Zwei durchflusszytometrische Ansätze der NKG2D-Ligandenoberflächendetektion zur Unterscheidung von Stammzellen von Massensubpopulationen bei akuter myeloischer Leukämie

Zusammenfassung

Wir präsentieren zwei verschiedene Färbeprotokolle für den Nachweis von NKG2D-Liganden (NKG2DL) in Humanproben mit primärer akuter myeloischer Leukämie (AML). Der erste Ansatz basiert auf einem Fusionsprotein, das in der Lage ist, alle bekannten und möglicherweise noch unbekannten Liganden zu erkennen, während das zweite Protokoll auf der Zugabe mehrerer Anti-NKG2DL-Antikörper beruht.

Zusammenfassung

Innerhalb desselben Patienten wurde gezeigt, dass das Fehlen einer Oberflächenexpression von NKG2D-Liganden (NKG2DL) leukämische Subpopulationen mit Stammzelleigenschaften (sogenannte leukämische Stammzellen, LSCs) von differenzierteren leukämischen Gegenstückzellen unterscheidet, denen das Krankheitsinitiierungspotenzial fehlt, obwohl sie ähnliche leukämiespezifische genetische Mutationen aufweisen. NKG2DL sind biochemisch sehr vielfältige MHC-Klasse-I-ähnliche Selbstmoleküle. Gesunde Zellen unter homöostatischen Zuständen exprimieren im Allgemeinen kein NKG2DL auf der Zelloberfläche. Stattdessen wird die Expression dieser Liganden bei Exposition gegenüber zellulärem Stress (z. B. onkogene Transformation oder infektiöse Reize) induziert, um die Eliminierung geschädigter Zellen durch Lyse durch NKG2D-Rezeptor-exprimierende Immunzellen wie natürliche Killerzellen (NK) auszulösen. Interessanterweise wird die NKG2DL-Oberflächenexpression in LSC-Subpopulationen selektiv unterdrückt, so dass diese Zellen der NKG2D-vermittelten Immunüberwachung entgehen können. Hier präsentieren wir eine Parallelanalyse von zwei verschiedenen Durchflusszytometrie-Methoden, die die Untersuchung der NKG2DL-Oberflächenexpression auf Krebszellen ermöglichen, d.h. eine Methode mit Panligandenerkennung und eine Methode, bei der mit mehreren Antikörpern gegen einzelne Liganden gefärbt wird. Diese Methoden können verwendet werden, um lebensfähige NKG2DL-negative zelluläre Subpopulationen mit mutmaßlichen Krebsstammzelleigenschaften von NKG2DL-positiven Nicht-LSC-Eigenschaften zu trennen.

Einleitung

NK-Zellen sind wichtige Effektoren des angeborenen Immunsystems, die bösartige Zellen oder gestresste gesunde Zellen (z.B. durch eine Virusinfektion) ohne vorherige Antigenstimulation erkennen und eliminieren können¹. Dieser Prozess wird durch ein komplexes Repertoire an aktivierenden Rezeptoren – wie natürliche Zytotoxizitätsrezeptoren (NCRs), NKG2D und CD16 – und inhibitorische Rezeptoren, die weitgehend durch Killer-Immunglobulin-ähnliche Rezeptoren (KIRs) repräsentiert werden, streng reguliert². Die Bindung von KIRs an humane Leukozytenantigen (HLA)-Klasse-I-Moleküle auf somatischen Zellen gewährleistet die Selbsterkennung und vermittelt NK-Zelltoleranz. Auf der anderen Seite lösen das Fehlen von Selbsterkennung und die erhöhte Bindung von aktivierenden Rezeptoren an ihre Liganden auf den Zielzellen die Freisetzung von zytotoxischen Granula aus, die zu einer NK-zellvermittelten Zytotoxizität führen¹. Schließlich können NK-Zellen eine Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) ausüben, indem sie den aktivierenden Rezeptor CD16 an Ziele binden, die den Fc-Anteil von Ig (FcR)²exprimieren. Neben der direkten Zytotoxizität können NK-Zellen auch die Zytokinfreisetzung auslösen, die das Angeborene mit dem adaptiven Immunsystem überbrückt³.

NKG2D ist ein wichtiger aktivierender Rezeptor, der auf NK-, NKT-, γδ T- und naiven CD8+ T-Zellen⁴ exprimiert wird und es solchen zytotoxischen Immunzellen ermöglicht, NKG2D-Liganden (NKG2DL) exprimierende Zielzellen zu erkennen und zu lysieren. Gesunde Zellen exprimieren normalerweise kein NKG2DL. Stattdessen wird die NKG2DL-Expression auf bösartigen oder virusinfizierten Zellen hochreguliert, um diese für die Immunclearance 5 zu^verbessern.

Die humane NKG2DL-Familie umfasst acht bekannte Moleküle, darunter die beiden MHC-I-Kettenmoleküle A und B (MICA und MICB⁶⁾und die Cytomegalievirus UL16-bindenden Proteine 1–6 (ULBP1-6^7). Die Expression von NKG2DL wird auf der transkriptionellen, posttranskriptionellen sowie post-translationalen Ebene⁸reguliert. Während die NKG2DL-Expression auf der Oberfläche gesunder Zellen normalerweise nicht nachweisbar ist, wurden NKG2DL mRNA⁹ und intrazelluläre Proteinexpression in gesunden Geweben berichtet. Die funktionelle Relevanz eines solchen Ausdrucks und die Mechanismen, die solchen abweichenden Ausdrucksmustern zugrunde liegen, müssen noch definiert werden¹⁰.

Die mechanistische Regulation der NKG2DL-Expression in den Krebszellen ist ein faszinierendes Untersuchungsgebiet. Signalwege, von denen bekannt ist, dass sie entweder an zellulärem Stress beteiligt sind, z. B. der Hitzeschockstressweg^9,oder DNA-schadensbedingte Signalwege, wie der Ataxie-Teleangiektasie-mutierte (ATM) und Rad3-assoziierte (ATR) Weg^11,sowie virale oder bakterielle Infektionen wurden direkt mit der Induktion der NKG2DL-Expression¹²in Verbindung gebracht. Aber selbst wenn die Oberflächenexpression von NKG2DL effektiv induziert wurde, kann diese Expression durch proteolytisch vermittelte Ausscheidung wieder verloren gehen, ein Mechanismus, der bei einigen Krebsarten mit Immunentwehung und schlechter klinischer Prognose verbunden ist¹³.

Das Fehlen von Zelloberflächen-NKG2DL kann auch bei Patienten mit AML eine wichtige Rolle spielen. Hier induziert die Behandlung mit intensiver Chemotherapie oft eine Remission, aber ein Rückfall tritt häufig aus leukämischen Stammzellen (LSC) auf, die Chemotherapien selektiv überleben und der Immunantwort entgehen. Wie wir kürzlich gezeigt haben, entgehen LSCs beispielsweise der NK-Zelllyse, indem sie die NKG2DL-Oberflächenexpression¹⁴unterdrücken.

Umgekehrt kann das Fehlen einer Oberflächen-NKG2DL-Expression als Methode verwendet werden, um mutmaßliche stammähnliche Subpopulationen von Zellen aus leukämischen Subpopulationen zu identifizieren und kämisch zu isolieren. Hier stellen wir zwei durchflusszytometrische Ansätze vor, mit denen die NKG2DL-Oberflächenexpression nachgewiesen und damit NKG2DL-negative Stammzellen bei Leukämie und vielleicht auch bei anderen Krebsarten identifiziert werden können: Eine Methode zur Panliganden-Oberflächenerkennung und eine Methode zur Färbung mit einzelnen oder gepoolten Antikörpern, die einzelne bekannte NKG2DL-Proteine erkennen.

Protokoll

Patientenproben wurden nach Bewilligung durch die Ethikprüfungskommission der Universitätsspitäler Basel und Tübingen erhoben.

1. Biotinylierung des NKG2D-Fusionsproteins

HINWEIS: Dieser Schritt wird mit einem Biotinylierungskit (siehe Materialtabelle)gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Dieser Schritt des Protokolls muss mindestens 24 Stunden vor der Färbung durchgeführt werden. Das biotinylierte NKG2D-Fusionsprotein sollte bei -20 °C gelagert werden.

1. Tauen Sie sowohl das Biotin als auch die NKG2D-Fusionsproteinröhrchen bei Raumtemperatur (RT) auf.
   HINWEIS: Wenn die Zellen für weitere experimentelle Verwendungen steril sein müssen (Injektion in Mäuse, koloniebildende Einheitentests usw.), rekonstituieren Sie das Fusionsprotein unter einer laminaren Strömungshaube, um eine Kontamination zu vermeiden. Ansonsten kann jeder Schritt auf einer Bank durchgeführt werden.
2. Drehen Sie schnell das 50μg lyophilisierte NKG2D-Fusionsprotein herunter. Fügen Sie 500 μL phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzu, um das Pulver zu rekonstituieren, und mischen Sie es gründlich mit einer P1000-Mikropipette.
3. 100 μL des NKG2DL-Fusionsproteins werden in ein Biotinröhrchen gegeben, um eine endgültige Stammkonzentration von 100 μg/ml zu erhalten.
4. Mischen Sie die Lösung gründlich durch kontinuierliches Wiederaufbewenden mit einer P100-Mikropipette.
5. Inkubieren Sie die Fusionsprotein/Biotinlösung bei einem kontrollierten RT für 24 h. Das Fusionsprotein ist nun einsatzbereit.

2. Auftauen primärer AML-Zellen

HINWEIS: Ungefähr 5.000.000 gefrorene leukämische Zellen pro Patient, die in flüssigem Stickstoff gelagert wurden, wurden aufgetaut und dann sofort für die Assays verwendet. Leukämische Zellen wurden wie zuvor beschrieben gewonnen und eingefroren¹⁵. Kurz gesagt, periphere Blutproben, die von Patienten mit AML und hohen Blastenzellanteilen (>90% der Blasten zwischen mononukleären Zellen) entnommen wurden, wurden mit einer Dichtegradiententrennung verarbeitet, um mononukleäre Zellen zu erhalten, und anschließend in fetalem Kalbserum (FCS) mit 10% Dimethylsulfoxidlösung (DMSO) eingefroren. Die Zellzahlen variierten stark zwischen den Patienten in Abhängigkeit von der Leukozytenkonzentration im Patienten (Bereich: 1.000.000 bis 30.000.000 leukämische Zellen pro ml Blut).

1. Vorwärmen rpmI-Medium mit 10% FCS bei 37 °C in einem Wasserbad. Für jede Durchstechflasche mit AML-Zellen (bis zu 30.000.000 Zellen in 1 ml FCS + 10% DMSO) werden 10 ml vorgewärmtes Medium in ein 15 ml Reaktionsröhrchen gegeben.
2. Entfernen Sie die kryoviale primäre AML aus dem Flüssigstickstoffspeicher und tauen Sie die Zellen sofort mit einem 37 °C Wasserbad auf. Bewegen Sie das Röhrchen vorsichtig im Wasser hin und her, damit der Inhalt der Durchstechflasche auftauen kann, bis nur noch ein kleiner Eiskristall übrig ist.
3. Geben Sie die aufgetauten Zellen sofort in das mediumhaltige Röhrchen und spülen Sie die Durchstechflasche mit 1 ml Medium aus.
4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
5. Waschen Sie die Zellen mit 5 ml RPMI-Medium, das 10% FCS enthält, und zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min.

3. Zellzählung

1. Das Zellpellet wird in einem bekannten RPMI-Medium, das 10% FCS enthält, wieder aufsetzen.
2. Ein kleines Volumen der Zellsuspension wird in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und in einem bekannten Verhältnis mit Trypanblau oder einem anderen alternativen Farbstoff verdünnt, der eine Unterscheidung zwischen lebenden Zellen und toten Zellen ermöglicht.
3. Verwenden Sie ein beliebiges Gerät, um die Zellen zu zählen.
4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.

4. Färbung primärer AML-Zellen mit dem biotinylierten NKG2D-Fusionsprotein

1. Bereiten Sie den Färbepuffer vor, indem Sie 500 ml PBS mit Rinderserumalbumin (BSA) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) auf eine Endkonzentration von 0,07 mM bzw. 2 mM ergänzen. Passen Sie den pH-Wert (7,2–7,4) bei Bedarf an.
2. Das Zellpellet mit Färbepuffer wird auf eine Endkonzentration von 0,5 x 10⁷ Zellen/ml resuspendiert.
   HINWEIS: Optional können die Zellen vor der Färbung mit einem Blockierungsmittel (z.B. hIgG (1μg/ml) für 30 min bei RT oder FcR-Blockierungsmittel) inkubiert werden.
3. 100 μL der Zellsuspension auf eine Zellkultur-96-Well-U-Bodenplatte geben und die Platte bei 300 x g für 10 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
4. Bereiten Sie eine Mastermischung aus biotinyliertem NKG2D-Fusionsprotein vor, so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 μL pro Vertiefung mit einer Endkonzentration von 10 μg / ml pro Vertiefung resuspendiert werden.
5. Fügen Sie die in Schritt 4.4 hergestellte Mastermischung mit einer 100 μL-Pipette hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 300 μL-Mehrkanalpipette.
   HINWEIS: Skalieren Sie das endende Volumen entsprechend der Anzahl der Zellen, um die menge an Fusionsprotein zu reduzieren, die für die Färbung erforderlich ist.
6. Inkubieren Sie die Zellsuspension für 25 min bei RT oder 50 min bei 4 °C.
7. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 200 μL Färbepuffer pro Vertiefung mit einer 300 μL Mehrkanalpipette.
8. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
9. Wiederholen Sie die Schritte 4.7 und 4.8.
   HINWEIS: Die hier beschriebene Färbung erfolgt in einer Zellkultur-96-Well-U-Bodenplatte. Daher werden Waschschritte aufgrund der geringen Volumenkapazität solcher Platten zweimal durchgeführt. Die Färbung kann auch in anderen Röhrchen durchgeführt werden und Waschschritte können dann nur einmal mit einem größeren Volumen durchgeführt werden.
10. Bereiten Sie eine Mastermischung mit Streptavidin-PE vor (siehe Tabelle 1 für Verdünnungen), so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 μL resuspendiert werden.
    HINWEIS: Fügen Sie Selektionsantikörper für Ihren Zelltyp von Interesse hinzu, wie z.B. CD33, CD34.... für AML.
11. Fügen Sie die in Schritt 4.10 vorbereitete Mastermischung mit einer 100 μL-Pipette hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 300 μL-Mehrkanalpipette.
12. Inkubieren Sie die Zellsuspensionen für 15 min bei RT oder 30 min bei 4 °C im Dunkeln.
13. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 200 μL Färbepuffer pro Vertiefung mit einer 300 μL Mehrkanalpipette.
14. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
15. Wiederholen Sie die Schritte 4.13 und 4.14.
16. Bereiten Sie eine Lösung aus Färbepuffer einschließlich 7-AAD (7-Aminoactinomycin D, 1:1000) oder einem reagenz an, um zwischen lebenden und toten Zellen zu unterscheiden.
17. Resuspend-Zellpellets in 200 μL Färbepuffer + 7-AAD, hergestellt in Schritt 4.16 unter Verwendung einer 300 μL Mehrkanal-Mikropipette.
18. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriegerät.

5. Färbung einzelner oder gepoolter einzelner Anti-NKG2DL-Antikörper

1. Verwenden Sie dieselbe Zellsuspension wie in Schritt 4.2.
2. 100 μL der Zellsuspension mit einer 300 μL Mehrkanalpipette auf eine Zellkultur-96-Well-U-Bodenplatte übertragen und die Platte bei 300 x g für 10 min zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
3. Bereiten Sie für jeden primären Antikörper oder gepoolte Antikörper einen Antikörper-Master-Mix vor (siehe Tabelle 2 für Verdünnungen), so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 μL resuspendiert werden.
4. Fügen Sie die in Schritt 5.3 hergestellte Mastermischung mit einer 100 μL-Pipette hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 300 μL-Mehrkanalpipette.
5. Inkubieren Sie die Zellen für 25 minuten bei RT.
6. Waschen Sie die Zellen, indem Sie 200 μL Färbepuffer pro Vertiefung mit einer 300 μL Mehrkanalpipette hinzufügen.
7. Zentrifugieren Sie die Zellkultur 96-Well-U-Bodenplatte bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
8. Wiederholen Sie die Schritte 5.6 und 5.7.
9. Bereiten Sie einen Antikörper-Master-Mix vor, indem Sie den sekundären Antikörper hinzufügen (siehe Tabelle 2 für Verdünnungen), so dass die Zellen in einem Endvolumen von 50 μL pro Vertiefung resuspendiert werden.
10. Fügen Sie die in Schritt 5.9 vorbereitete Mastermischung mit einer 100 μL-Pipette hinzu und resuspendieren Sie die Zellpellets mit einer 300 μL-Mehrkanalpipette.
11. 15 min bei RT oder 30 min bei 4 °C im Dunkeln inkubieren.
12. Waschen Sie durch Zugabe von 200 μL Färbepuffer pro Vertiefung mit einer 300 μL Mehrkanalpipette.
13. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 x g für 10 min und entsorgen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
14. Wiederholen Sie die Schritte 5.12 und 5.13.
15. Resuspend Zellpellets in 200 μL Färbepuffer mit 7-AAD, hergestellt in Schritt 4.16.
16. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometriegerät, wie in Schritt 6 beschrieben.

6. Datenerfassung

HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass wöchentliche Qualitätskontrollen des Durchflusszytometers durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Laser ordnungsgemäß funktionieren. Für das hier vorgestellte Protokoll wird ein wöchentlicher CtS-Prozess (Cytometer and Tracking) mit relativen Perlen durchgeführt, um die Laserleistung auf allen Kanälen zu überprüfen. Nach dem CTS werden 10.000 Ereignisse mit den 8-Peak-Perlen als interne Kontrolle aufgezeichnet. Alle Gipfel sollten sich in der gleichen Position innerhalb ihrer Tore befinden und gut voneinander getrennt sein.

1. Erzeugen Sie die Matrixkompensation, um die spektrale Überlappung zwischen Detektoren mit Perlen oder mit Zellen¹⁶zu subtrahieren.
2. Zeichnen Sie 10.000 Ereignisse für die nicht gefärbten Zellen und die einzelnen gefärbten Perlen auf. Für die Fluoreszenz-Minus-Eins-Kontrollen (FMO) zeichnen Sie 50.000 Ereignisse auf und für die vollständig gefärbten Proben bis zu 100.000 Ereignisse auf.
   HINWEIS: Alternativ können einzelne gefärbte Proben an den Zellen durchgeführt werden. Wenn ja, stellen Sie sicher, dass die Zellen ein positives Signal für den gewünschten Marker haben.
3. Erwerben Sie eine einzelne gefärbte Zell- oder Perlenprobe für jedes Fluorophor, das im Experiment verwendet wird, um die Menge der spektralen Überlappung aufzudecken. Verwenden Sie den Kompensationsersteller des Durchflusszytometriegeräts, um Spillover-Werte zu berechnen und die Kompensationsmatrix auf alle gemessenen Proben anzuwenden.
   HINWEIS: Sekundäre Antikörper können nicht für die Kompensationserstellung mit Perlen verwendet werden, wenn die Kompensation mit Perlen berechnet wird. Je nach Art der Kompensationsperlen können sekundäre Antikörper nicht für die Kompensation mit Perlen verwendet werden.
4. Für die FMO-Kontrollen und die vollständig gefärbten Proben mit dem Fusionsprotein wählen Sie zunächst die Zellen basierend auf ihrer Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) aus. Nach dem Ausschluss von Duplätten die Zellen basierend auf ihrer Negativität für das 7-AAD-Signal (PercP-Cy5.5) ein, um die toten Zellen auszuschließen (siehe Schritt 5.15). Das letzte Diagramm zeigt den Ausdruck von CD34 (Y-Achse) und NKG2DL (X-Achse) auf lebenden Singustücken.
5. Wenden Sie für die einzelnen Anti-NKG2DL-Antikörper die gleiche Strategie auf die Proben an, beachten Sie jedoch, dass die Ligandenpositivität in Alexa Fluor 488 und nicht im PE-Kanal liegt.
6. Passen Sie die Gatter entsprechend den FMO-Steuerungen für die Gating-Strategie aus schritt 6.4 und 6.5 (siehe Tabelle 3)an, um geeignete FMO-Kontrollen für dieses Experiment durchzuführen: Zeichnen Sie in der Analysesoftware ein Tor auf die negative Fraktion. Während der Aufzeichnung der vollständig gefärbten Probe sind die Zellen über dem zuvor erzeugten Gate positiv für den analysierten Marker.

Ergebnisse

Beide hier vorgestellten Protokolle ermöglichen die Anreicherung von AML LSC durch durchflusszytometrische Analysen mit CD34, einem bekannten Marker von LSC¹⁷, in Kombination mit NKG2DL-Oberflächenexpression durch entweder unter Verwendung der Panligandenerkennung oder Färbung mit gepoolten Antikörpern gegen einzelne Liganden. In Abbildung 1zeigen wir, dass die analysierten AML-Proben positiv für CD34 und NKG2DL sind, aber auch negative Subpopulationen existieren...

Diskussion

Hier stellen wir zwei durchflusszytometrische Methoden vor, die die NKG2DL-Oberflächenexpression auf menschlichen primären AML-Zellen nachweisen können. Wir zeigen, dass beide Nachweismethoden in Verbindung mit anderen Antikörperfärbungen (z.B. Nachweis der CD34-Expression) eingesetzt werden können. Ähnliche Färbungen können auch an anderen primären Zelltypen und Zelllinien durchgeführt werden.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass das Fehlen von NKG2DL auf der Oberfläche von AML-Patie...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-amminoactinomycin D (7-AAD)	Invitrogen	A1310	Viability dye
96 well plate U bottom	Sarstedt	833925500	96 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34	BD	555824	Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614
Bovine Serum Albumin	PanReac AppliChem	A1391,0050	Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Roth	8043.1	Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS)	BioConcept	2-01F10-I	Component of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2	BD	/	Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A21222	Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF	R&D	1299-NK-050	Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID:
Human ULBP-1 Antibody	R&D	AF1380	Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 Antibody	R&D	AF1298	Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725
Human ULBP-3 Antibody	R&D	AF1517	Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835
MICA Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-35346	Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-66698	Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions	Miltenyibiotec	130-093-385	Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-500ML	Component of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A11034	Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um	Spherotech Inc.	RCP-30-20A	Beads used for flow cytometry device maintainance
RPMI medium	Sigma Aldrich	R8758-500ML	Cell culture medium
RayBright Universal Compensation Beads	Raybiotech	137-00013-100	Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL	Invitrogen	S866	Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection