Due approcci citometrici a flusso del rilevamento della superficie del ligando NKG2D per distinguere le cellule staminali dalle sottopopolazioni di massa nella leucemia mieloide acuta

Riepilogo

Presentiamo due diversi protocolli di colorazione per il rilevamento del ligando NKG2D (NKG2DL) nei campioni di leucemia mieloide acuta primaria umana (AML). Il primo approccio si basa su una proteina di fusione, in grado di riconoscere tutti i ligandi noti e potenzialmente ancora sconosciuti, mentre il secondo protocollo si basa sull'aggiunta di anticorpi anti-NKG2DL multipli.

Abstract

All'interno dello stesso paziente, l'assenza di espressione superficiale dei ligandi NKG2D (NKG2DL) ha dimostrato di distinguere le sottopopolazioni leucemiche con proprietà delle cellule staminali (le cosiddette cellule staminali leucemiche, LSC) da cellule leucemiche di controparte più differenziate che mancano di potenziale di iniziazione della malattia sebbene portino mutazioni genetiche specifiche della leucemia simili. Gli NKG2DL sono auto-molecole simili a MHC di classe I, biochimicamente molto diverse. Le cellule sane in condizioni omeostatiche generalmente non esprimono NKG2DL sulla superficie cellulare. Invece, l'espressione di questi ligandi è indotta dall'esposizione allo stress cellulare (ad esempio, trasformazione oncogenica o stimoli infettivi) per innescare l'eliminazione delle cellule danneggiate attraverso lalisi attraverso cellule immunitarie che esprimono il recettore NKG2D come le cellule natural killer (NK). È interessante notare che l'espressione superficiale di NKG2DL viene soppressa selettivamente nelle sottopopolazioni LSC, consentendo a queste cellule di eludere la sorveglianza immunitaria mediata da NKG2D. Qui, presentiamo un'analisi affiancata di due diversi metodi di citometria a flusso che consentono lo studio dell'espressione superficiale di NKG2DL sulle cellule tumorali, cioè un metodo che prevede il riconoscimento del pan-ligando e un metodo che prevede la colorazione con anticorpi multipli contro singoli ligandi. Questi metodi possono essere utilizzati per separare le sottopopolazioni cellulari negative NKG2DL vitali con proprietà putative delle cellule staminali tumorali dal NKG2DL positivo non LSC.

Introduzione

Le cellule NK sono importanti effettori del sistema immunitario innato in grado di riconoscere ed eliminare le cellule maligne o le cellule sane stressate (ad esempio, da un'infezione virale) senza previo stimolo dell'antigene¹. Questo processo è strettamente regolato attraverso un complesso repertorio di recettori attivanti - come recettori naturali della citotossicità (NCR), NKG2D e CD16 - e recettori inibitori che sono in gran parte rappresentati da recettori killer simili a immunoglobuline (KIR)². Il legame dei KIR con le molecole umane di antigene leucocitare (HLA) di classe I su cellule somatiche garantisce l'auto-riconoscimento e trasmette la tolleranza cellulare NK. D'altra parte, l'assenza di auto-riconoscimento e l'aumento del legame dei recettori attivanti ai loro ligandi sulle cellule bersaglio innescano il rilascio di granuli citotossici che portano alla citotossicità mediata dalle cellule NK¹. Infine, le cellule NK possono esercitare citotossicità cellulare dipendente dagli anticorpi (ADCC) legando il recettore di attivazione CD16 a bersagli che esprimono la porzione Fc di Ig (FcR)². Oltre alla citotossicità diretta, le cellule NK possono anche innescare il rilascio di citochine che collega l'innato con il sistema immunitario adattivo³.

NKG2D è un importante recettore attivante espresso su cellule NK, NKT, γδ T e INgenua CD8+ T^{4 che consente} a tali cellule immunitarie citotossiche di riconoscere e lisciviare il ligando NKG2D (NKG2DL) che esprime le cellule bersaglio. Le cellule sane comunemente non esprimono NKG2DL. Invece, l'espressione NKG2DL è upregolata su cellule maligne o infettate da virus per renderle suscettibili al nulla osta immunitario⁵.

La famiglia umana NKG2DL comprende otto molecole conosciute tra cui le due molecole A e B correlate alla catena MHC I (MICA e MICB⁶⁾e le proteine leganti ul16 del citomegalovirus 1-6 (ULBP1-6⁷). L'espressione di NKG2DL è regolata sui livelli trascrizionale, post-trascrizionale e post-traslazione⁸. Come tale, mentre l'espressione NKG2DL non è comunemente rilevabile sulla superficie di cellule sane, NKG2DL mRNA^{9 ed} espressione proteica intracellulare sono stati riportati nei tessuti sani. La rilevanza funzionale di tale espressione e i meccanismi alla base di tali modelli di espressione discrepant devono ancora essere^{definiti 10}.

La regolazione meccanicistica dell'espressione NKG2DL nelle cellule tumorali è un'affascinante area di indagine. Le vie note per essere coinvolte nello stress cellulare, ad esempio la via di stress da shock^{termico 9,}o le vie associate al danno al DNA, come l'atassia telangiectasia mutata (ATM) e la via¹¹correlata a Rad3 (ATR), così come le infezioni virali o batteriche sono state direttamente collegate all'induzione dell'espressione NKG2DL¹². Tuttavia, anche se l'espressione superficiale di NKG2DL è stata efficacemente indotta, questa espressione può essere persa di nuovo attraverso lo spargimento mediato proteoliticamente, un meccanismo associato alla fuga immunitaria e alla scarsa prognosi clinica in alcuni tumori¹³.

L'assenza di superficie cellulare NKG2DL può anche svolgere ruoli importanti nei pazienti con AML. Qui, il trattamento con chemioterapia intensiva spesso induce remissione, ma la ricaduta si verifica spesso da cellule staminali leucemiche (LSC), che sopravvivono selettivamente alle chemioterapie ed eludono la risposta immunitaria. Come abbiamo dimostrato di recente, gli LSC, ad esempio, sfuggono alla lisi cellulare NK sopprimendo l'espressione di superficie NKG2DL¹⁴.

Inversamente, l'assenza di espressione di NKG2DL superficiale può essere utilizzata come metodo per identificare e isolare vibilmente sottopopolazioni putative simili a staminali di cellule dalle sottopopolazioni leucemiche di controparte sfusa. Qui, presentiamo due approcci citometrici a flusso che possono essere utilizzati per rilevare l'espressione superficiale NKG2DL e quindi identificare le cellule staminali negative NKG2DL nella leucemia e forse anche in altri tumori: un metodo per il riconoscimento della superficie pan-ligando e un metodo che prevede la colorazione con anticorpi singoli o raggruppati che riconoscono singole proteine NKG2DL conosciute.

Protocollo

I campioni dei pazienti sono stati raccolti in seguito all'approvazione del Comitato di revisione etica degli ospedali universitari di Basilea e Tuebingen.

1. Biotinilazione della proteina di fusione NKG2D

NOTA: Questo passaggio viene eseguito con un kit di biotinylation (vedi Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Questa fase del protocollo deve essere eseguita almeno 24 ore prima della colorazione. La proteina di fusione NKG2D biotinilata deve essere conservata a -20 °C.

1. Scongelare sia la biotina, sia i tubi proteici di fusione NKG2D a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Se le cellule devono essere sterili per un ulteriore uso sperimentale (iniezione nei topi, test dell'unità di formazione della colonia, ecc.), ricostituire la proteina di fusione sotto una cappa di flusso laminare per evitare la contaminazione. Altrimenti, ogni passaggio può essere eseguito su una panchina.
2. Spin down rapidamente i 50μg di proteina fusion NKG2D lëfilizzata. Aggiungere 500 μL di salina tamponata con fosfato (PBS) per ricostituire la polvere e mescolare accuratamente utilizzando una micropipetta P1000.
3. Aggiungere 100 μL della proteina di fusione NKG2DL a un tubo di biotina per ottenere una concentrazione finale dello stock di 100 μg/mL.
4. Mescolare accuratamente la soluzione mediante sospensione continua con una micropipetta P100.
5. Incubare la soluzione di proteina di fusione/biotina in un RT controllato per 24 ore. La proteina da fusione è ora pronta all'uso.

2. Scongelamento delle cellule AML primarie

NOTA: Circa 5.000.000 di cellule leucemiche congelate per paziente immagazzinate in azoto liquido sono state scongelate e quindi utilizzate immediatamente per i test. Le cellule leucemiche sono state ottenute e congelate come descritto^{in precedenza 15}. In breve, campioni di sangue periferico raccolti da pazienti con AML e alte percentuali di cellule esplosive (>90% di esplosioni tra cellule mononucleari) sono stati elaborati con una separazione del gradiente di densità per ottenere cellule mononucleari e successivamente congelati nel siero fetale del vitello (FCS) contenente soluzione di solfossido di dimetile al 10% (DMSO). Numeri cellulari molto variati tra i pazienti in dipendenza dalla concentrazione di leucociti nel paziente (range: da 1.000.000 a 30.000.000 di cellule leucemiche per mL sangue).

1. Mezzo RPMI pre-caldo contenente il 10% di FCS a 37 °C utilizzando un bagno d'acqua. Per ogni flaconcino di celle AML (fino a 30.000.000 di celle in FCS da 1 ml + 10% DMSO), aggiungere 10 ml di mezzo preri riscaldato a un tubo di reazione da 15 ml.
2. Rimuovere l'AML crioviale contenente L'AML primario dallo stoccaggio di azoto liquido e scongelare immediatamente le cellule utilizzando un bagno d'acqua a 37 °C. Spostare delicatamente il tubo avanti e indietro nell'acqua, permettendo al contenuto del flaconcino di scongelarsi fino a quando non rimane solo un piccolo cristallo di ghiaccio.
3. Trasferire immediatamente le cellule scongelate nel tubo contenente mezzi e sciacquare il flaconcino utilizzando 1 ml di mezzo.
4. Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
5. Lavare le celle con 5 mL di mezzo RPMI contenente il 10% di FCS e centrifugare a 300 x g per 10 min.

3. Conteggio delle celle

1. Rimondiva il pellet cellulare in un volume noto di mezzo RPMI contenente il 10% di FCS.
2. Trasferire un piccolo volume della sospensione cellulare su un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml e diluire a un rapporto noto con trypan blu o qualsiasi altro colorante alternativo che consenta la discriminazione delle cellule vive / cellule morte.
3. Utilizzare qualsiasi dispositivo per contare le celle.
4. Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.

4. Colorazione di cellule AML primarie utilizzando la proteina di fusione NKG2D biotinilata

1. Preparare il tampone di colorazione integrando 500 mL PBS con albumina sierice bovina (BSA) e acido etilendiamminatetraacetico (EDTA) ad una concentrazione finale rispettivamente di 0,07 mM e 2 mM. Regolare il pH (7.2–7.4) se necessario.
2. Rimorsiva il pellet cellulare con tampone di colorazione ad una concentrazione finale di 0,5 x 10⁷ celle/mL.
   NOTA: Facoltativamente, prima della colorazione, le cellule possono essere incubate con un agente bloccante (ad esempio hIgG (1μg/ml) per 30 minuti presso l'agente bloccante RT o FcR)..
3. Trasferire 100 μL della sospensione cellulare in una piastra inferiore a U a 96 pozzetto e centrifugare la piastra a 300 x g per 10 minuti. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
4. Preparare un master mix di proteine di fusione NKG2D biotinylate in modo che le cellule siano rimorsipendate in un volume finale di 50 μL per pozzo con una concentrazione finale di 10 μg/mL per pozzo.
5. Aggiungere la miscela master preparata al passaggio 4.4 utilizzando una pipetta da 100 μL e rimorsi il pellet di cella con una pipetta multicanale da 300 μL.
   NOTA: Ridimensionare il volume finale in base al numero di cellule per ridurre la quantità di proteina da fusione necessaria per la colorazione.
6. Incubare la sospensione cellulare per 25 minuti a RT o 50 min a 4 °C.
7. Lavare le cellule aggiungendo 200 μL di tampone di colorazione per pozzo con una pipetta multicanale da 300 μL.
8. Centrifugare la piastra a 300 x g per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
9. Ripetere i passaggi 4.7 e 4.8.
   NOTA: La colorazione qui descritta viene eseguita in una piastra inferiore a U a 96 po 'di coltura cellulare. Pertanto, i passaggi di lavaggio vengono eseguiti due volte a causa della piccola capacità di volume di tali piastre. La colorazione può essere eseguita anche in altri tubi e le fasi di lavaggio potrebbero quindi essere eseguite una sola volta utilizzando un volume maggiore.
10. Preparare una miscela master utilizzando Streptavidin-PE (vedi tabella 1 per le diluizioni) in modo che le cellule siano rimorsi in un volume finale di 50 μL.
    NOTA: Aggiungi anticorpi di selezione per il tuo tipo di interesse cellulare come ad esempio CD33, CD34.... per AML.
11. Aggiungere la miscela principale preparata al passaggio 4.10 utilizzando una pipetta da 100 μL e rimorsi il pellet di cella con una pipetta multicanale da 300 μL.
12. Incubare le sospensioni cellulari per 15 minuti a RT o 30 minuti a 4 °C al buio.
13. Lavare le cellule aggiungendo 200 μL di tampone di colorazione per pozzo con una pipetta multicanale da 300 μL.
14. Centrifugare la piastra a 300 x g per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
15. Ripetere i passaggi 4.13 e 4.14.
16. Preparare una soluzione di tampone di colorazione tra cui 7-AAD (7-aminoactinomicina D, 1:1000) o qualsiasi reagente per distinguere tra cellule vive e morte.
17. Pellet di cellule resuspend in tampone di colorazione da 200 μL + 7-AAD preparato nella fase 4.16 utilizzando una micropipetta multicanale da 300 μL.
18. Analizzare le celle utilizzando un dispositivo di citometria a flusso.

5. Colorazione di anticorpi anti-NKG2DL singoli o raggruppati

1. Utilizzare la stessa sospensione cellulare del passaggio 4.2.
2. Trasferire 100 μL della sospensione cellulare su una piastra inferiore a U a 96 pozzetto di coltura cellulare utilizzando una pipetta multicanale da 300 μL e centrifugare la piastra a 300 x g per 10 minuti. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
3. Preparare una miscela di anticorpi per ciascun anticorpo primario o anticorpi raggruppati (vedi tabella 2 per le diluizioni) in modo che le cellule siano rimorsi in un volume finale di 50 μL.
4. Aggiungere la miscela principale preparata al passaggio 5.3 utilizzando una pipetta da 100 μL e rimorsi il pellet di cella con una pipetta multicanale da 300 μL.
5. Incubare le cellule per 25 minuti a RT.
6. Lavare le cellule aggiungendo 200 μL di tampone di colorazione per pozzo utilizzando una pipetta multicanale da 300 μL.
7. Centrifugare la piastra inferiore a U a 96 pozzi a 300 x g per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
8. Ripetere i passaggi 5.6 e 5.7.
9. Preparare una miscela di maestri anticorpi aggiungendo l'anticorpo secondario (vedi tabella 2 per le diluizioni) in modo che le cellule siano rimorsi in un volume finale di 50 μL per pozzo.
10. Aggiungere la miscela principale preparata al passaggio 5.9 utilizzando una pipetta da 100 μL e rimorsi il pellet di cella con una pipetta multicanale da 300 μL.
11. Incubare per 15 minuti a RT o 30 minuti a 4 °C al buio.
12. Lavare aggiungendo 200 μL di tampone di colorazione per pozzo utilizzando una pipetta multicanale da 300 μL.
13. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 minuti e scartare il supernatante senza disturbare il pellet.
14. Ripetere i passaggi 5.12 e 5.13.
15. Pellet di cellule resuspend in tampone di colorazione da 200 μL contenente 7-AAD preparato nella fase 4.16.
16. Analizzare le cellule utilizzando un dispositivo di citometria a flusso come descritto nel passaggio 6.

6. Acquisizione dei dati

NOTA: Assicurarsi che vengano eseguiti controlli di qualità settimanali del citometro di flusso per garantire che i laser funzionino correttamente. Per il protocollo qui presentato, viene eseguito un processo settimanale di citometro e tracciamento (CTS) con perline relative per controllare le prestazioni laser su tutti i canali. Dopo il CTS, vengono registrati 10.000 eventi utilizzando le perline a 8 picchi come controllo interno. Tutti i picchi dovrebbero essere nella stessa posizione all'interno dei loro cancelli e ben separati l'uno dall'altro.

1. Create la compensazione della matrice per sottrarre sovrapposizioni spettrali tra rivelatori con perline o con celle¹⁶.
2. Registra 10.000 eventi per le celle non macchiate e le singole perline macchiate. Per i controlli fluorescenza meno uno (FMO), registrare 50.000 eventi e per i campioni macchiati record fino a 100.000 eventi.
   NOTA: In alternativa, è possibile eseguire singoli campioni macchiati sulle celle. In tal caso, assicurarsi che le celle abbiano un segnale positivo per il marcatore desiderato.
3. Acquisire una singola cella macchiata o un campione di perline per ogni fluoroforo utilizzato nell'esperimento per rivelare la quantità di sovrapposizione spettrale. Utilizzare il creatore di compensazioni del dispositivo di citometria del flusso per calcolare i valori di spill-over e applicare la matrice di compensazione a tutti i campioni misurati.
   NOTA: Gli anticorpi secondari non possono essere utilizzati per la creazione di compensazioni utilizzando perline se la compensazione è calcolata con perline. A seconda del tipo di perline di compensazione, gli anticorpi secondari non possono essere utilizzati per la compensazione con perline.
4. Per i controlli FMO e i campioni macchiati completi con la proteina di fusione, in primo luogo, selezionare le cellule in base alla loro dispersione in avanti (FSC) e alla dispersione laterale (SSC). Dopo l'esclusione dei farsa, gate le cellule in base alla loro negatività per il segnale 7-AAD (PercP-Cy5.5) per escludere le cellule morte (vedi passaggio 5.15). Il grafico finale mostra l'espressione di CD34 (asse Y) e NKG2DL (asse X) su singoletti viventi.
5. Per i singoli anticorpi anti-NKG2DL, applicare la stessa strategia ai campioni, ma si noti che la positività del ligando risiede in Alexa Fluor 488 e non nel canale PE.
6. Regolare i cancelli in base ai comandi FMO per la strategia di gating dai punti 6.4 e 6.5 (vedi tabella 3) per i controlli FMO appropriati da eseguire per questo esperimento: nel software di analisi, disegnare un cancello sulla frazione negativa. Durante la registrazione del campione macchiato completo, le celle sopra il cancello creato in precedenza sono positive per il marcatore analizzato.

Risultati

Entrambi i protocolli qui presentati consentono l'arricchimento di AML LSC mediante analisi citometriche di flusso utilizzando CD34, un marcatore noto di LSC¹⁷, in combinazione con l'espressione superficiale NKG2DL utilizzando il riconoscimento pan-ligando o macchiando con anticorpi raggruppati contro singoli ligandi. Nella figura 1, mostriamo che i campioni di AML analizzati sono positivi per CD34 e NKG2DL, ma esistono anche sottopopolazioni negative, che è mostrata...

Discussione

Qui presentiamo due metodi citometrici a flusso in grado di rilevare l'espressione di superficie NKG2DL sulle cellule AML primarie umane. Mostriamo che entrambi i metodi di rilevamento possono essere utilizzati in combinazione con altre colorazioni anticorpali (ad esempio, rilevando l'espressione CD34). Colorazioni simili possono essere eseguite anche su altri tipi di cellule primarie e linee cellulari.

Di recente abbiamo dimostrato che l'assenza di NKG2DL sulla superficie delle esplosioni del...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-amminoactinomycin D (7-AAD)	Invitrogen	A1310	Viability dye
96 well plate U bottom	Sarstedt	833925500	96 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34	BD	555824	Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614
Bovine Serum Albumin	PanReac AppliChem	A1391,0050	Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Roth	8043.1	Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS)	BioConcept	2-01F10-I	Component of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2	BD	/	Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A21222	Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF	R&D	1299-NK-050	Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID:
Human ULBP-1 Antibody	R&D	AF1380	Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 Antibody	R&D	AF1298	Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725
Human ULBP-3 Antibody	R&D	AF1517	Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835
MICA Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-35346	Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-66698	Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions	Miltenyibiotec	130-093-385	Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-500ML	Component of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A11034	Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um	Spherotech Inc.	RCP-30-20A	Beads used for flow cytometry device maintainance
RPMI medium	Sigma Aldrich	R8758-500ML	Cell culture medium
RayBright Universal Compensation Beads	Raybiotech	137-00013-100	Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL	Invitrogen	S866	Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection