R 태그는 작은 분자 손님 뿐만 아니라 고분자 손님 양자 점 (QDs) 등을 제공할 수 있습니다. ^갇힌 접착제-R 태그는 자외선 뿐만 아니라 조직에 깊이 침투 수 2 광자 근처-적외선 (NIR) 빛으로 갇힌 수입니다.

서문

유전 정보를 전달, 세포 핵 하나 가장 중요 한 세포의 subcellular 마약 배달 대상으로 유전자 복제의 이후 이며 식 암 등 다양 한 질병 치료에 효과적 이며 유전 장애^1,2,3. 약물의 핵 전달, 펩 티 드의 활용 태그 같은 핵 지 방화 신호 (NLS)^4,,56 광범위 하 게 조사 되었습니다. 그러나, 원치 않는 부작용을 줄이기 위해 핵 전 좌의 spatiotemporal 제어 필요 하다.

이전, 빛-트리거 전 좌 단백질의 세포 핵에 갇힌된 NLS^7,,89를 사용 하 여 달성 되었습니다. NLS 세포질 수송 단백질⁶에 바인딩하여 세포 핵으로 마이그레이션합니다. 보고 방법에 갇힌된 NLS 베어링 이용 단백질 직접 microinjection⁸ 세포질에 통합 또는 유전자 코드 확장 기법⁹를 사용 하 여 대상 셀에 표현. 따라서, 세포질 통풍 관 및 사진 유도 핵 전 좌를 얻을 수 있는 방법을 실용적인 응용 프로그램에 대 한 유리 하다.

여기, 우리 수지상 갇힌된 분자 접착제 (^{우리에 갇힌}접착제-R, 그림 1) 태그를 사용 하 여 살아있는 세포에서 핵 전 좌 빛 트리거 설명 합니다. 수용 성 분자 접착제^{10,11,12,13,14,15,16,,1718 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23} 여러 번⁺ 펜 던 트 베어링 이전 개발 되었습니다는 단단히 단백질^{11,12,13,,1415, 준수 16,17}, 핵 산^18,,1920, 인지질 막²¹및 찰 흙 nanosheets^22,23 통해는 그들의 구⁺ 펜 던 트 및 대상에 oxyanionic 그룹 사이의 여러 염 다리의 형성. ^{우리에 갇힌}접착제-R의 구⁺ 펜 던 트 음이온 photocleavable 그룹, 낙 산 염 대체 nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC)에 의해 보호 됩니다. ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그로 손님을 생활 고려 통해 endocytosis 및 endosomes (그림 2)에서 세포. Photoirradiation에 ^바NVOC 그룹의 ^{우리에 갇힌}접착제-R는 uncaged 분자 접착제 (^Uncaged접착제-R) 여러 번⁺ 펜 던 트를 들고 다음 태그 이용의 마이그레이션을 용이 하 게 하를 떨어뜨려합니다 에 세포질 세포 핵 (그림 2)에 의해 따라. ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그는 UV 또는 심각한 phototoxicity 없이 2 광자 근처-적외선 (NIR) 빛에 노출에 의해 갇힌 수입니다. 양자 점 (QDs) 및 형광 염료 (nitrobenzoxadiazole;를 사용 하 여 ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그, 작은 분자의 손님 뿐만 아니라 고분자 손님 spatiotemporally 제어 핵 전달 설명 NBD), 예제로 각각.

^{우리에 갇힌}접착제-R.의 도식 구조를 그림 1: 9 guanidinium 이온 (⁺번) 펜 던 트 ^{우리에 갇힌}접착제-R의 낙 산 염 대체 nitroveratryloxycarbonyl (^BANVOC) 그룹에 의해 보호 됩니다. ^BANVOC 그룹은 UV 또는 2 광자 NIR 빛 조사에 의해 죽 습. ^{우리에 갇힌}접착제-R의 초점 핵심은 공업화 nitrobenzoxadiazole (NBD) 또는 dibenzocylooctyne (DBCO). 참조²⁰허가 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 고객님의 핵 전 좌 빛 발생의 개요 그림 ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그 활용. 손님이^{우리에 갇힌}접착제-R 공액 생활으로 채택 / 셀 통해 endocytosis. Photoirradiation에 ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그는 태그의 endosomal 탈출을 용이 하 게 수 한 ^Uncaged접착제-R 태그를 감 금. 그 후, 태그 이용 세포 핵으로 마이그레이션합니다. 참조²⁰허가 매 판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

프로토콜

1. 준비 ^갇힌접착제-R와 함께 고객님의 태그

1. ^{우리에 갇힌}접착제 NBD 솔루션을 준비 합니다.
   1. ^{우리에 갇힌}접착제-NBD (그림 1) 다음 절차를 앞에서 설명한²⁰음성 합성.
   2. ^{우리에 갇힌}접착제-NBD (10mm) 건조 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)에서 재고 솔루션을 준비 합니다.
      참고: 어둠 속에서 재고 솔루션을 저장 합니다. 솔루션은 수성 버퍼 또는 셀 문화 미디어 사용 시 희석 수 있습니다.
2. ^{우리에 갇힌}접착제-qd는 솔루션을 준비 합니다.
   1. ^{우리에 갇힌}접착제-dibenzocylooctyne (^{우리에 갇힌}접착제-DBCO)를 합성 (그림 1)²⁰을 설명한 이전 절차에 따라.
   2. ^{우리에 갇힌}접착제-DBCO (10 mM) 건조 DMSO에의 재고 솔루션을 준비 합니다.
   3. ^{우리에 갇힌}접착제-QD의 준비를 위해 먼저 아 지 드 기능성된 QDs (아 지 드-QD; 준비 그림 3)입니다. DMF의 400 µ L를 100 µ L 아 지 드-PEG4-NHS 에스테 르 (그림 3)의 디 메 틸 formamide (DMF, 125 µ M) 솔루션의 추가 (500 nM) 아민 기능성된 페그 (아민-QD; 코팅 양자 점 (QDs)의 솔루션 그림 3)입니다. 실 온에서 1 h에 대 한 혼합물을 저 어.
   4. 재생된 셀 룰 로스 막 3500 분자량 컷오프 (MWCO)와 함께 사용 하 여 DMF의 800 mL에 대 한 24 시간에 대 한 결과 솔루션 dialyze
   5. ^{우리에 갇힌}접착제-DBCO 50 µ m와 DMF의 재고 솔루션을 희석. 포스트 투 석 해결책 (그림 3)에 솔루션의 200 µ L을 추가 하 고 실 온에서 3 h에 대 한 혼합물을 저 어.
   6. 재생된 셀 룰 로스 멤브레인 (25000 MWCO)를 사용 하 여 DMF의 800 mL에 대 한 24 시간에 대 한 결과 솔루션 dialyze
   7. 200 결과 솔루션을 희석 DMF nM.

그림 3: ^{우리에 갇힌}접착제-QD의 준비의 회로도 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 현미경 관찰 Hep3B 세포 샘플의 준비

1. 이 글의 최소한의 필수 매체 (EMEM) 포함 하는 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 37 ° C에서 5% 미만에서 인간의 간세포 암 Hep3B 세포 유지 CO₂.
2. 씨 셀 실험 전날입니다. EMEM에 8 연 발 유리 기판의 당 씨 5.0 × 10³ Hep3B 세포 (10 %FBS, 200 µ L), 37 ° C에서 5%에서 셀 샘플을 품 어 고 24 h에 대 한 CO₂ .
3. 문화 매체를 제거 하 고 Dulbecco의 인산 염 버퍼 식 염 수 (D-PBS)의 100 µ L로 셀 샘플을 두 번 씻어.

3. 자외선에 의해 발생 하는 작은 분자 손님의 핵 전 좌의 관찰

1. 포함 하는 ^{우리에 갇힌}접착제 NBD FBS 무료 EMEM의 200 µ L로 셀 샘플 (2.3에서 준비 단계)를 공급 (10 µ M) 고 37 ° C에서 5%에서 결과 셀 샘플을 품 어 3 h의 CO₂ .
   참고: 셀 샘플 FBS 무료 EMEM 4 h 이상에서 부 화는 심각한 세포 손상이 발생합니다.
2. 문화 매체를 제거 하 고 D-PBS의 100 µ L로 셀 샘플을 두 번 씻어.
3. endosomes의 시각화에 대 한 EMEM의 200 µ L로 셀 샘플을 공급 (10 %FBS) 빨간색 형광 염료를 포함 (예를 들어, LysoTracker 빨강, 100 nM), 고 37 ° C에서 결과 셀 샘플을 품 어 미만 5% CO₂ 20 분에 대 한 제거는 문화 매체, 그리고 린스 100 µ L D-PBS의 두 번으로 셀 샘플. EMEM의 200 µ L로 셀 샘플을 공급 (10 %FBS).
4. ^{우리에 갇힌}접착제 NBD의 핵 전 좌, UV 2 분 통해 365 nm 대역 통과 필터를 갖춘 100 W 크 세 논 광원을 사용 하 여 광섬유에 빛을 셀 샘플을 표시 합니다. UV 노출 없이 참조 셀 샘플을 어둠 속에서 셀 샘플을 계속.
   참고: 유리 기판의 뚜껑 수 수 이륙 효율적인 자외선 노출에 대 한. 자외선에 장기간 노출은 세포에 세포 독성을 일으킬 수 있습니다.
5. 핵의 시각화에 대 한 문화 매체에 Hoechst 33342 (1 mg/mL)의 1 µ L을 추가 하 고 37 ° C에서 5%에서 결과 셀 샘플을 품 어 10 분 CO₂ .
6. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 셀 샘플을 주제 및 488에서 여기에 현미경을 기록 nm (λ_obs = 500-530 nm), 543 nm (λ_obs = 565-620 nm), 및 710 nm (2-광자; Λ _obs = 390-465 nm) NBD, 레드-형광 염료, Hoechst 33342, 각각.

4. 2 광자 NIR 빛에 의해 발생 하는 작은 분자 손님의 핵 전 좌의 관찰

1. 포함 하는 ^{우리에 갇힌}접착제 NBD FBS 무료 EMEM의 200 µ L로 셀 샘플 (2.3에서 준비 단계)를 공급 (10 µ M) 고 37 ° C에서 5%에서 결과 셀 샘플을 품 어 3 h의 CO₂ .
2. 문화 매체를 제거 하 고 D-PBS의 100 µ L로 셀 샘플을 두 번 씻어. EMEM의 200 µ L로 셀 샘플을 공급 (10 %FBS).
3. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 셀 샘플을 주제로 하 고 기록 488에서 여기에 현미경 nm (λ_obs = 500-530 nm).
4. ^{우리에 갇힌}접착제 NBD의 핵 전 좌를 위해 비추는 2 광자 여기 레이저의 셀을 포함 하는 지역 (710 nm), 2 분 (30 s × 4) 현미경에서 광원으로 설치. 4.3 단계에서 설명한 대로 전 좌를 관찰 합니다.

5. 자외선에 의해 발생 하는 고분자 손님의 핵 전 좌의 관찰

1. FBS-무료 EMEM 포함 하는 ^{우리에 갇힌}접착제-QD의 200 µ L로 셀 샘플 (2.3에서 준비 단계)를 공급 (10 nM), 고 37 ° C에서 5%에서 결과 셀 샘플을 품 어 3 h의 CO₂ .
2. 문화 매체를 제거 하 고 D-PBS의 100 µ L로 셀 샘플을 두 번 씻어. EMEM의 200 µ L로 셀 샘플을 공급 (10 %FBS).
3. ^{우리에 갇힌}접착제-QD의 핵 전 좌, UV 2 분 통해 365 nm 대역 통과 필터를 갖춘 100 W 크 세 논 광원을 사용 하 여 광섬유에 빛을 셀 샘플을 표시 합니다. UV 노출 없이 참조 셀 샘플을 어둠 속에서 셀 샘플을 계속.
4. 핵의 시각화에 대 한 문화 매체에 Hoechst 33342 (1 mg/mL)의 1 µ L을 추가 하 고 37 ° C에서 5%에서 결과 셀 샘플을 품 어 10 분 CO₂ .
5. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 검사 법을 셀 샘플을 주제로 하 고 405에서 여기에 현미경을 기록 nm (λ_obs = 430-520 nm) 및 488 nm (λ_obs = 625-680 nm) Hoechst 33342 및 QDs, 각각.

6. 세포 생존 능력 분석 실험

1. EMEM에 있는 인간 간세포 암 Hep3B 세포 유지 (10 %FBS) 37 ° c 미만 5% CO₂.
2. 씨 셀 실험 전날입니다. EMEM에서 96 잘 문화 접시의 당 씨 5.0 × 10³ Hep3B 세포 (10 %FBS, 200 µ L), 37 ° C에서 5%에서 셀 샘플을 품 어 고 24 h에 대 한 공동₂ .
3. 문화 매체를 제거 하 고 D-PBS의 100 µ L로 셀 샘플을 두 번 씻어.
4. ^{우리에 갇힌}접착제 NBD를 포함 하는 FBS 무료 EMEM의 200 µ L로 셀 샘플을 공급 (0.1-100 µ M)와 37 ° C에서 5%에서 결과 셀 샘플을 품 어 3 h의 CO₂ .
5. 노출 셀 샘플을 통해 2 분에 대 한 자외선 365 nm 대역 통과 필터를 갖춘 100 W 크 세 논 광원을 사용 하 여 광섬유. UV 노출 없이 유사한 셀 샘플, 어둠 속에서 셀 샘플을 계속.
6. 문화 매체에 셀 계산 키트-8 시 (10 µ L)의 10 µ L을 추가 하 고 37 ° C에서 5%에서 결과 셀 샘플을 품 어 2 h의 CO₂ .
7. 흡수 분광학을 세포 샘플 제목 (λ = 450 nm) microplate 리더를 사용 하 여.

결과

Photoirradiation, 전에 ^{우리에 갇힌}접착제 NBD와 incubated Hep3B 세포 전시 그들의 내부에서 punctate 형광 방출 (λ_ext = 488 nm; 그림 4A 고 4 C, 녹색). 유사한 현미경 사진 543에서 여기에 얻은 ^{우리에 갇힌}접착제 NBD는 endosomes에 지역화 나타내는 빨간색 형광 염료 (그림 4B , 4c, 빨간색)에 대 한 ...

토론

빛-트리거 전 좌 단백질의 세포 핵으로의 이전 조사 갇힌된 NLS^7,,89를 사용 하 여 달성 되었습니다. 앞에서 설명 했 듯이, 이러한 방법을 세포질에 NLS 태그 단백질 통합을 추가 기술 해야 합니다. 반면, 우리의 ^{우리에 갇힌}접착제-R 태그 사진 유도 핵 전 좌 뿐만 아니라 손님 들의 세포질 통풍 관을 수 있습니다. 이 ^우?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Azide-PEG4-NHS ester	Click Chemistry Tools	AZ103
Q-dot 655 ITK	Invitrogen	Q21521MP
Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500)	NIPPON Genetics	TOR-3K
Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000)	Harvard Apparatus	7425-RC25K
Hep3B Cells	ATCC	HB-8064
8-chambered glass substrate	Nunc	155411JP
96-well culture plate	Nunc	167008
Eagle's minimal essential medium (EMEM)	Thermo Fisher Scientific	10370-021
Fetal bovine serum (FBS)	GE Healthcare	SH30406.02
Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS)	Wako Pure Chemical Industries	045-29795
LysoTracker Red	Lonza Walkersville	PA-3015
Hoechst 33342	Dojindo	H342
Cell Counting Kit-8	Dojindo	CK04
Confocal laser scanning microscope	Carl-Zeiss	LSM 510	Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics)
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP8
Xenon light source	Asahi Spectra	LAX-102
Microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax Paradigm