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* Estos autores han contribuido por igual
Presentamos dos diversos protocolos de coloración para la detección del ligand de NKG2D (NKG2DL) en muestras agudas primarias humanas de la leucemia mieloide (AML). El primer enfoque se basa en una proteína de fusión, capaz de reconocer todos los ligandos conocidos y potencialmente desconocidos, mientras que el segundo protocolo se basa en la adición de múltiples anticuerpos anti-NKG2DL.
Dentro del mismo paciente, la ausencia de expresión superficial de los ligands de NKG2D (NKG2DL) fue mostrada para distinguir a subpoblaciones leucémicas con las propiedades de la célula de vástago (llamadas las células madres leucémicas, LSCs) de las células leucémicas de contrapartes más distinguidas que carecen de potencial de la iniciación de la enfermedad aunque lleven mutaciones genéticas específicas similares de la leucemia. NKG2DL son bioquímicamente muy diversas auto-moléculas tipo MHC clase I. Las células sanas en condiciones homeostáticas generalmente no expresan NKG2DL en la superficie celular. En cambio, la expresión de estos ligandos se induce tras la exposición al estrés celular (por ejemplo, transformación oncógena o estímulos infecciosos) para desencadenar la eliminación de las células dañadas a través de la lisis a través de células inmunes que expresan receptores NKG2D, como las células asesinas naturales (NK). Curiosamente, la expresión de la superficie de NKG2DL se suprime selectivamente en las subpoblaciones de LSC, lo que permite a estas células evadir la vigilancia inmune mediada por NKG2D. Aquí, presentamos un análisis de lado a lado de dos diversos métodos cytometry de flujo que permitan la investigación de la expresión superficial de NKG2DL en las células cancerosas es decir, un método que implica el reconocimiento del cacerola-ligand y un método que implica la coloración con los anticuerpos múltiples contra solos ligands. Estos métodos se pueden utilizar para separar las subpoblaciones celulares negativas viables de NKG2DL con supuestas propiedades de células madre cancerosas de NKG2DL positivo no LSC.
Las células NK son importantes efectoras del sistema inmune innato que pueden reconocer y eliminar células malignas o células sanas estresadas (por ejemplo, por una infección viral) sin estimulación previa deantígenos 1. Este proceso está estrechamente regulado a través de un complejo repertorio de receptores activadores —como los receptores naturales de citotoxicidad (NCR), NKG2D y CD16— y receptores inhibitorios que están representados en gran medida por receptores asesinos similares a inmunoglobulinas (KIRs)2. El atascamiento de KIRs a las moléculas humanas de la clase I del antígeno del leucocito (HLA) en las células somáticas asegura el auto-reconocimiento y transporta tolerancia de la célula de NK. Por otro lado, la ausencia de auto-reconocimiento y el aumento de la unión de los receptores activadores a sus ligandos en las células diana desencadenan la liberación de gránulos citotóxicos que conducen a la citotoxicidad mediada por células NK1. Finalmente, las células NK pueden ejercer citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mediante la unión del receptor activador CD16 a dianas que expresan la porción Fc de Ig(FcR)2. Aparte de la citotoxicidad directa, las células NK también pueden desencadenar la liberación de citoquinas que unen lo innato con el sistema inmune adaptativo3.
NKG2D es un importante receptor activador expresado en NK, NKT, γδ T, y las células T CD8 +ingenuas 4 que permite a tales células inmunes citotóxicas reconocer y lise NKG2D ligando (NKG2DL) que expresan las células diana. Las células sanas comúnmente no expresan NKG2DL. En cambio, la expresión de NKG2DL se regula al alza en células malignas o infectadas por virus para que estas sean susceptibles de aclaramiento inmunológico5.
La familia humana NKG2DL comprende ocho moléculas conocidas entre las cuales las dos moléculas relacionadas con la cadena MHC I A y B (MICA y MICB6)y las proteínas de unión al citomegalovirus UL16 1-6 (ULBP1-67). La expresión de NKG2DL está regulada tanto en los niveles transcripcional, post-transcripcional como post-translacional8. Como tal, mientras que la expresión de NKG2DL no es comúnmente perceptible en la superficie de células sanas, NKG2DL mRNA9 y la expresión intracelular de la proteína fueron divulgados en tejidos sanos. La relevancia funcional de dicha expresión y los mecanismos subyacentes a tales patrones de expresión discrepantes aún no se han definido10.
La regulación mecanicista de la expresión de NKG2DL en las células cancerosas es un área fascinante de la investigación. Las vías que se sabe que están implicadas en el estrés celular, por ejemplo, la vía de estrés por choque térmico9,o en las vías asociadas al daño del ADN, como la ataxia telangiectasia mutada (ATM) y la vía11relacionada con Rad3 (ATR), así como las infecciones virales o bacterianas se han relacionado directamente con la inducción de la expresión de NKG2DL12. Sin embargo, incluso si la expresión superficial de NKG2DL ha sido inducida de manera efectiva, esta expresión puede perderse nuevamente a través del desprendimiento mediado por proteolíticos, un mecanismo asociado con el escape inmune y el mal pronóstico clínico en algunos cánceres13.
La ausencia de NKG2DL de la superficie de la célula puede también desempeñar papeles importantes en pacientes con AML. Aquí, el tratamiento con quimioterapia intensiva a menudo induce la remisión, pero la recaída a menudo ocurre a partir de células madre leucémicas (LSC), que sobreviven selectivamente a las quimioterapias y evaden la respuesta inmune. Como mostramos recientemente, los LSC, por ejemplo, escapan a la lisis de células NK suprimiendo la expresión de superficie NKG2DL14.
Inversamente, la ausencia de expresión de NKG2DL superficie se puede utilizar como un método para identificar y aislar de manera conveniente supuestas subpoblaciones de células similares a tallos de subpoblaciones leucémicas homólogas a granel. Aquí, presentamos dos acercamientos cytometric del flujo que se puedan utilizar para detectar la expresión superficial de NKG2DL y de tal modo para identificar las células madres negativas de NKG2DL en leucemia y quizás también en otros cánceres: Un método para el reconocimiento superficial del cacerola-ligand y un método que implica la coloración con los anticuerpos solos o agrupados que reconocen las proteínas conocidas individuales de NKG2DL.
Las muestras de pacientes se recogieron después de la aprobación de la Junta de Revisión de Ética de los Hospitales Universitarios de Basilea y Tuebingen.
1. Biotinilación de la proteína de fusión NKG2D
NOTA: Este paso se realiza con un kit de biotinilación (ver Tabla de Materiales) deacuerdo con las instrucciones del fabricante. Este paso del protocolo debe realizarse al menos 24 h antes de la tinción. La proteína de fusión NKG2D biotinilada debe almacenarse a -20 °C.
2. Descongelación de las células primarias de AML
NOTA: Aproximadamente 5.000.000 de células leucémicas congeladas por paciente almacenadas en nitrógeno líquido se descongelaron y luego se utilizaron para los ensayos de inmediato. Las células leucémicas fueron obtenidas y congeladas como se describiópreviamente 15. Brevemente, las muestras de sangre periféricas recogidas de pacientes con AML y los altos porcentajes de la célula de la ráfaga (>90% de ráfagas entre células mononucleares) fueron procesadas con una separación del gradiente de densidad para obtener las células mononucleares y congeladas posteriormente en el suero fetal del becerro (FCS) que contenía la solución del sulfóxido dimethyl del 10% (DMSO). Los números de la célula variaron altamente entre los pacientes en dependencia de la concentración del leucocito en el paciente (gama: 1.000.000 a 30.000.000 de células leucémicas por sangre del mL).
3. Conteo de celdas
4. Tinción de células AML primarias usando la proteína de fusión biotinilada NKG2D
5. Tinción de anticuerpos anti-NKG2DL individuales o agrupados
6. Adquisición de datos
NOTA: Asegúrese de que se realizan controles de calidad semanales del citómetro de flujo para asegurarse de que los láseres funcionan correctamente. Para el protocolo presentado aquí, se realiza un proceso semanal de citómetro y seguimiento (CTS) con perlas relativas para comprobar el rendimiento del láser en todos los canales. Después del CTS, se registran 10.000 eventos utilizando las perlas de 8 picos como control interno. Todos los picos deben estar en la misma posición dentro de sus puertas y bien separados entre sí.
Ambos protocolos presentados aquí permiten el enriquecimiento de AML LSC mediante análisis citométricos de flujo utilizando CD34, un marcador conocido de LSC17,en combinación con la expresión de la superficie de NKG2DL mediante la utilización de reconocimiento de panligando o tinción con anticuerpos agrupados contra ligandos individuales. En la Figura 1,mostramos que las muestras de LMA analizadas son positivas para CD34 y NKG2DL, pero también existen subpobla...
Aquí presentamos dos métodos citométricos de flujo que pueden detectar la expresión de la superficie NKG2DL en las células AML primarias humanas. Mostramos que ambos métodos de detección se pueden utilizar conjuntamente con otras manchas del anticuerpo (e.g., detección de la expresión CD34). También se pueden realizar tinciones similares en otros tipos de células primarias y líneas celulares.
Recientemente mostramos que la ausencia de NKG2DL en la superficie de las explosiones de p...
Los autores no tienen nada que revelar.
Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional Suiza de Ciencia (179239), la Fundación para la Lucha contra el Cáncer (Zurich), la Fundación Wilhelm Sander a CL (2019.042.1), y la Fundación Novartis para la investigación médico-biológica a C.L. Además, este proyecto ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie nº 765104. Agradecemos a la Instalación de Citometría de Flujo en Basilea por su apoyo.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
7-amminoactinomycin D (7-AAD) | Invitrogen | A1310 | Viability dye |
96 well plate U bottom | Sarstedt | 833925500 | 96 Well plate for our Flow cytometer |
APC Mouse Anti-Human cd34 | BD | 555824 | Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614 |
Bovine Serum Albumin | PanReac AppliChem | A1391,0050 | Component of the staining buffer |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Roth | 8043.1 | Component of the staining buffer |
Fetal Calf Serum (FCS) | BioConcept | 2-01F10-I | Component of the supplemented RPMI medium |
FlowJo 10.2 | BD | / | Software enabling data analysis for flow cytometry experiment |
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A21222 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853 |
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF | R&D | 1299-NK-050 | Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID: |
Human ULBP-1 Antibody | R&D | AF1380 | Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765 |
Human ULBP-2/5/6 Antibody | R&D | AF1298 | Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725 |
Human ULBP-3 Antibody | R&D | AF1517 | Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835 |
MICA Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-35346 | Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656 |
MICB Polyclonal Antibody | Thermo Scientific | PA5-66698 | Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413 |
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions | Miltenyibiotec | 130-093-385 | Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein |
Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537-500ML | Component of the staining buffer |
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A11034 | Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217 |
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um | Spherotech Inc. | RCP-30-20A | Beads used for flow cytometry device maintainance |
RPMI medium | Sigma Aldrich | R8758-500ML | Cell culture medium |
RayBright Universal Compensation Beads | Raybiotech | 137-00013-100 | Beads used to create the compensation matrix |
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL | Invitrogen | S866 | Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection |
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