Un protocolo de Rhizobox optimizada para visualizar el crecimiento de las raíces y la capacidad de respuesta a nutrientes localizadas

Resumen

Visualización y medición del crecimiento de raíz en situ es extremadamente difícil. Se presenta un método rhizobox personalizable para seguir el desarrollo de la raíz y proliferación en el tiempo en respuesta al enriquecimiento de nutrientes. Este método se utiliza para analizar maíz diferencias genotípicas en la plasticidad de la raíz en respuesta a una fuente de nitrógeno orgánico.

Resumen

Las raíces son notoriamente difíciles de estudiar. El suelo es una barrera visual y mecánica, lo que hace difícil rastrear raíces en situ sin cosecha destructiva o equipo costoso. Presentamos un método rhizobox personalizable y asequible que permite la visualización no destructiva de crecimiento de las raíces en el tiempo y está particularmente bien adaptado al estudio de la plasticidad de la raíz en respuesta a parches de recursos. El método se validó mediante la evaluación de maíz variación genotípica en las respuestas de plasticidad a parches que contienen residuos de leguminosa marcado con N ¹⁵. Métodos se describen para obtener mediciones representativas de desarrollo en el tiempo, medir la densidad de longitud de raíz en parches que contienen el recurso y el control, calcular las tasas de crecimiento de la raíz y determinar recuperación de ¹⁵N por la planta raíces y brotes. También se discuten las posibles aplicaciones futuras del método, ventajas y advertencias. Aunque debe tenerse cuidado para asegurar que las condiciones experimentales no sesgar los datos de crecimiento de raíz, el protocolo de rhizobox presentado produce resultados confiables si lleva a cabo con suficiente atención al detalle.

Introducción

Aunque a menudo pasado por alto en comparación con sus contrapartes sobre tierra, las raíces juegan un papel crítico en la adquisición de nutrientes de plantas. Dado el coste de carbono substancial de raíz construcción y mantenimiento, las plantas han desarrollado mecanismos para desarrollar raíces sólo forraje es donde vale la pena la inversión. Sistemas de la raíz puede así eficiente y dinámica de la mina parches de recursos por proliferación de hotspots, regular las tasas de absorción y nutrientes rápidamente translocan al floema para más transporte¹. Respuestas de plasticidad pueden variar ampliamente entre planta especies o genotipos^2,3 y dependiendo de la forma química de los nutrientes implicados^4,5. Variación en la plasticidad de la raíz se debe explorar más lejos, como entender las respuestas de la raíz compleja para recursos de suelos heterogéneos podrían informar a reproducción y estrategias de gestión para aumentar la eficiencia de uso de nutrientes en la agricultura.

A pesar de su necesidad y relevancia para los sistemas de la planta de comprensión, visualización y cuantificación de la plasticidad de la raíz a escalas relevantes plantea desafíos técnicos. Excavación de la corona de la raíz de la tierra ("shovelomics"⁶) es un método común, pero raíces finas explotan pequeños poros entre agregados de suelo y excavación conduce inevitablemente a un cierto grado de pérdida de estas raíces frágiles. Además, cosecha destructiva hace imposible seguir los cambios en un sistema de raíz en el tiempo. In situ métodos imagenológicos como la tomografía computarizada de rayos x permiten la visualización directa de los recursos de suelo y raíces en la alta resolución espacial⁷, pero son costosos y requieren de equipo especializado. Experimentos de cultivo hidropónicos evitar limitaciones relacionadas con la extracción de raíces del suelo, pero arquitectura y morfología de la raíz se diferencian en medios acuosos con respecto a las limitaciones mecánicas y Biofísica complejidad de suelos^8,9. Finalmente, funciones y procesos de la rizosfera pueden integrarse con plasticidad del desarrollo en estos medios artificiales.

Presentamos un protocolo para la construcción y uso de rhizoboxes (contenedores rectangulares estrechas, cara claro) como un método de bajo costo, adaptable para caracterizar el crecimiento de la raíz en el suelo con el tiempo. Marcos diseñados especialmente fomentan raíces crecer preferentemente contra la parte trasera debido al Gravitropismo, aumentar la precisión de las mediciones de longitud de raíz. Rhizoboxes se utilizan para estudiar el crecimiento de las raíces y rizosfera interacciones^10,11,12, pero el método presentado aquí ofrece una ventaja en la simplicidad con su diseño del solo-compartimiento y barato materiales y está diseñado para estudiar las respuestas de la raíz a los nutrientes localizadas. Sin embargo, el método también podría ser adaptado para el estudio de una variedad de otros procesos como la competencia intra/intraespecífica raíces y rizosfera, distribución espacial de la actividad enzimática, compuestos químicos y microbios. Aquí, se investigan las diferencias genotípicas entre híbridos de maíz en respuesta a parches de ¹⁵leguminosas marcados con N residuos y resaltar resultados representativos para validar el método de rhizobox.

Protocolo

1. elaboración de los separadores, frontal y traseras

1. Preparar los paneles delanteros y traseros.
   1. Corte dos pedazos de acrílico grueso claro 0,635 cm a 40,5 cm de ancho por 61 cm de largo por caja o comprar piezas pre-cortadas (véase Tabla de materiales).
   2. Usando una broca de taladro diseñada para acrílico, perforaciones de 0,635 cm de diámetro de 1,3 cm de los bordes laterales en 2.5, 19, 38 y 53,3 cm desde la parte superior. Perfore agujeros de 1,3 cm desde el borde inferior en 2.5, 20.3 y 38 cm desde el lado izquierdo (figura 1).
      Nota: Es más eficiente usar un taladro para una pila de hojas de seis a diez en un momento, pero también se puede utilizar un taladro de mano.
   3. Quitar cualquier revestimiento protector de acrílico y limpiar suavemente los paneles antes de montar las cajas.

Figura 1: distribución de orificios perforados. Los agujeros son perforado 1,3 cm de los bordes laterales en 2.5, 19, 38 y 53,3 cm de la tapa y 1,3 cm desde el borde inferior en 2.5, 20.3 y 38 cm desde el margen izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparar a los espaciadores laterales e inferiores.
   1. Corte tres espaciadores por caja de polietileno de alta densidad (HDPE) o compra dos distanciadores laterales corta (0,635 cm de espesor, ancho 2,5 cm, 57 cm de largo) y parte inferior corta un espaciador (0,635 cm de espesor, 40,5 cm de largo y 2,5 cm de ancho). Consulte la tabla de materiales.
   2. Alinee a los separadores entre los paneles anterior y posterior a lo largo de los lados y la parte inferior de la caja. Usando un taladro de mano o taladro, perfore los orificios existentes en el frente y detrás otra vez para que los orificios de pasan a través de las tres capas limpiamente.
   3. Mantenga las capas colocar con pinzas o mediante la instalación de una combinación de tornillos, tuercas y arandelas en cada recién perforado agujero (ver paso 3.1).

2. instalación de una tira de guata de poliéster en la parte inferior de la caja

Nota: Esto evitará que suelo y el agua se filtre a través de las uniones entre los espaciadores.

1. Corta poliester bateo en 2,5 cm de ancho por tiras de 40,5 cm de largo (véase la Tabla de materiales).
2. Con la parte trasera plana y los separadores en la parte superior de la mentira, ponen el bateo directamente sobre el separador de la parte inferior y sujetarlo con el panel superior (figura 2).

Figura 2: ensamblado rhizobox con bateo de. Una estrecha franja de bateo en la parte inferior de la rhizobox evita que escaparse hacia fuera el suelo y arena. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. montaje de la Rhizoboxes

1. Montar el rhizoboxes con tornillos de hilo 20 (3,2 cm de longitud por 0,635 cm de diámetro), arandelas (0,635 cm de diámetro interno) y las tuercas hexagonales (de tamaño para ajustar los tornillos, véase Tabla de materiales.
2. Apriete cada tornillo a través de una arandela, panel frontal, espaciador, panel trasero, arandela y tuerca hexagonal. Asegúrese de que los tornillos estén muy apretados; Si la caja está montada libremente, el suelo se derramará a través de espacios entre los paneles y los espaciadores laterales.
   Nota: Acrílico se rasguña fácilmente, y los rasguños pueden interferir con las mediciones de root, así manejar las cajas ensambladas con cuidado. Evite apilables cajas a menos que el material de protección se coloca entre ellos.
3. Preparar a dos espaciadores de parche (espaciadores que se utilizará para crear los parches de tratamiento y control) por caja. Cortar a los espaciadores de polietileno de alta densidad (HDPE) hojas o comprarlas precortadas (espesor 0,635 cm, 3,8 cm de ancho, 28 cm de largo; véase Tabla de materiales). Taladre un agujero de 0,635 cm de diámetro en cada separador, 2 cm de la tapa a lo largo de la línea media (figura 3).

Figura 3: parche espaciadores. Tornillos a través de las tiras del centro de HDPE mantienen caiga en la caja. El rhizobox se llena con tierra alrededor de los espaciadores, el suelo se humedece y los separadores se eliminan para dejar vacíos parches de tratamiento y control. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Fije un tornillo con una tuerca de cada para que el espaciador puede introducirse parcialmente en el rhizobox hasta que el tornillo le impide ir más lejos (figura 3).
   Nota: Cuando el suelo es humedecido por los espaciadores y los separadores se eliminan, seguirán siendo dos espacios vacíos pueden llenarse con los sustratos apropiados para la revisión de tratamiento que contienen nitrógeno y parche de control.

4. edificio PVC marcos para apoyar la Rhizoboxes en un ángulo

Nota: Cuando la caja se coloca en un ángulo, Gravitropismo animará a las raíces para crecer contra la parte trasera para que todas las raíces son visibles para el seguimiento. El cloruro de polivinilo (PVC) dimensiones en figura 4 resultado en un marco que mantiene el rhizobox en un ángulo aproximado de 55 ° en el Banco.

1. 13 piezas de 1,3 cm de diámetro PVC por la caja de corte: 2 × 44 cm longitud, 3 tiras de cm × 42, 2 tiras de x 36,3 cm, 2 tiras de × 25.4 cm y 4 tiras de × 3.8 cm (véase Tabla de materiales).
   Nota: Una tronzadora es altamente recomendado para eficiencia y cortes incluso.
2. Use codos de 2 vías de 4 ×, 2 × 3 vías codos y uniones en T 4 (véase Tabla de materiales) para montar la caja como se muestra en la figura 4.
   Nota: Los marcos deben ser estables sin pegamento adicional, pero el pegamento del PVC se puede utilizar si es necesario.

Figura 4: estructura para apoyar rhizoboxes. La ligera montura está hecha de PVC cortado a la longitud especificada y conectado mediante el tipo conjunto indicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. coser fundas protectoras para reflejar la luz y el calor

Nota: Raíces evitar luz, así que estos casos excluyen la luz para asegurarse de que observó las respuestas de plasticidad de raíz son conducidas por la fuente de nutrientes en los parches y no por evitar la luz. Tela ligera privación también reduce la temperatura interior de la rhizoboxes, ayudando a evitar el estrés por calor.

1. Cortar la tela de la privación de luz (material especializado que es blanco por un lado y negro por el otro) en piezas aproximadamente 95 cm de ancho y 69 cm de largo (véase Tabla de materiales). Se requiere una sola pieza por caja.
2. Doblar cada pieza por la mitad a lo largo del borde largo para formar una manga de 47,5 cm x 69 cm. Utilizando una aguja de máquina de coser para dril de algodón, hilo de acolchar resistente y una costura estrecha, coser a lo largo de la parte inferior y 3/4 de la vía por el lado de la manga. Prender las esquinas superiores con un perno de seguridad.

6. preparación de suelo 1:1 (V/V): sustrato para llenar las Rhizoboxes de arena

1. Recoger aproximadamente 1.000 cm³ de suelo de campo (desde el sitio de interés) por la caja. Secar el suelo a peso constante en bandejas poco profundas a 60 ° C.
   Nota: Suelo para este experimento fue recogida inmediatamente después de la cosecha en un campo de maíz orgánico administrados de 0\u201210 cm de profundidad.
2. Moler el suelo con un mortero y una maja para pasar a través de un tamiz de 2 mm. Medir la densidad aparente del suelo pesando un volumen conocido de suelo.
3. Obtener la arena (como la arena de juego, que económicamente puede comprarse en una ferretería; véase Tabla de materiales) y medir la densidad a granel.
4. Medir volúmenes iguales de arena y tierra en un recipiente y mezclar bien. Utilice un embudo para llenar la caja lenta y uniformemente a 2,5 cm desde la parte superior, sin agitar la caja para hacer el sustrato a colocar. Medir este volumen del sustrato; debe ser aproximadamente de 1.272 cm³.
5. Multiplicar la densidad aparente de la arena por mitad de este volumen para obtener la masa de la arena necesaria para cada caja. Hacer lo mismo con la densidad aparente del suelo para obtener la masa de suelo necesaria para cada caja.
   Nota: Para el suelo del campo y arena utilizados en este experimento, este era 976 g de arena y 774 g de suelo, pero estas cantidades variarán dependiendo de la densidad aparente del suelo utilizado.
6. Etiqueta un gran plástico bolsa por rhizobox pesar las masas apropiadas de arena y tierra en la bolsa y homogeneizar bien.
7. Analizar este tipo de suelo 1:1- y sustrato para contenido de nutrientes y la abundancia natural de ¹⁵N (δ¹⁵N).

7. sustrato preparación para el tratamiento y revisiones de Control

1. Dos pequeños zip-top bolsas de plástico por rhizobox, uno para el parche de tratamiento y uno para el parche de control de la etiqueta. Pesar 30 g de suelo: arena de sustrato de cada bolsa grande (paso 6.6) en las dos bolsas pequeñas correspondientes.
2. Mezclar el sustrato con una fuente de nitrógeno marcado con N ¹⁵para el parche de tratamiento. Para esto, pesar 1 g de residuos de planta marcada con N ¹⁵u otra fuente de N (la cantidad se puede ajustar como deseado) en cada bolsa de tratamiento (pequeña bolsa) y mezclar bien.
   Nota: Para este experimento, se utilizó una mezcla de ¹⁵trébol marcado con N y el residuo de la vicia. Semillas de trébol y vicia fueron plantadas en una mezcla 1:1 de arena y vermiculita y cultivadas bajo condiciones de invernadero. Las plantas fueron regadas diariamente con agua desionizada y dos veces por semana con la fuerza de 1/100 de Long Ashton solución¹³ que contiene fuentes de nitrógeno marcado con N ¹⁵. Toda biomasa aérea se cosechó en cuatro semanas después de la siembra, secada y molida para pasar por un tamiz de 2 mm. Si se elige un alimento diferente, especialmente si ese elemento es móvil en el suelo, experimentos piloto para probar la lixiviación se anima. Formas de liberación lenta de nutrientes podrían ser utilizadas o un diseño de rhizobox diferente podía ser elegido para restringir la lixiviación (por ejemplo, en compartimientos separados¹⁰) si es necesario.

8. Rhizobox con el sustrato y establecer el tratamiento y Control de carga parches

1. Pesan cada rhizobox vacío y registrar los pesos para su uso posterior.
2. Inserte a dos espaciadores de parche (ver paso 3.2) en un rhizobox hasta que el tornillo se les impide ir más allá. Marcar la profundidad de la parte inferior con una marca de luz en el lado de la rhizobox (figura 3) y retire a los espaciadores.
3. Usando un embudo con una abertura de madre que es tan estrecho como la apertura de rhizobox, llenar el rhizobox de la correspondiente bolsa grande de sustrato a la profundidad marcada. Mover el embudo hacia adelante y hacia atrás lentamente y uniformemente para que el sustrato llena uniformemente y no crear canales de flujo preferencial.
4. Cuando el sustrato alcanza la profundidad marcada, coloque a los espaciadores en 5 cm de cada lado de la caja. Continúe llenando el cuadro hasta que el nivel de sustrato aproximadamente 5 cm de la parte superior de la caja (debe ser substrato restante en la bolsa).
5. Moje bien alrededor de cada espaciador.
   Nota: En este experimento, esto se logró mediante la entrega de 50 mL de agua a través de emisores de goteo insertado entre el borde externo de cada espaciador y el lado de la rhizobox, verter 50 mL de agua entre los dos espaciadores. Riego lento es necesario para humedecimiento uniforme.
6. Retire a los espaciadores mientras el suelo está húmedo, dejando una cavidad vacía para los parches.
7. Una película de transparencia hacia el exterior de cada rhizobox de la cinta (véase Tabla de materiales). Marque un lado como tratamiento y como control y llenar los parches de las bolsas apropiadas utilizando el embudo. Trazar los límites de cada mancha en la transparencia con marcador permanente.
8. Se llenan lo rhizobox uniformemente el sustrato restante. Seguimiento de la parte superior del sustrato en la transparencia.
9. Repita para el resto rhizoboxes. Guardar todas las bolsas para cosecha.

9. incluso de riego 60% capacidad de retención de agua

Nota: Esta cantidad de humedad del suelo se encontró para evitar que las plantas experimentan sequía mientras que previene el desarrollo de condiciones anóxicas o crecimiento de las algas.

1. Medir la capacidad de retención de agua (WHC) del sustrato¹⁴.
2. Calcular el peso ideal de cada caja; Aquí se define como la suma del peso de la rhizobox vacío combinado con el peso del sustrato en el 60% de capacidad de retención de agua.
3. Multiplicar el WHC (gramos de agua / g de sustrato seco) por 0,6 para obtener la masa de agua llevó a cabo en el sustrato 60% CPM. Añadir esta masa a la masa de sustrato seco y la masa de la fuente ¹⁵N.
4. Añadir el peso vacío de cada caja al número obtenido anteriormente.
5. Pesar las cajas una vez que han sido llenados. Restar el peso de cada caja (en g) en este punto de su peso ideal (en g) calculado en el paso 9.2. Este volumen (en mL) de agua desionizada (DI) agua lentamente y uniformemente.
   Nota: Este paso puede hacerse utilizando riego por goteo o riego a mano. Si riego a mano, deje que el agua infiltre completamente antes de añadir más para evitar canales de flujo preferencial y las condiciones de humedad de suelo heterogéneo.

10. germinación y trasplante de semillas

1. Si utiliza controles, apartar los rhizoboxes.
2. Superficie-esterilizar semillas de maíz removiendo 1 minuto en el 5% de NaOCl, después enjuague bien en agua desionizada.
   Nota: En este experimento, se utilizaron semillas de seis diferentes genotipos de maíz para investigar diferencias genotípicas en la plasticidad de la raíz.
3. Germinar semillas esterilizadas colocándolos sobre un tejido de laboratorio húmedo (por ejemplo, Kimwipe) adentro platos de Petri y cubriendo con otro paño húmedo. No debe ser cualquier agua estancada. Lugar de Petri en un lugar oscuro para 48\u201272 h hasta que la radícula apenas comienza a emerger.
4. Use una espátula estrecha para cavar un agujero de 2,5 cm de profundidad en el centro de cada rhizobox. Trasplante de una semilla germinada en el agujero, asegurando que la radícula está orientada directamente hacia abajo.
   Nota: Si la radícula es inclinarse hacia cualquiera de los dos patch, la comparación de las tasas de crecimiento de la raíz será parcial.
5. Rastrear la ubicación de la semilla en la transparencia.
6. Cubra la semilla y el agua con hasta 50 mL de agua desionizada.

11. las plantas crecimiento

1. Cultivar plantas durante 25 días (o tan largo como se desee), manteniendo 60% CPM durante el período de crecimiento. Controlar el crecimiento de las raíces rastreando las raíces.
2. Pesar cada caja todos los días de 3\u20124 y agua hasta que quede de 5 g de su peso ideal. Interrumpir el riego de la rhizoboxes cuatro días antes de la cosecha para facilitar la separación de los paneles. Eliminar las malas hierbas a mano con frecuencia para que sólo las raíces de plantas de interés están presentes.
3. Traza las raíces visibles cada días de 3\u20124 con un marcador permanente colores claramente distinguibles para cada día de seguimiento.
   Nota: Marcadores de diferente diámetro pueden utilizarse para las raíces primarias y laterales, si lo desea. Puede ser útil para definir criterios para el seguimiento de raíz desde el principio puesto que un grado de subjetividad está implicado, especialmente si varios investigadores serán raíces de seguimiento o si las raíces de diferentes órdenes o diámetro deben ser distinguidos con diferentes marcadores. En este experimento, la precisión de rastreo raíces visibles en sólo un lado de la caja fue probada por remontar las raíces visibles en ambos lados y comparar la longitud de la raíz total medido en las transparencias escaneadas a la longitud de la raíz total medido por lavado y exploración de las raíces. La correlación entre la longitud de la raíz rastreado y analizado fue significativa si se utilizan sólo la transparencia posterior o ambas transparencias. Por lo tanto, es posible trazar sólo raíces visibles en la parte trasera.

12. cosecha de brotes y obtención de muestras de suelo y raíz para análisis

1. Pone la rhizobox primera plana y quitar todos los tornillos.
2. Las muestras de brotes de la cosecha. Clip de brotes en la base, enjuague la suciedad con agua desionizada y secar a 60 ° C. Dispara a moler con un mortero y una maja para pasar a través de un tamiz de 2 mm y pesan submuestras en cápsulas de estaño para análisis de isótopos (ver sección 14).
3. Utilizando la transparencia como guía, corte alrededor de los parches de tratamiento y control con una maquinilla de afeitar. Utilice una espátula o cuchara para sacar las raíces y el suelo de rizosfera adherentes en la respectiva bolsa de tratamiento o control.
   Nota: Mientras que muchos métodos existen para suelo de rizosfera separado el suelo bajo la influencia de la planta raíces¹⁵y la rizosfera se puede considerar un gradiente en lugar de una zona estrictamente delineada¹⁶, este método sigue el utilizado definición de suelo que se adhiere para sembrar raíces después de sacudir el¹⁷.
4. Primicia las restantes raíces y suelo en la tercera bolsa.
5. Pasar el tratamiento, control y a granel las muestras a través de un tamiz de 2 mm para separar raíces de sustrato, quitar cualquier raíces visibles o fragmentos > 1 cm de longitud con una pinza fina. Mantener estas muestras separadas entre sí por un total de tres raíces y tres muestras de sustrato.

13. validación de registros de encabezamientos secundarios y estimación de tasas de crecimiento relativo de la raíz

1. Tratamiento, control, la exploración y a granel las muestras y calcular la longitud de la raíz.
   1. Trabajando con una muestra a la vez, enjuague las raíces con cuidado con agua desionizada para eliminar cualquier sustrato restante. Colocar las muestras en una bandeja clara para que las raíces no se solapan.
   2. Análisis de muestras usando un escáner compatible con software de análisis de la raíz (por ejemplo, WinRhizo). Asegúrese de que el software está calibrado para distinguir confiablemente las raíces desde el fondo de la imagen.
   3. Utilice el software para medir la longitud de la raíz total y longitud de la raíz en las clases de interés (por ejemplo, < 0,2 mm, 0.2\u20120.4 mm, 0.4\u20120.8 mm, 0.8\u20121.6 mm, > 1,6 mm) de diámetro.
2. Calcular raíz longitud densidad (RLD) para tratamiento y control de los parches y para cada rhizobox en su conjunto.
   1. Calcular el volumen de tratamiento y control de revisiones multiplicando el área de trazado en cada transparencia (ver paso 8.1) por 0,635 cm, la profundidad de la caja. Utilizar esos volúmenes para calcular la densidad de longitud de raíz en el tratamiento y control parches usando la longitud total de la raíz en cada parche (ver paso 13.1.3).
      
   2. Calcular el volumen de sustrato en cada rhizobox multiplicando el área trazado sobre la transparencia (ver paso 8.1) de 0,635 cm. calcular RLD en cuanto a los parches de tratamiento y control.
      
3. Validar la raíz seguimiento método mediante la comparación de sistemas de la raíz explorados y localizar imágenes.
   1. Analizar cada transparencia y calcular la longitud total de la raíz utilizando el software. Guardar la imagen escaneada para el crecimiento de los cálculos del tipo.
   2. Suma las medidas de longitud de raíz total de tratamiento, control y a granel las muestras para cada caja (ver paso 13.1.3).
   3. Prueba las medidas digitalizadas y trazadas de longitud total de la raíz para ver si la correlación es estadísticamente significativa.
      Nota: Si es así, se valida el método de trazado, y las tasas de crecimiento relativo se pueden calcular en cada momento. Si no, sólo los datos de escaneado radicular proporcionan una indicación exacta del crecimiento de la raíz. Este sería el caso si la metodología de seguimiento era incompatible o si las raíces no eran igualmente accesibles para todos los genotipos, por ejemplo.
4. Si se validó el método de rastreo, calcular las tasas de crecimiento relativo de la raíz para cada rhizobox.
   1. Utilizar el software de análisis de raíz calibrado para distinguir entre los colores de trazo elegido para medir la longitud total de la raíz en el tratamiento, control y a granel las muestras en cada momento. Calcular la longitud de la raíz total acumulada en cada momento.
   2. Calcular las siguientes tasas de crecimiento relativo de la raíz (_raízRGR) para cada rhizobox, así en cuanto a tratamiento y revisiones de control para cada tiempo intervalo t₁-t₂ .
      
      Nota: Aquí L₁ es la longitud de la raíz total del parche (suma acumulada de 11.3) en los días de₁ t después del transplante (DAT) y L₂es la longitud de la raíz total del parche en t₂ DAT.

14. Análisis de ¹⁵N repartir entre raíz, brote y tratamiento de las muestras de suelo

1. Raíces seco a 60 ° C, peso de biomasa y la rutina para pasar por un tamiz de 2 mm.
2. Seco de submuestras de suelo, tratamiento a 60 º C.
3. Paquete de raíces y el tratamiento en cápsulas de estaño como con los brotes.
   Nota: Peso de la muestra Ideal por cápsula debe calcularse por separado para brotes, raíces y suelo basado en la estimada relación C/N del material para alcanzar la cantidad objetivo de N total para el análisis. Póngase en contacto con el centro de isótopos estables donde las muestras deben ser presentados para obtener más información. Para este experimento, la muestra peso calculadora proporcionada por la instalación de isótopo estable de UC Davis e instrucciones de preparación de la muestra fueron seguido¹⁸.
   PRECAUCIÓN: Tenga especial cuidado al mezclar muestras uniformemente antes del envasado en cápsulas y preparar varias cápsulas por muestra. Si las muestras no se mezclan uniformemente, recuperación aparente de ¹⁵N puede superar la cantidad originalmente presente.
4. Analizar N total, δ15 y ¹⁵N de contenidos de cada sesión, la raíz y la muestra de suelo de tratamiento.
   Nota: En este experimento, planta muestras fueron analizadas mediante combustión con un analizador elemental de PDZ Europa ANCA-GSL interconectado a un espectrómetro de masas PDZ Europa 20-20 isótopo cociente en la UC Davis estable isótopo (UCD SIF). Las muestras de suelo fueron analizadas con un analizador elemental Elementar Vario EL cubo interconectado a un PDZ Europa 20-20 isótopo cociente espectrómetro de masas en el SIF UCD.
5. Calcular la cantidad de ¹⁵N obtenida de la etiqueta en planta dispara y las muestras de raíz.
   1. En primer lugar, calcular la cantidad de ¹⁵N exceso atmosférica ¹⁵N en cada piscina, ¹⁵P *:
      
      donde ¹⁵P es el contenido de ¹⁵N en % atómico de la piscina de interés.
   2. En segundo lugar, calcular la cantidad de ¹⁵N exceso atmosférica ¹⁵N en la etiqueta, ¹⁵L *:
      
      donde ¹⁵L es el contenido de ¹⁵N en % atómico de la fuente N etiquetada.
   3. En tercer lugar, calcular la cantidad de N total en cada grupo, N_p:
      
      donde m_p es la masa de la piscina (por ejemplo, total disparar seca o biomasa de la raíz) y el %_p es el porcentaje de N de esa piscina.
   4. Finalmente, utilizar los resultados de 14.5.1\u201214.5.3 en el Ndff ecuación¹⁹ para calcular la cantidad de N obtenida de la etiqueta, N_l:
      
      Nota: La ecuación de Ndff se utiliza para determinar la cantidad de N de una fuente marcada que es recuperada por las plantas. Asume que no hay discriminación isotópica se produce durante la absorción de N por la planta y es generalmente válida para N fuentes enriquecido ~1\u201210%¹⁹.

Resultados

Las raíces crecieron preferentemente contra la parte trasera de la caja, según lo previsto. Longitud de la raíz trazado total en la parte posterior de la caja varió de 400 a 1.956 cm, en comparación con 93 758 cm en la parte frontal de la caja. Se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson pares entre la longitud de la raíz explorada y longitud de la raíz trazado en la parte frontal de la caja, la parte posterior de la caja, y la suma de la parte delantera y trasera se ...

Discusión

El rhizoboxes que se describe en este protocolo se puede utilizar para responder preguntas variadas en raíces y rizosfera y han encontrado diversas aplicaciones en otros lugares^{10,20,21,22,23 , 24 , 25}. otros investigadores han captado imágenes de Time-lapse de rhizoboxes^...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.27 cm diameter PVC pipe	JM Eagle	530048	305 cm per box, cut into lengths as specified in the protocol
PVC side elbows	Lasco	315498	2 per box
PVC 90-degree elbows	Charlotte	PVC 02300 0600	4 per box
PVC T joints	Charlotte	PVC 02402 0600	4 per box
Extruded acrylic panes	TAP Plastics	N/A	2 per box, 0.64 cm thick x 40.5 cm wide x 61 cm long
HDPE spacers (sides)	TAP Plastics	N/A	2 per box, 0.64 cm thick x 2.5 cm wide x 57 cm long
HDPE spacers (bottom)	TAP Plastics	N/A	1 per box, 0.64 cm thick x 2.5 cm wide x 40.5 cm long
HDPE spacers (patch)	TAP Plastics	N/A	2 per box, 0.64 cm thick x 3.8 cm wide x 28 cm long
Polyester batting	Fairfield	#A-X90	2.5 cm x 40.5 cm strip per box
20-thread screws	N/A	N/A	3.2 cm long, 0.64 cm diameter
Washers	N/A	N/A	0.64 cm internal diameter
Hex nuts	N/A	N/A	sized to fit the screws
Light deprivation fabric	Americover, Inc.	Bold 8WB26.5	1 piece 95 cm wide and 69 cm long per box
Sand	Quikrete	No. 1113
Field soil	N/A	N/A
Transparencies for tracing	FXN	FXNT1319100S	One per side of the box to be traced