Два проточных цитометрических подхода к обнаружению поверхности лигандов NKG2D для отличия стволовых клеток от объемных субпопуляций при остром миелоидном лейкозе

Резюме

Мы представляем два различных протокола окрашивания для обнаружения лиганда NKG2D (NKG2DL) в образцах первичного острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) человека. Первый подход основан на слиянии белка, способного распознавать все известные и потенциально еще неизвестные лиганды, в то время как второй протокол основан на добавлении нескольких антител против NKG2DL.

Аннотация

Было показано, что отсутствие поверхностной экспрессии лигандов NKG2D (NKG2DL) отличает лейкемические субпопуляции со свойствами стволовых клеток (так называемые лейкемические стволовые клетки, LSC) от более дифференцированных аналогов лейкемических клеток, которые не имеют потенциала инициации заболевания, хотя они несут аналогичные специфические генетические мутации лейкемии. NKG2DL являются биохимически очень разнообразными MHC класса I-подобными самомолекулярными молекулами. Здоровые клетки в гомеостатических условиях обычно не экспрессирует NKG2DL на поверхности клеток. Вместо этого экспрессия этих лигандов индуцируется при воздействии клеточного стресса (например, онкогенной трансформации или инфекционных стимулов), чтобы вызвать устранение поврежденных клеток посредством лизиса через NKG2D-рецептор-экспрессировающие иммунные клетки, такие как естественные киллеры (NK) клетки. Интересно, что поверхностная экспрессия NKG2DL избирательно подавляется в субпопуляциях LSC, что позволяет этим клеткам уклоняться от NKG2D-опосредованного иммунного надзора. Здесь мы представляем параллельный анализ двух различных методов проточной цитометрии, которые позволяют исследуть поверхностную экспрессию NKG2DL на раковых клетках, то есть метод, включающий распознавание панлигандов, и метод, включающий окрашивание несколькими антителами против отдельных лигандов. Эти методы могут быть использованы для отделения жизнеспособных отрицательных клеточных субпопуляций NKG2DL с предполагаемой свойствами раковых стволовых клеток от NKG2DL положительных не-LSC.

Введение

NK-клетки являются важными эффекторами врожденной иммунной системы, которые могут распознавать и устранять злокачественные клетки или стрессовые здоровые клетки (например, вирусной инфекцией) без предварительной стимуляции антигена^1. Этот процесс жестко регулируется с помощью сложного репертуара активирующих рецепторов, таких как естественные рецепторы цитотоксичности (NCR), NKG2D и CD16, и ингибирующих рецепторов, которые в значительной степени представлены иммуноглобулиноподобными рецепторами-киллерами (KIRs)^2. Связывание KIRs с молекулами лейкоцитарного антигена человека (HLA) класса I на соматических клетках обеспечивает самораспознавание и передает толерантность NK-клеток. С другой стороны, отсутствие самораспознавания и повышенное связывание активирующих рецепторов с их лигандами на клетках-мишенях вызывают высвобождение цитотоксических гранул, приводящих к NK-клеточной опосредорованию цитотоксичностью^1. Наконец, NK-клетки могут оказывать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) путем связывания активирующего рецептора CD16 с мишенями, экспрессирующими Fc-часть Ig^(FcR)2. Помимо прямой цитотоксичности, NK-клетки также могут вызывать высвобождение цитокинов, соединяющее врожденную с адаптивной иммунной системой^3.

NKG2D является основным активирующим рецептором, экспрессируемым на NK, NKT, γδ T и наивных CD8 + Т-клетках^4, который позволяет таким цитотоксическим иммунным клеткам распознавать и лизировать лиганд NKG2D (NKG2DL), экспрессирующий клетки-мишени. Здоровые клетки обычно не экспрессивают NKG2DL. Вместо этого экспрессия NKG2DL регулируется на злокачественных или инфицированных вирусом клетках, чтобы сделать их поддаются иммунному клиренсу^5.

Человеческое семейство NKG2DL включает восемь известных молекул, среди которых две связанные с цепью MHC I молекулы A и B (MICA и MICB⁶⁾и цитомегаловирус UL16-связывающие белки 1-6 (ULBP1-6^7). Выражение NKG2DL регулируется на транскрипционном, посткриптиционном, а также постпереводяном уровнях^8. Таким образом, в то время как экспрессия NKG2DL обычно не обнаруживается на поверхности здоровых клеток, мРНК NKG2DL⁹ и внутриклеточная экспрессия белка были зарегистрированы в здоровых тканях. Функциональная значимость такого выражения и механизмы, лежащие в основе таких дискрепрепантных паттернов выражения, еще предстоит определить^10.

Механистическая регуляция экспрессии NKG2DL в раковых клетках является увлекательной областью исследования. Пути, которые, как известно, участвуют либо в клеточном стрессе, например, в пути стресса теплового шока^9,либо в пути, связанные с повреждением ДНК, такие как мутировавший телеангиэктазия атаксии (ATM) и связанный с Rad3 (ATR)^{путь 11,}а также вирусные или бактериальные инфекции были напрямую связаны с индудукцией экспрессии NKG2DL^12. Однако, даже если поверхностная экспрессия NKG2DL была эффективно индуцирована, эта экспрессия может быть снова потеряна через протеолитически-опосредованную линьку, механизм, связанный с иммунным побегом и плохим клиническим прогнозом при некоторых видах рака^13.

Отсутствие клеточной поверхности NKG2DL также может играть важную роль у пациентов с ОМЛ. Здесь лечение интенсивной химиотерапией часто вызывает ремиссию, но рецидив часто возникает от лейкемических стволовых клеток (LSC), которые избирательно переживают химиотерапию и уклоняются от иммунного ответа. Как мы недавно показали, LSC, например, избегают лизиса NK-клеток, подавляя поверхностную экспрессию NKG2DL^14.

И наоборот, отсутствие поверхностной экспрессии NKG2DL может быть использовано в качестве метода для идентификации и жизнеспособного выделения предполагаемой стволоподобной субпопуляции клеток от объемных аналогов лейкемических субпопуляций. Здесь мы представляем два проточных цитометрических подхода, которые могут быть использованы для обнаружения поверхностной экспрессии NKG2DL и тем самым идентификации отрицательных стволовых клеток NKG2DL при лейкемии и, возможно, также при других видах рака: метод распознавания поверхности панлиганда и метод, включающий окрашивание одиночными или объединенными антителами, распознающими отдельные известные белки NKG2DL.

протокол

Образцы пациентов были собраны после одобрения Советом по этике университетских больниц Базеля и Тюбингена.

1. Биотинилирование белка слияния NKG2D

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап выполняется с помощью набора для биотинилирования (см. Таблицу материалов)в соответствии с инструкцией производителя. Этот этап протокола должен быть выполнен не менее чем за 24 часа до окрашивания. Биотинилированный слитый белок NKG2D должен храниться при -20 °C.

1. Разморозить как биотин, так и белковые трубки NKG2D при комнатной температуре (RT).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки должны быть стерильными для дальнейшего экспериментального использования (инъекции мышам, колониеобразующие единичные анализы и т. Д.), Повторно воссоздайте белок слияния под ламинарной капотом потока, чтобы избежать загрязнения. В противном случае каждый шаг можно выполнить на скамейке.
2. Быстро вращайте 50 мкг лиофилизированного белка слияния NKG2D. Добавьте 500 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) для повторного образования порошка и тщательно перемешайте с помощью микропипетки P1000.
3. Добавьте 100 мкл слитого белка NKG2DL в биотиновую трубку для получения конечной концентрации запаса 100 мкг/мл.
4. Тщательно перемешайте раствор путем непрерывного повторного усыпления с помощью микропипетки P100.
5. Инкубировать раствор слитого белка/биотина на контролируемом РТ в течение 24 ч. Слитый белок теперь готов к использованию.

2. Размораживание первичных клеток ОМЛ

ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 5 000 000 замороженных лейкозных клеток на одного пациента, хранящихся в жидком азоте, были разморожено, а затем сразу же использованы для анализов. Лейкемические клетки были получены и заморожены, как^{описано ранее 15.} Вкратце, образцы периферической крови, собранные у пациентов с ОМЛ и высоким процентом бластных клеток (>90% бластов среди мононуклеарных клеток), обрабатывали с разделением градиента плотности для получения мононуклеарных клеток и впоследствии замораживали в сыворотке теленка плода (FCS), содержащей 10% раствор диметилсульфоксида (ДМСО). Количество клеток сильно варьировалось между пациентами в зависимости от концентрации лейкоцитов у пациента (диапазон: от 1 000 000 до 30 000 000 лейкозных клеток на мл крови).

1. Предварительно нагревайте RPMI среду, содержащую 10% FCS при 37 °C, с помощью водяной бани. На каждый флакон клеток ОМЛ (до 30 000 000 клеток в 1 мл FCS + 10% DMSO) добавляют 10 мл предварительно нагретой среды в реакционную трубку объемом 15 мл.
2. Удалите криовиал, содержащий первичный ОМЛ, из хранилища жидкого азота и немедленно разморозьте клетки с помощью водяной бани с 37 °C. Осторожно перемещайте трубку вперед и назад в воде, позволяя содержимому флакона оттаивать, пока не останется только небольшой кристалл льда.
3. Немедленно переложите размороженные клетки в средосодержащую трубку и промойте флакон, используя 1 мл среды.
4. Центрифугируют ячейки при 300 х г в течение 10 мин и выбрасывают супернатант, не нарушая гранулу.
5. Промыть ячейки 5 мл rpmI среды, содержащей 10% FCS, и центрифуги при 300 х г в течение 10 мин.

3. Подсчет клеток

1. Повторно суспендируют ячейку гранулы в известном объеме rpmI среды, содержащей 10% FCS.
2. Переложите небольшой объем клеточной суспензии в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и разбавьте в известном соотношении трипан-синим или любым другим альтернативным красителем, который позволяет различать живые клетки / мертвые клетки.
3. Используйте любое устройство для подсчета ячеек.
4. Центрифугируют ячейки при 300 х г в течение 10 мин и выбрасывают супернатант, не нарушая гранулу.

4. Окрашивание первичных клеток AML с использованием биотинилированного белка слияния NKG2D

1. Подготовьте буфер окрашивания, дополнив 500 мл PBS бытовым сывороточным альбумином (BSA) и этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) до конечной концентрации 0,07 мМ и 2 мМ соответственно. При необходимости отрегулируйте рН (7,2–7,4).
2. Повторно суспендируют ячейку гранулы с буфером окрашивания до конечной концентрации 0,5 х 10⁷ клеток/мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно, перед окрашиванием, клетки могут быть инкубированы с блокирующим агентом (например, hIgG (1 мкг/мл) в течение 30 мин при RT или FcR-блокирующем агенте).
3. Переложить 100 мкл клеточной суспензии на клеточную культуру 96-скважинной U-нижней пластины и центрифугировать пластину при 300 х г в течение 10 мин. Выбросьте супернатант, не нарушая гранулу.
4. Приготовьте мастер-смесь биотинилированного белка слияния NKG2D таким образом, чтобы клетки повторно суспендировались в конечном объеме 50 мкл на скважину с конечной концентрацией 10 мкг/мл на скважину.
5. Добавьте мастер-смесь, приготовленную на этапе 4.4, используя пипетку 100 мкл, и повторно суспендировать гранулы ячейки многоканальной пипеткой 300 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшите конечный объем в соответствии с количеством клеток, чтобы уменьшить количество белка слияния, необходимого для окрашивания.
6. Инкубируют клеточную суспензию в течение 25 мин при RT или 50 мин при 4 °C.
7. Промывайте ячейки, добавляя 200 мкл окрашивающего буфера на скважину многоканальной пипеткой 300 мкл.
8. Центрифугировать пластину при 300 х г в течение 10 мин и выбросить супернатант, не нарушая гранулу.
9. Повторите шаги 4.7 и 4.8.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание, описанное здесь, выполняется в клеточной культуре 96-скважинной U-нижней пластины. Поэтому этапы промывки выполняются дважды из-за малой объемной емкости таких пластин. Окрашивание также может быть выполнено в других трубах, а этапы промывки могут быть выполнены только один раз с использованием большего объема.
10. Приготовьте мастер-микс с использованием Стрептавидина-ПЭ (см. Таблицу 1 для разбавлений) таким образом, чтобы клетки были повторно суспендированы в конечном объеме 50 мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте селекционо-антитела для вашего типа клеток, представляющих интерес, например, CD33, CD34.... для AML.
11. Добавьте мастер-смесь, приготовленную на этапе 4.10 с использованием пипетки 100 мкл, и повторно суспендировать гранулы ячейки многоканальной пипеткой 300 мкл.
12. Инкубировать клеточные суспензии в течение 15 мин при RT или 30 мин при 4 °C в темноте.
13. Промывайте ячейки, добавляя 200 мкл окрашивающего буфера на скважину многоканальной пипеткой 300 мкл.
14. Центрифугировать пластину при 300 х г в течение 10 мин и выбросить супернатант, не нарушая гранулу.
15. Повторите шаги 4.13 и 4.14.
16. Готовят раствор окрашивающего буфера, включающий 7-AAD (7-аминоактиномицин D, 1:1000) или любой реагент для различения живых и мертвых клеток.
17. Повторное суспендирование клеточных гранул в 200 мкл окрашивающего буфера + 7-AAD, приготовленных на этапе 4.16 с использованием многоканальной микропипетки 300 мкл.
18. Анализируйте клетки с помощью устройства проточной цитометрии.

5. Окрашивание одиночных или объединенных одиночных антител NKG2DL

1. Используйте ту же суспензию ячеек, что и на шаге 4.2.
2. Переложите 100 мкл клеточной суспензии на клеточную культуру 96-скважинной U-донной пластины с помощью многоканальной пипетки 300 мкл и центрифугируют пластину при 300 х г в течение 10 мин. Выбросьте супернатант, не нарушая гранулу.
3. Подготовьте смесь антител для каждого первичного антитела или объединенных антител (см. Таблицу 2 для разведений) таким образом, чтобы клетки были повторно суспендированы в конечном объеме 50 мкл.
4. Добавьте мастер-смесь, приготовленную на этапе 5.3, используя пипетку 100 мкл, и повторно суспендировать гранулы ячейки многоканальной пипеткой 300 мкл.
5. Инкубировать клетки в течение 25 мин при РТ.
6. Промыть ячейки, добавив 200 мкл окрашивающего буфера на скважину с помощью многоканальной пипетки 300 мкл.
7. Центрифугируют клеточную культуру 96-луночной U-донной пластиной при 300 х г в течение 10 мин и выбрасывают супернатант, не нарушая гранулу.
8. Повторите шаги 5.6 и 5.7.
9. Приготовьте смесь антител путем добавления вторичного антитела (см. Таблицу 2 для разведения) таким образом, чтобы клетки были повторно суспендированы в конечном объеме 50 мкл на скважину.
10. Добавьте мастер-смесь, приготовленную на этапе 5.9, используя пипетку 100 мкл, и повторно суспендировать гранулы ячейки многоканальной пипеткой 300 мкл.
11. Инкубировать в течение 15 мин при RT или 30 мин при 4 °C в темноте.
12. Промывайте, добавляя 200 мкл буфера окрашивания на скважину с помощью многоканальной пипетки 300 мкл.
13. Центрифугируют клеточную суспензию при 300 х г в течение 10 мин и выбрасывают супернатант, не нарушая гранулу.
14. Повторите шаги 5.12 и 5.13.
15. Повторное суспендирование клеточных гранул в 200 мкл окрашивающего буфера, содержащего 7-AAD, приготовленное на этапе 4.16.
16. Анализ клеток с помощью устройства проточной цитометрии, как описано в шаге 6.

6. Сбор данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что еженедельный контроль качества проточного цитометра выполняется, чтобы убедиться, что лазеры функционируют должным образом. Для протокола, представленного здесь, еженедельный процесс цитометра и отслеживания (CTS) выполняется с относительными шариками для проверки производительности лазера на всех каналах. После CTS 10 000 событий регистрируются с использованием 8-пиковых бусин в качестве внутреннего контроля. Все вершины должны находиться в одном положении внутри своих ворот и хорошо отделены друг от друга.

1. Создайте матричную компенсацию для вычитания спектрального перекрытия между детекторами с шариками или с ячейками^16.
2. Запишите 10 000 событий для неокрашивых клеток и одиночных окрашенных шариков. Для элементов управления флуоресценцией минус один (FMO) регистрируйте 50 000 событий, а для полностью окрашенных образцов регистрируйте до 100 000 событий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, одиночные окрашенные образцы могут быть выполнены на клетках. Если это так, убедитесь, что клетки имеют положительный сигнал для нужного маркера.
3. Приобретите один окрашенный образец клетки или бусины для каждого флуорофора, используемого в эксперименте, чтобы выявить количество спектрального перекрытия. Используйте создателя компенсации устройства проточной цитометрии для расчета значений побочных эффектов и применения компенсационной матрицы ко всем измеренным образцам.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичные антитела не могут быть использованы для создания компенсации с помощью бусин, если компенсация рассчитывается с помощью бусин. В зависимости от типа компенсационных шариков вторичные антитела не могут быть использованы для компенсации бусинами.
4. Для элементов управления FMO и полных окрашенных образцов с белком слияния, во-первых, выберите клетки на основе их прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC). После исключения дублетов, загладейте клетки на основе их негативности для сигнала 7-AAD (PercP-Cy5.5), чтобы исключить мертвые клетки (см. шаг 5.15). На заключительном графике показано выражение CD34 (ось Y) и NKG2DL (ось X) на живых синглетах.
5. Для одиночных анти-NKG2DL-антител примените ту же стратегию к образцам, но обратите внимание, что положительность лиганда лежит в Alexa Fluor 488, а не в канале PE.
6. Отрегулируйте затворы в соответствии с элементами управления FMO для стратегии гаширования с шагов 6.4 и 6.5 (см. Таблицу 3)для соответствующих элементов управления FMO для этого эксперимента: В аналитическом программном обеспечении нарисуйте затвор на отрицательной дроби. При записи полностью окрашенного образца клетки над ранее созданным затвором являются положительными для анализируемого маркера.

Результаты

Оба протокола, представленные здесь, позволяют обогащать AML LSC с помощью проточных цитометрических анализов с использованием CD34, известного маркера LSC^17,в сочетании с поверхностной экспрессией NKG2DL путем либо использования распознавания панлигандов, либо окрашивания объед?...

Обсуждение

Здесь мы представляем два метода проточной цитометрии, которые могут обнаруживать поверхностную экспрессию NKG2DL на первичных клетках AML человека. Показано, что оба метода обнаружения могут быть использованы в сочетании с другими окрашиваниями антител (например, обнаружение экспрессии...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-amminoactinomycin D (7-AAD)	Invitrogen	A1310	Viability dye
96 well plate U bottom	Sarstedt	833925500	96 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34	BD	555824	Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614
Bovine Serum Albumin	PanReac AppliChem	A1391,0050	Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Roth	8043.1	Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS)	BioConcept	2-01F10-I	Component of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2	BD	/	Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A21222	Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF	R&D	1299-NK-050	Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID:
Human ULBP-1 Antibody	R&D	AF1380	Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 Antibody	R&D	AF1298	Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725
Human ULBP-3 Antibody	R&D	AF1517	Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835
MICA Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-35346	Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-66698	Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions	Miltenyibiotec	130-093-385	Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-500ML	Component of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A11034	Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um	Spherotech Inc.	RCP-30-20A	Beads used for flow cytometry device maintainance
RPMI medium	Sigma Aldrich	R8758-500ML	Cell culture medium
RayBright Universal Compensation Beads	Raybiotech	137-00013-100	Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL	Invitrogen	S866	Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection