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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Presentamos dos diversos protocolos de coloración para la detección del ligand de NKG2D (NKG2DL) en muestras agudas primarias humanas de la leucemia mieloide (AML). El primer enfoque se basa en una proteína de fusión, capaz de reconocer todos los ligandos conocidos y potencialmente desconocidos, mientras que el segundo protocolo se basa en la adición de múltiples anticuerpos anti-NKG2DL.

Resumen

Dentro del mismo paciente, la ausencia de expresión superficial de los ligands de NKG2D (NKG2DL) fue mostrada para distinguir a subpoblaciones leucémicas con las propiedades de la célula de vástago (llamadas las células madres leucémicas, LSCs) de las células leucémicas de contrapartes más distinguidas que carecen de potencial de la iniciación de la enfermedad aunque lleven mutaciones genéticas específicas similares de la leucemia. NKG2DL son bioquímicamente muy diversas auto-moléculas tipo MHC clase I. Las células sanas en condiciones homeostáticas generalmente no expresan NKG2DL en la superficie celular. En cambio, la expresión de estos ligandos se induce tras la exposición al estrés celular (por ejemplo, transformación oncógena o estímulos infecciosos) para desencadenar la eliminación de las células dañadas a través de la lisis a través de células inmunes que expresan receptores NKG2D, como las células asesinas naturales (NK). Curiosamente, la expresión de la superficie de NKG2DL se suprime selectivamente en las subpoblaciones de LSC, lo que permite a estas células evadir la vigilancia inmune mediada por NKG2D. Aquí, presentamos un análisis de lado a lado de dos diversos métodos cytometry de flujo que permitan la investigación de la expresión superficial de NKG2DL en las células cancerosas es decir, un método que implica el reconocimiento del cacerola-ligand y un método que implica la coloración con los anticuerpos múltiples contra solos ligands. Estos métodos se pueden utilizar para separar las subpoblaciones celulares negativas viables de NKG2DL con supuestas propiedades de células madre cancerosas de NKG2DL positivo no LSC.

Introducción

Las células NK son importantes efectoras del sistema inmune innato que pueden reconocer y eliminar células malignas o células sanas estresadas (por ejemplo, por una infección viral) sin estimulación previa deantígenos 1. Este proceso está estrechamente regulado a través de un complejo repertorio de receptores activadores —como los receptores naturales de citotoxicidad (NCR), NKG2D y CD16— y receptores inhibitorios que están representados en gran medida por receptores asesinos similares a inmunoglobulinas (KIRs)2. El atascamiento de KIRs a las moléculas humanas de la clase I del antígeno del leucocito (HLA) en las células....

Protocolo

Las muestras de pacientes se recogieron después de la aprobación de la Junta de Revisión de Ética de los Hospitales Universitarios de Basilea y Tuebingen.

1. Biotinilación de la proteína de fusión NKG2D

NOTA: Este paso se realiza con un kit de biotinilación (ver Tabla de Materiales) deacuerdo con las instrucciones del fabricante. Este paso del protocolo debe realizarse al menos 24 h antes de la tinción. La proteína de fusión NKG2D biotinilada debe almacenarse a -20 °C.

  1. Descongelar tanto la biotina, como los tubos de proteína de fusión NKG2D a temperatura ambiente (RT).
    NOTA: Si las c....

Resultados

Ambos protocolos presentados aquí permiten el enriquecimiento de AML LSC mediante análisis citométricos de flujo utilizando CD34, un marcador conocido de LSC17,en combinación con la expresión de la superficie de NKG2DL mediante la utilización de reconocimiento de panligando o tinción con anticuerpos agrupados contra ligandos individuales. En la Figura 1,mostramos que las muestras de LMA analizadas son positivas para CD34 y NKG2DL, pero también existen subpobla.......

Discusión

Aquí presentamos dos métodos citométricos de flujo que pueden detectar la expresión de la superficie NKG2DL en las células AML primarias humanas. Mostramos que ambos métodos de detección se pueden utilizar conjuntamente con otras manchas del anticuerpo (e.g., detección de la expresión CD34). También se pueden realizar tinciones similares en otros tipos de células primarias y líneas celulares.

Recientemente mostramos que la ausencia de NKG2DL en la superficie de las explosiones de p.......

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional Suiza de Ciencia (179239), la Fundación para la Lucha contra el Cáncer (Zurich), la Fundación Wilhelm Sander a CL (2019.042.1), y la Fundación Novartis para la investigación médico-biológica a C.L. Además, este proyecto ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie nº 765104. Agradecemos a la Instalación de Citometría de Flujo en Basilea por su apoyo.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
7-amminoactinomycin D (7-AAD)InvitrogenA1310Viability dye
96 well plate U bottomSarstedt83392550096 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34BD555824Antibody detecting CD34
RRID: AB_398614
Bovine Serum AlbuminPanReac AppliChemA1391,0050Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acidRoth8043.1Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS)BioConcept2-01F10-IComponent of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2BD/Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488Thermo ScientificA21222Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB
RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CFR&D1299-NK-050Fusion Protein detecting all NKG2DLs
RRID:
Human ULBP-1 AntibodyR&DAF1380Antibody detecting ULBP1
RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 AntibodyR&DAF1298Antibody detecting ULBP2/5/6
RRID: AB_354725
Human ULBP-3 AntibodyR&DAF1517Antibody detecting ULBP3
RRID: AB_354835
MICA Polyclonal AntibodyThermo ScientificPA5-35346Antibody detecting MICA
RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal AntibodyThermo ScientificPA5-66698Antibody detecting MICB
RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactionsMiltenyibiotec130-093-385Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered SalineSigma AldrichD8537-500MLComponent of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488Thermo ScientificA11034Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs
RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 umSpherotech Inc.RCP-30-20ABeads used for flow cytometry device maintainance
RPMI mediumSigma AldrichR8758-500MLCell culture medium
RayBright Universal Compensation BeadsRaybiotech137-00013-100Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mLInvitrogenS866Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection

Referencias

  1. Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
  2. Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions.

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