Deux approches cytométriques en flux de détection de surface de ligand NKG2D pour distinguer les cellules souches des sous-populations en vrac dans la leucémie myéloïde aiguë

Résumé

Nous présentons deux protocoles de souillure différents pour la détection du ligand NKG2D (NKG2DL) dans les échantillons humains primaires de leucémie myéloïde aiguë (AML). La première approche est basée sur une protéine de fusion, capable de reconnaître tous les ligands connus et potentiellement encore inconnus, tandis que le second protocole repose sur l’ajout de plusieurs anticorps anti-NKG2DL.

Résumé

Dans le même patient, l’absence de l’expression de surface des ligands de NKG2D (NKG2DL) a été montrée pour distinguer des sous-populations leucémiques avec des propriétés de cellules souches (soi-disant cellules souches leucémiques, LSCs) des cellules leucémiques de contrepartie plus différenciées qui manquent de potentiel d’initiation de la maladie bien qu’elles portent des mutations génétiques spécifiques de leucémie semblables. Les NKG2DL sont des auto-molécules biochimiquement très diversifiées de type CMH de classe I. Les cellules saines dans des conditions homéostatiques n’expriment généralement pas NKG2DL à la surface cellulaire. Au lieu de cela, l’expression de ces ligands est induite lors de l’exposition au stress cellulaire (par exemple, transformation oncogène ou stimuli infectieux) pour déclencher l’élimination des cellules endommagées par la lyse par les cellules immunitaires exprimant les récepteurs NKG2D telles que les cellules tueuses naturelles (NK). Fait intéressant, l’expression de surface de NKG2DL est sélectivement supprimée dans les sous-populations de LSC, permettant à ces cellules d’échapper à la surveillance immunitaire médiée par NKG2D. Ici, nous présentons une analyse côte à côte de deux méthodes différentes de cytometry d’écoulement qui permettent la recherche sur l’expression de surface de NKG2DL sur des cellules cancéreuses c.-à-d., une méthode impliquant l’identification de pan-ligand et une méthode impliquant la souillure avec des anticorps multiples contre des ligands simples. Ces méthodes peuvent être utilisées pour séparer les sous-populations cellulaires négatives viables de NKG2DL ayant des propriétés putatives de cellules souches cancéreuses de NKG2DL non-LSC positives.

Introduction

Les cellules NK sont des effecteurs importants du système immunitaire inné qui peuvent reconnaître et éliminer les cellules malignes ou les cellules saines stressées (par exemple, par une infection virale) sans stimulation antigénique préalable¹. Ce processus est étroitement régulé par un répertoire complexe de récepteurs activants ( tels que les récepteurs de cytotoxicité naturelle (RCN), NKG2D et CD16 - et de récepteurs inhibiteurs qui sont largement représentés par des récepteurs tueurs de type immunoglobuline (KIRs)². La liaison des KIRs aux molécules humaines de classe I de l’antigène leucocytaire (HLA) sur les cellules somatiques assure l’auto-reconnaissance et transmet la tolérance des cellules NK. D’autre part, l’absence d’auto-reconnaissance et la liaison accrue des récepteurs activateurs à leurs ligands sur les cellules cibles déclenchent la libération de granules cytotoxiques conduisant à la cytotoxicité à médiation cellulaire NK^1. Enfin, les cellules NK peuvent exercer une cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) en liant le récepteur activateur CD16 à des cibles exprimant la partie Fc d’Ig (FcR)^2. Outre la cytotoxicité directe, les cellules NK peuvent également déclencher la libération de cytokines reliant l’inné au système immunitaire adaptatif^3.

NKG2D est un récepteur activateur majeur exprimé sur les cellules T NK, NKT, γδ T et NAÏves CD8+⁴ qui permet à ces cellules immunitaires cytotoxiques de reconnaître et de lyser le ligand NKG2D (NKG2DL) exprimant les cellules cibles. Les cellules saines n’expriment généralement pas NKG2DL. Au lieu de cela, l’expression de NKG2DL est régulée à la hausse sur les cellules malignes ou infectées par un virus pour les rendre susceptibles de se prêter à la clairance immunitaire⁵.

La famille humaine NKG2DL comprend huit molécules connues parmi lesquelles les deux molécules A et B liées à la chaîne du CMH I (MICA et MICB⁶⁾et les protéines de liaison au cytomégalovirus UL16 1–6 (ULBP1-6^7). L’expression de NKG2DL est régulée sur les niveaux transcriptionnel, post-transcriptionnel ainsi que post-traductionnel^8. En tant que tel, tandis que l’expression de NKG2DL n’est généralement pas discernable à la surface des cellules saines, NKG2DL ADN messagère⁹ et expression intracellulaire de protéine ont été rapportés dans les tissus sains. La pertinence fonctionnelle d’une telle expression et les mécanismes sous-jacents à de tels modèles d’expression discordants restent à définir^10.

La régulation mécaniste de l’expression de NKG2DL dans les cellules cancéreuses est un domaine fascinant de recherche. Les voies connues pour être impliquées dans le stress cellulaire, par exemple la voie de stress de choc thermique^9,ou les voies associées aux dommages à l’ADN, telles que l’ataxie télangiectasie mutée (ATM) et la voie Rad3 connexe (ATR)^11,ainsi que les infections virales ou bactériennes ont été directement liées à l’induction de l’expression NKG2DL^12. Cependant, même si l’expression de surface de NKG2DL a été effectivement induite, cette expression peut être perdue à nouveau par l’excrétion protéolytique-négociée, un mécanisme associé à l’évasion immunitaire et au mauvais pronostic clinique dans certains cancers^13.

L’absence de NKG2DL de surface cellulaire peut également jouer des rôles importants dans les patients avec AML. Ici, le traitement par chimiothérapie intensive induit souvent une rémission, mais la rechute se produit souvent à partir de cellules souches leucémiques (LSC), qui survivent sélectivement aux chimiothérapies et échappent à la réponse immunitaire. Comme nous l’avons récemment montré, les LSC, par exemple, échappent à la lyse des cellules NK en supprimant l’expression de surface NKG2DL^14.

Inversement, l’absence d’expression de NKG2DL de surface peut être utilisée comme méthode pour identifier et isoler de manière viative des sous-populations de cellules de type radical putatif de sous-populations leucémiques homologues en vrac. Ici, nous présentons deux approches cytométriques en flux qui peuvent être utilisées pour détecter l’expression de surface de NKG2DL et identifier ainsi les cellules souches négatives de NKG2DL dans la leucémie et peut-être aussi dans d’autres cancers: Une méthode pour la reconnaissance de surface de pan-ligand et une méthode impliquant la coloration avec des anticorps simples ou regroupés reconnaissant des protéines NKG2DL connues individuelles.

Protocole

Des échantillons de patients ont été prélevés après approbation du Comité d’examen éthique des Hôpitaux universitaires de Bâle et de Tuebingen.

1. Biotinylation de la protéine de fusion NKG2D

REMARQUE: Cette étape est effectuée avec un kit de biotinylation (voir la table des matériaux) conformément aux instructions du fabricant. Cette étape du protocole doit être effectuée au moins 24 h avant la coloration. La protéine de fusion NKG2D biotinylée doit être conservée à -20 °C.

1. Décongeler à la fois la biotine, ainsi que les tubes protéiques de fusion NKG2D à température ambiante (RT).
   REMARQUE: Si les cellules doivent être stériles pour une utilisation expérimentale ultérieure (injection chez la souris, dosages d’unités formant colonies, etc.), reconstituer la protéine de fusion sous une hotte à flux laminaire pour éviter la contamination. Sinon, chaque étape peut être effectuée sur un banc.
2. Faites tourner rapidement les 50μg de protéine de fusion NKG2D lyophilisée. Ajouter 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour reconstituer la poudre et bien mélanger à l’aide d’une micropipette P1000.
3. Ajouter 100 μL de la protéine de fusion NKG2DL à un tube de biotine pour obtenir une concentration finale en stock de 100 μg/mL.
4. Mélangez soigneusement la solution par remise en suspension continue avec une micropipette P100.
5. Incuber la solution de protéine de fusion/biotine à une ta commandée pendant 24 h. La protéine de fusion est maintenant prête à l’emploi.

2. Dégel des cellules primaires de la LAM

REMARQUE : Environ 5 000 000 de cellules leucémiques congelées par patient stockées dans de l’azote liquide ont été décongelées, puis utilisées immédiatement pour les essais. Des cellules leucémiques ont été obtenues et congelées comme précédemment décrit^15. Brièvement, des prises de sang périphériques rassemblées des patients présentant AML et des pourcentages élevés de cellules de souffle (>90% de souffle parmi les cellules mononucléaires) ont été traitées avec une séparation de gradient de densité pour obtenir les cellules mononucléaires et plus tard congelées dans le sérum foetal de veau (FCS) contenant la solution de sulfoxyde diméthylique de 10% (DMSO). Les nombres de cellules ont fortement varié entre les patients dépendant de la concentration de leucocyte dans le patient (gamme : 1.000.000 à 30.000.000 cellules leucémiques par sang de ml).

1. Milieu RPMI préchauffé contenant 10 % de FCS à 37 °C au bain-marie. Pour chaque flacon de cellules AML (jusqu’à 30 000 000 de cellules dans 1 mL FCS + 10% DMSO), ajouter 10 mL de milieu préchauffé à un tube de réaction de 15 mL.
2. Retirer le cryovial contenant de la LAM primaire du stockage de l’azote liquide et décongeler immédiatement les cellules à l’aide d’un bain-marie à 37 °C. Déplacez doucement le tube d’avant en arrière dans l’eau, ce qui permet au contenu du flacon de dégeler jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’un petit cristal de glace.
3. Transférer immédiatement les cellules décongelées dans le tube contenant du milieu et rincer le flacon à l’aide de 1 mL de milieu.
4. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min et jeter le surnageant sans perturber la pastille.
5. Laver les cellules avec 5 mL de milieu RPMI contenant 10% de FCS et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.

3. Comptage cellulaire

1. Ressusciter la pastille cellulaire dans un volume connu de milieu RPMI contenant 10 % de FCS.
2. Transférer un petit volume de la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et diluer à un rapport connu avec du bleu de trypan ou tout autre colorant alternatif qui permet une discrimination cellule vivante/cellule morte.
3. Utilisez n’importe quel appareil pour compter les cellules.
4. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 10 min et jeter le surnageant sans perturber la pastille.

4. Coloration des cellules primaires de la LAM à l’aide de la protéine de fusion NKG2D biotinylée

1. Préparer le tampon de coloration en complétant 500 mL pbs avec de l’albumine sérique bovine (BSA) et de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à une concentration finale de 0,07 mM et 2 mM, respectivement. Ajustez le pH (7,2 à 7,4) si nécessaire.
2. Ressusciter le culot cellulaire avec tampon de coloration à une concentration finale de 0,5 x 10⁷ cellules/mL.
   REMARQUE: Éventuellement, avant la coloration, les cellules peuvent être incubées avec un agent bloquant (par exemple hIgG (1μg / ml) pendant 30 min à RT ou agent de blocage FcR).NOTE: Optionally, prior to staining, the cells can be incubated with a blocking agent (e.g. hIgG (1μg/ml) for 30 min at RT or FcR-blocking agent)..
3. Transférer 100 μL de la suspension cellulaire sur une plaque de fond en U de 96 puits de culture cellulaire et centrifuger la plaque à 300 x g pendant 10 min. Jetez le surnageant sans déranger la pastille.
4. Préparer un mélange maître de protéines de fusion NKG2D biotinylées afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 μL par puits avec une concentration finale de 10 μg/mL par puits.
5. Ajouter le mélange maître préparé à l’étape 4.4 à l’aide d’une pipette de 100 μL et ressusciter les pastilles cellulaires avec une pipette multicanal de 300 μL.
   REMARQUE: Réduisez le volume final en fonction du nombre de cellules pour réduire la quantité de protéine de fusion nécessaire à la coloration.
6. Incuber la suspension cellulaire pendant 25 min à TA ou 50 min à 4 °C.
7. Laver les cellules en ajoutant 200 μL de tampon de coloration par puits avec une pipette multicanal de 300 μL.
8. Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 10 min et jeter le surnageant sans perturber la pastille.
9. Répétez les étapes 4.7 et 4.8.
   REMARQUE: La coloration décrite ici est réalisée dans une culture cellulaire de 96 puits en U-bottom. Par conséquent, les étapes de lavage sont effectuées deux fois en raison de la faible capacité de volume de ces plaques. La coloration peut également être effectuée dans d’autres tubes et les étapes de lavage peuvent alors être effectuées une seule fois en utilisant un volume plus important.
10. Préparer un mélange maître à l’aide de streptavidine-PE (voir le tableau 1 pour les dilutions) afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 μL.
    REMARQUE: Ajoutez des anticorps de sélection pour votre type de cellule d’intérêt comme par exemple CD33, CD34.... pour AML.
11. Ajouter le mélange maître préparé à l’étape 4.10 à l’aide d’une pipette de 100 μL et ressusciter les pastilles cellulaires avec une pipette multicanal de 300 μL.
12. Incuber les suspensions cellulaires pendant 15 min à TA ou 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
13. Laver les cellules en ajoutant 200 μL de tampon de coloration par puits avec une pipette multicanal de 300 μL.
14. Centrifuger la plaque à 300 x g pendant 10 min et jeter le surnageant sans perturber la pastille.
15. Répétez les étapes 4.13 et 4.14.
16. Préparer une solution de tampon de coloration comprenant de la 7-AAD (7-Aminoactinomycine D, 1:1000) ou tout réactif pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes.
17. Ressusciter les pastilles cellulaires dans un tampon de coloration de 200 μL + 7-AAD préparées à l’étape 4.16 à l’aide d’une micropipette multicanal de 300 μL.
18. Analyser les cellules à l’aide d’un dispositif de cytométrie en flux.

5. Coloration d’anticorps anti-NKG2DL simples ou regroupés

1. Utilisez la même suspension de cellule qu’à l’étape 4.2.
2. Transférer 100 μL de la suspension cellulaire sur une plaque de fond en U de 96 puits de culture cellulaire à l’aide d’une pipette multicanal de 300 μL et centrifuger la plaque à 300 x g pendant 10 min. Jetez le surnageant sans déranger la pastille.
3. Préparer un mélange maître d’anticorps pour chaque anticorps primaire ou anticorps mis en commun (voir le tableau 2 pour les dilutions) afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 μL.
4. Ajouter le mélange maître préparé à l’étape 5.3 à l’aide d’une pipette de 100 μL et ressusciter les pastilles cellulaires avec une pipette multicanal de 300 μL.
5. Incuber les cellules pendant 25 minutes à ta.
6. Laver les cellules en ajoutant 200 μL de tampon de coloration par puits à l’aide d’une pipette multicanal de 300 μL.
7. Centrifuger la plaque de fond en U de 96 puits de culture cellulaire à 300 x g pendant 10 min et jeter le surnageant sans perturber le culot.
8. Répétez les étapes 5.6 et 5.7.
9. Préparer un mélange maître d’anticorps en ajoutant l’anticorps secondaire (voir le tableau 2 pour les dilutions) afin que les cellules soient remises en suspension dans un volume final de 50 μL par puits.
10. Ajouter le mélange maître préparé à l’étape 5.9 à l’aide d’une pipette de 100 μL et ressusciter les pastilles cellulaires avec une pipette multicanal de 300 μL.
11. Incuber pendant 15 min à TA ou 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
12. Laver en ajoutant 200 μL de tampon de coloration par puits à l’aide d’une pipette multicanal de 300 μL.
13. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 10 min et jeter le surnageant sans perturber la pastille.
14. Répétez les étapes 5.12 et 5.13.
15. Ressusciter les pastilles cellulaires dans un tampon de coloration de 200 μL contenant du 7-AAD préparé à l’étape 4.16.
16. Analyser les cellules à l’aide d’un dispositif de cytométrie en flux tel que décrit à l’étape 6.

6. Acquisition de données

REMARQUE: Assurez-vous que les contrôles de qualité hebdomadaires du cytomètre de flux sont effectués pour s’assurer que les lasers fonctionnent correctement. Pour le protocole présenté ici, un processus hebdomadaire de cytomètre et de suivi (CTS) est effectué avec des perles relatives pour vérifier les performances laser sur tous les canaux. Après le CTS, 10 000 événements sont enregistrés en utilisant les billes de 8 pics comme contrôle interne. Tous les pics doivent être dans la même position à l’intérieur de leurs portes et bien séparés les uns des autres.

1. Créer la compensation matricielle pour soustraire le chevauchement spectral entre les détecteurs avec des billes ou avec des cellules^16.
2. Enregistrez 10 000 événements pour les cellules non colorées et les perles colorées simples. Pour les contrôles de fluorescence moins un (FMO), enregistrez 50 000 événements et pour les échantillons entièrement colorés, enregistrez jusqu’à 100 000 événements.
   REMARQUE: Alternativement, des échantillons colorés simples peuvent être effectués sur les cellules. Si c’est le cas, assurez-vous que les cellules ont un signal positif pour le marqueur souhaité.
3. Acquérir un seul échantillon de cellules colorées ou de perles pour chaque fluorophore utilisé dans l’expérience afin de révéler la quantité de chevauchement spectral. Utilisez le créateur de compensation du dispositif de cytométrie de flux pour calculer les valeurs de débordement et appliquer la matrice de compensation à tous les échantillons mesurés.
   REMARQUE: Les anticorps secondaires ne peuvent pas être utilisés pour la création de compensation à l’aide de billes si la compensation est calculée avec des billes. Selon le type de billes de compensation, les anticorps secondaires ne peuvent pas être utilisés pour la compensation avec des billes.
4. Pour les contrôles FMO et les échantillons entièrement colorés avec la protéine de fusion, tout d’abord, sélectionnez les cellules en fonction de leur diffusion vers l’avant (FSC) et de leur dispersion latérale (SSC). Après l’exclusion des doublets, portez les cellules en fonction de leur négativité pour le signal 7-AAD (PercP-Cy5.5) d’exclure les cellules mortes (voir étape 5.15). Le graphique final montre l’expression de CD34 (axe des Y) et de NKG2DL (axe des X) sur les singlets vivants.
5. Pour les anticorps anti-NKG2DL simples, appliquez la même stratégie aux échantillons, mais notez que la positivité du ligand réside dans Alexa Fluor 488 et non dans le canal PE.
6. Ajustez les portes en fonction des contrôles FMO pour la stratégie de contrôle des étapes 6.4 et 6.5 (voir le tableau 3)pour que les contrôles FMO appropriés fonctionnent pour cette expérience: Dans le logiciel d’analyse, tracez une porte sur la fraction négative. Lors de l’enregistrement de l’échantillon entièrement coloré, les cellules au-dessus de la porte précédemment créée sont positives pour le marqueur analysé.

Résultats

Les deux protocoles présentés ici permettent l’enrichissement d’AML LSC par des analyses cytométriques en flux utilisant CD34, un marqueur connu de LSC^17,en combinaison avec l’expression de surface de NKG2DL en utilisant la reconnaissance pan-ligand ou la coloration avec des anticorps groupés contre des ligands individuels. Dans la figure 1, nous montrons que les échantillons analysés de laM sont positifs pour CD34 et NKG2DL, mais qu’il existe également...

Discussion

Ici, nous présentons deux méthodes cytométriques de flux qui peuvent détecter l’expression de surface de NKG2DL sur les cellules primaires humaines d’AML. Nous montrons que les deux méthodes de détection peuvent être utilisées en conjonction avec d’autres colorations d’anticorps (par exemple, la détection de l’expression de CD34). Des taches similaires peuvent également être effectuées sur d’autres types de cellules primaires et lignées cellulaires.

Nous avons récemme...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-amminoactinomycin D (7-AAD)	Invitrogen	A1310	Viability dye
96 well plate U bottom	Sarstedt	833925500	96 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34	BD	555824	Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614
Bovine Serum Albumin	PanReac AppliChem	A1391,0050	Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Roth	8043.1	Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS)	BioConcept	2-01F10-I	Component of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2	BD	/	Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A21222	Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF	R&D	1299-NK-050	Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID:
Human ULBP-1 Antibody	R&D	AF1380	Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 Antibody	R&D	AF1298	Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725
Human ULBP-3 Antibody	R&D	AF1517	Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835
MICA Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-35346	Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-66698	Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions	Miltenyibiotec	130-093-385	Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-500ML	Component of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A11034	Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um	Spherotech Inc.	RCP-30-20A	Beads used for flow cytometry device maintainance
RPMI medium	Sigma Aldrich	R8758-500ML	Cell culture medium
RayBright Universal Compensation Beads	Raybiotech	137-00013-100	Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL	Invitrogen	S866	Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection