急性骨髄性白血病におけるバルク亜集団と幹細胞を区別するNKG2Dリガンド表面検出の2つのフローサイトメトリックアプローチ

要約

ヒトの原発性急性骨髄性白血病(AML)サンプルにおけるNKG2Dリガンド(NKG2DL)検出用の2つの異なる染色プロトコルを提示する。最初のアプローチは融合タンパク質に基づいており、既知であり、潜在的に未知のリガンドをすべて認識することができ、第2のプロトコルは複数の抗NKG2DL抗体の添加に依存する。

要約

同じ患者内で、NKG2Dリガンド(NKG2DL)表面発現の欠如は、同様の白血病特異的遺伝子変異を有するが疾患開始可能性を欠く、より分化された白血病細胞と幹細胞特性(いわゆる白血病幹細胞、LSC)を有する白血病亜集団を区別することが示された。NKG2DLは、生化学的に多様なMHCクラスI型自己分子です。恒常性状態の健康な細胞は、一般に、細胞表面上でNKG2DLを発現しない。その代わりに、これらのリガンドの発現は、細胞ストレス(例えば、発癌性転換または感染性刺激)への曝露時に誘導され、ナチュラルキラー(NK)細胞などのNKG2D受容体発現免疫細胞を介してライシスを介して損傷した細胞の排除を引き起こす。興味深いことに、NKG2DL表面発現はLSC亜集団において選択的に抑制され、これらの細胞はNKG2D媒介性免疫監視を回避することを可能にする。ここでは、がん細胞上でのNKG2DL表面発現の解析を可能にする2つの異なるフローサイトメトリー法、すなわち汎リガンド認識を含む方法、および単一リガンドに対する複数の抗体による染色を含む方法を並べて分析する。これらの方法は、NKG2DL陽性非LSCから推定癌幹細胞特性を有する生存可能なNKG2DL陰性細胞亜集団を分離するために使用することができる。

概要

NK細胞は、予め抗原刺激を伴わずに悪性細胞またはストレスを受けた健康な細胞(例えばウイルス感染によって)を認識・排除することができる自然免疫系の重要なエフェクター^である。このプロセスは、天然細胞毒性受容体(NDR)、NKG2DおよびCD16などの活性化受容体の複雑なレパートリーと、主にキラー免疫グロブリン様受容体(KIRs)2によって表される阻害受容体を介して厳しく調節される。体細胞上のヒト白血球抗原(HLA)クラスI分子へのKIRsの結合は自己認識を保障し、NK細胞耐性を伝える。一方、自己認識の欠如および標的細胞上のそれらのリガンドへの活性化受容体の結合の増加は、NK細胞媒介細胞傷害性¹につながる細胞傷害性顆粒の放出を引き起こす。最後に、NK細胞は、活性化受容体CD16をIg(FcR)2のFc部分を発現する標的に結合することにより、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を発揮することができる。直接的な細胞傷害性とは別に、NK細胞はまた、適応免疫系³と自然をつなぎサイトカイン放出を引き起こすことができる。

NKG2DはNK、NKT、γδT、およびナイーブCD8+T細胞⁴ 上で発現される主要な活性化受容体であり、そのような細胞傷害性免疫細胞がNKG2Dリガンド(NKG2DL)を認識およびライゼすることを可能にする標的細胞である。健康な細胞は一般にNKG2DLを発現しない。代わりに、NKG2DL発現は悪性細胞またはウイルス感染細胞上でアップレギュレートされ、免疫クリアランス⁵に対してこれらを受け入れ可能にする。

ヒトNKG2DLファミリーは、2つのMHC I鎖関連分子AおよびB(MICAおよび^MICB6)およびサイトメガロウイルスUL16結合タンパク質1~6(ULBP1-6⁷⁾を含む8つの既知の分子から構成される。NKG2DLの発現は、転写、転写後、およびトランスレーショナル後レベル⁸で調節される。このように、NKG2DL発現は一般に健康な細胞の表面では検出できないが、NKG2DL mRNA⁹ および細胞内タンパク質発現は健康組織において報告された。このような式の機能的関連性と、このような不定式表現パターンの基礎となるメカニズムは^、10に定義されたままである。

がん細胞におけるNKG2DL発現の機構調節は、魅力的な研究分野です。細胞ストレスのいずれかに関与することが知られている経路、例えば、熱ショックストレス経路^9、または変異した運動失調性血管拡張症(ATM)およびRad3関連(ATR)経路¹¹などのDNA損傷関連経路、ならびにウイルスまたは細菌感染がNKG2DL発現¹²の誘導に直接関連している。しかし、たとえNKG2DLの表面発現が効果的に誘導されたとしても、この発現は、タンパク質分解媒介性脱落を通じて再び失われ得る、一部の癌¹³における免疫脱出および悪い臨床予後に関連するメカニズムである。

細胞表面NKG2DLの不在は、AML患者において重要な役割を果たす可能性もある。ここで、集中的な化学療法による治療はしばしば寛解を誘発するが、再発はしばしば白血病幹細胞(LSC)から起こり、化学療法を選択的に生き残り、免疫応答を回避する。我々が最近示したように、LSCは、例えば、NKG2DL表面発現¹⁴を抑制することによってNK細胞のリシスを逃れる。

逆に、表面NKG2DL発現の欠如は、バルク対応白血病亜集団から細胞の推定茎様部分集団を同定し、生存可能に単離する方法として使用することができる。ここでは、NKG2DL表面発現を検出し、白血病および他の癌においてもNKG2DL陰性幹細胞を同定するために使用できる2つのフローサイトメトリックアプローチを提示する:汎リガンド表面認識のための方法および既知のNKG2DLタンパク質を認識する単一またはプール抗体による染色を含む方法。

プロトコル

患者サンプルは、バーゼル大学病院とテュービンゲン大学病院の倫理審査委員会の承認を受けて収集された。

1. NKG2D融合タンパク質のビオチン化

注: この手順は、製造元の指示に従って、ビオチン化キット( 資料表を参照)で実行されます。このプロトコルのステップは、染色の少なくとも24時間前に行わなければならない。ビオチン化されたNKG2D融合タンパク質は-20°Cで保存する必要があります。

1. ビオチンとNKG2D融合タンパク質チューブ(RT)の両方を解凍する。
   注:細胞がさらなる実験用(マウスでの注入、コロニー形成ユニットアッセイなど)のために無菌である必要がある場合は、混入を避けるために層流フードの下で融合タンパク質を再構成してください。それ以外の場合は、各ステップをベンチで実行できます。
2. 50μgの凍結乾燥NKG2D融合タンパク質を素早くスピンダウンします。500 μL のリン酸緩衝生理食塩分 (PBS) を加え、粉末を再構成し、P1000 マイクロピペットを使用して十分に混合します。
3. NKG2DL融合タンパク質100μLをビオチンチューブに加え、最終ストック濃度100μg/mLを得ます。
4. P100マイクロピペットで連続再懸濁液を使用して溶液を完全に混合します。
5. 24時間制御されたRTで融合タンパク質/ビオチン溶液をインキュベートする。融合タンパク質を使用する準備ができました。

2. 原発AML細胞の解凍

注:液体窒素に貯蔵された患者1人につき約5,000,000個の凍結白血病細胞を解凍し、すぐにアッセイに使用しました。白血病細胞を得て、前述の¹⁵のように凍結した。簡単に言えば、AMLおよび高い爆風細胞パーセント(単核細胞中の爆風の>90%)を有する患者から採取した末梢血試料を、単核細胞を得るために密度勾配分離で処理し、その後10%ジメチルスルホキシド溶液(DMSO)を含む胎児子牛血清(FCS)で凍結した。細胞数は、患者の白血球濃度に依存する患者間で非常に変化した(範囲:1,000,000〜30,000,000の白血病細胞/mL血液)。

1. 水浴を用いて37°CでFCSの10%を含むプレウォームRPMI培地。AML細胞のバイアル(1mL FCS + 10%DMSO内の最大30,000,000個の細胞)に対して、15 mL反応チューブに10mLのプリウォーム培地を加えます。
2. 液体窒素貯蔵から原発AMLを含む凍結を取り除き、37°Cの水浴を使用して細胞をすぐに解凍する。チューブを水の中でゆっくりと前後に動かし、小さな氷の結晶だけが残るまでバイアルの内容物を解凍させます。
3. 解凍した細胞を培地含有チューブにすぐに移し、1mLの培地を使用してバイアルをすすいします。
4. 細胞を10分間 300xg で遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を捨てます。
5. FCSの10%を含むRPMI培地の5mLで細胞を洗浄し、遠心分離機を 300xg で10分間洗浄します。

3. セルカウント

1. FCSの10%を含むRPMI培地の既知の体積で細胞ペレットを再懸濁する。
2. 細胞懸濁液の少量を1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移し、生細胞/死細胞の識別を可能にするトリパンブルーまたは他の代替色素との既知の比率で希釈します。
3. 任意のデバイスを使用してセルをカウントします。
4. 細胞を10分間 300xg で遠心分離し、ペレットを乱さずに上清を捨てます。

4. ビオチン化NKG2D融合タンパク質を用いた原発AML細胞の染色

1. 500 mL PBS に牛血清アルブミン(BSA)とエチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)をそれぞれ0.07 mMと2 mMの最終濃度に補って、染色バッファーを調製します。必要に応じて pH (7.2 ~ 7.4) を調整します。
2. 染色バッファーを含む細胞ペレットを、0.5 x 10^{7 細胞} /mL の最終濃度まで再懸濁します。
   注:必要に応じて、染色する前に、細胞をブロッキング剤(例えばhIgG(1μg/ml)を用いてRTまたはFcR遮断剤で30分間インキュベートすることができます。
3. 細胞懸濁液100μLを細胞培養96ウェルU-底板に移し、プレートを 300xg で10分間遠心分離する。ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。
4. ビオチン化されたNKG2D融合タンパク質のマスターミックスを準備し、細胞が井戸当たり50μLの最終体積で再懸濁し、井戸当たり10μg/mLの最終濃度になるようにします。
5. ステップ4.4で作成したマスターミックスを100μLピペットで追加し、300μLのマルチチャンネルピペットでセルペレットを再中断します。
   注:細胞の数に応じて最終体積を縮小し、染色に必要な融合タンパク質の量を減らします。
6. 細胞懸濁液をRTで25分間、または4°Cで50分間インキュベートする。
7. 300 μL のマルチチャンネルピペットを使用して、1 ウェルあたり 200 μL の染色バッファーを加えて細胞を洗浄します。
8. プレートを 300xg で10分間遠心し、ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。
9. 手順 4.7 と 4.8 を繰り返します。
   注:ここで説明する染色は、細胞培養96ウェルU-底板で行われます。そのため、洗浄工程は、このようなプレートの体積容量が小さいため2回行われる。染色は他のチューブでも行え、洗浄工程は、より大きな体積を使用して1回だけ行われる可能性があります。
10. 細胞が50 μLの最終容積で再懸濁されるようにストレプトアビジン-PE( 希釈については表1 を参照)を使用してマスターミックスを準備します。
    注:CD33、CD34..など、関心のある細胞タイプの選択抗体を追加します。AML の場合。
11. ステップ4.10で作成したマスターミックスを100μLピペットで追加し、300μLマルチチャンネルピペットでセルペレットを再中断します。
12. 細胞懸濁液をRTで15分間、暗で4°Cで30分間インキュベートします。
13. 300 μL のマルチチャンネルピペットを使用して、1 ウェルあたり 200 μL の染色バッファーを加えて細胞を洗浄します。
14. プレートを 300xg で10分間遠心し、ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。
15. ステップ 4.13 と 4.14 を繰り返します。
16. 7-AAD(7-アミノアクチノマイシンD、1:1000)または生細胞と死細胞を区別するために任意の試薬を含む染色バッファーの溶液を準備します。
17. 300 μL マルチチャネルマイクロピペットを使用したステップ 4.16 で 200 μL 染色バッファー + 7-AAD で細胞ペレットを再懸濁します。
18. フローサイトメトリー装置を用いて細胞を解析する。

5. 単一またはプールされた単一抗NKG2DL抗体の染色

1. ステップ 4.2 と同じセル懸濁液を使用します。
2. 300 μL のマルチチャンネルピペットを使用して細胞培養 96 ウェル U-底板に細胞懸濁液100 μL を移し、プレートを 300 x g で 10 分間遠心分離します。ペレットを邪魔することなく上清を捨てます。
3. 各一次抗体またはプールされた抗体(希釈については 表2 を参照)に対して抗体マスターミックスを調製し、細胞を50μLの最終体積で再懸濁させます。
4. ステップ5.3で作成したマスターミックスを100μLピペットで追加し、300μLマルチチャンネルピペットでセルペレットを再中断します。
5. RTで25分間細胞をインキュベートする。
6. 300 μL のマルチチャンネルピペットを使用して、ウェルあたり 200 μL の染色バッファーを加えて細胞を洗浄します。
7. 遠心分離細胞培養96ウェルUボトムプレートを 300xg で10分間、ペレットを乱すことなく上清を捨てる。
8. ステップ 5.6 と 5.7 を繰り返します。
9. 細胞がウェルあたり50μLの最終体積で再懸濁されるように、二次抗体(希釈については 表2 を参照)を加えて抗体マスターミックスを調製します。
10. ステップ5.9で作成したマスターミックスを100 μLピペットで追加し、300 μLマルチチャンネルピペットでセルペレットを再サスペンドします。
11. RTで15分間、暗闇の中で4°Cで30分間インキュベートします。
12. 300 μL のマルチチャンネルピペットを使用して、1 ウェルあたり 200 μL の染色バッファーを加えて洗浄します。
13. 細胞懸濁液を10分間 300xg で遠心し、ペレットを乱さずに上清を捨てます。
14. ステップ 5.12 と 5.13 を繰り返します。
15. ステップ4.16で調製した7-AADを含む200μL染色バッファー内の細胞ペレットを再懸濁する。
16. ステップ6で説明したようにフローサイトメトリー装置を用いて細胞を解析する。

6. データ取得

注:レーザーが正常に機能していることを確認するために、フローサイトメーターの毎週の品質管理が行われていることを確認してください。ここで紹介するプロトコルでは、週に一度のサイトメーターとトラッキング(CTS)プロセスを相対的なビーズで行い、すべてのチャンネルでレーザー性能をチェックします。CTSの後、内部制御として8ピークビーズを使用して10,000のイベントが記録されます。すべてのピークは、ゲート内の同じ位置にあり、互いに十分に分離されている必要があります。

1. ビーズまたはセル¹⁶を使用して検出器間のスペクトルの重複を減算するマトリックス補正を作成します。
2. 染色されていない細胞と単一の染色されたビーズに対して10,000件のイベントを記録します。蛍光マイナス1(FMO)コントロールの場合、50,000のイベントを記録し、完全染色されたサンプルは最大100,000のイベントを記録します。
   注: または、単一の染色サンプルをセルに対して実行することもできます。その場合は、目的のマーカーに対してセルに正のシグナルがあることを確認します。
3. 実験で使用したフルオロフォアごとに、単一の染色された細胞またはビーズサンプルを取得し、スペクトルの重なりの量を明らかにする。フローサイトメトリーデバイスの補償作成者を使用して、こぼれ過ぎ値を計算し、測定されたすべてのサンプルに補償マトリックスを適用します。
   注: 二次抗体は、報酬がビーズで計算される場合、ビーズを使用して補償を作成するために使用することはできません。補償ビーズの種類によっては、二次抗体をビーズによる補償に使用することはできません。
4. FMOコントロールおよび融合タンパク質を含む完全な染色サンプルについては、まず、前方散乱(FSC)および側面散乱(SSC)に基づいて細胞を選択する。ダブレットを除外した後、7-AAD(PercP-Cy5.5)シグナルの否定性に基づいて細胞をゲートし、死んだ細胞を除外します(ステップ5.15を参照)。最終プロットは、生きているシングルに対するCD34(Y軸)とNKG2DL(X軸)の表現を示しています。
5. 単一の抗NKG2DL抗体の場合、サンプルに同じ戦略を適用しますが、リガンド陽性はPEチャネルではなくAlexa Fluor 488にあることに注意してください。
6. この実験に対して実行する適切な FMO 制御については、ステップ 6.4 および 6.5 のゲーティングストラテジーの FMO 制御に従ってゲートを調整します( 表 3を参照)。完全に染色されたサンプルを記録している間、以前に作成されたゲートの上のセルは、解析されたマーカーに対して正の値になります。

結果

ここで提示されるプロトコルは両方とも、パンリガンド認識を利用するか、個々のリガンドに対してプールされた抗体で染色することによってNKG2DL表面発現と組み合わせて、LSC¹⁷の既知のマーカーであるCD34を使用したフローサイトメトリック分析によるAML LSCの濃縮を可能にする。図1では、分析されたAMLサンプルがCD34およびNKG2DLに対して正であるが、?...

ディスカッション

ここでは、ヒトの原生AML細胞上でNKG2DL表面発現を検出できる2つのフローサイトメトリック法を紹介する。我々は、両方の検出方法が他の抗体染色(例えば、CD34発現を検出する)と組み合わせて使用できることを示す。同様の染色は、他の一次細胞型および細胞株にも行うことができる。

我々は最近、AML患者の爆風の表面にNKG2DLの不在がLSC¹⁴を豊かにする?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-amminoactinomycin D (7-AAD)	Invitrogen	A1310	Viability dye
96 well plate U bottom	Sarstedt	833925500	96 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34	BD	555824	Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614
Bovine Serum Albumin	PanReac AppliChem	A1391,0050	Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Roth	8043.1	Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS)	BioConcept	2-01F10-I	Component of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2	BD	/	Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A21222	Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF	R&D	1299-NK-050	Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID:
Human ULBP-1 Antibody	R&D	AF1380	Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 Antibody	R&D	AF1298	Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725
Human ULBP-3 Antibody	R&D	AF1517	Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835
MICA Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-35346	Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-66698	Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions	Miltenyibiotec	130-093-385	Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-500ML	Component of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A11034	Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um	Spherotech Inc.	RCP-30-20A	Beads used for flow cytometry device maintainance
RPMI medium	Sigma Aldrich	R8758-500ML	Cell culture medium
RayBright Universal Compensation Beads	Raybiotech	137-00013-100	Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL	Invitrogen	S866	Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection