Duas abordagens citométricas de fluxo de detecção de superfície de ligante NKG2D para distinguir células-tronco de subpopulações a granel em leucemia mielóide aguda

Resumo

Apresentamos dois protocolos de coloração diferentes para detecção de ligantes NKG2D (NKG2DL) em amostras de leucemia mielóide aguda primária humana (LMA). A primeira abordagem é baseada em uma proteína de fusão, capaz de reconhecer todos os ligantes conhecidos e potencialmente ainda desconhecidos, enquanto o segundo protocolo conta com a adição de múltiplos anticorpos anti-NKG2DL.

Resumo

Dentro do mesmo paciente, a ausência de ligantes NKG2D (NKG2DL) expressão superficial foi demonstrada para distinguir subpopulações leucêmicas com propriedades de células-tronco (chamadas células-tronco leucêmicas, LSCs) de células leucêmicas de contrapartida mais diferenciadas que não possuem potencial de iniciação da doença, embora carreguem mutações genéticas específicas de leucemia semelhantes. NKG2DL são bioquimicamente altamente diversos mhc classe I-like auto-moléculas. Células saudáveis em condições homeostáticas geralmente não expressam NKG2DL na superfície celular. Em vez disso, a expressão desses ligantes é induzida após a exposição ao estresse celular (por exemplo, transformação oncogênica ou estímulos infecciosos) para desencadear a eliminação de células danificadas através de lise através de células imunes expressas por receptores NKG2D, como células assassinas naturais (NK). Curiosamente, a expressão da superfície NKG2DL é seletivamente suprimida em subpopulações LSC, permitindo que essas células evitem a vigilância imunológica mediada por NKG2D. Aqui, apresentamos uma análise lado a lado de dois métodos diferentes de citometria de fluxo que permitem a investigação da expressão da superfície NKG2DL em células cancerosas, ou seja, um método que envolve reconhecimento pan-ligante e um método envolvendo coloração com múltiplos anticorpos contra ligantes únicos. Estes métodos podem ser usados para separar subpopulações celulares negativas nkg2DL viáveis com propriedades de células-tronco de câncer putativos de NKG2DL positivo não-LSC.

Introdução

As células NK são efeitos importantes do sistema imunológico inato que podem reconhecer e eliminar células malignas ou células saudáveis estressadas (por exemplo, por uma infecção viral) sem estimulação prévia de antígeno¹. Esse processo é fortemente regulado através de um complexo repertório de receptores ativadores — como receptores de citotoxicidade natural (NCRs), NKG2D e CD16 — e receptores inibitórios que são em grande parte representados por receptores semelhantes à imunoglobulina assassina (KIRs)². A ligação de KIRs com moléculas de antígeno leucócito humano (HLA) em células somáticas garante o auto-reconhecimento e transmite tolerância celular NK. Por outro lado, a ausência de auto-reconhecimento e o aumento da vinculação de receptores ativados aos seus ligantes nas células-alvo desencadeiam a liberação de grânulos citotóxicos que levam à citotoxicidade mediada por células NK¹. Finalmente, as células NK podem exercer citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) vinculando-se ao receptor de ativação CD16 a alvos que expressam a porção fc de Ig (RF)². Além da citotoxicidade direta, as células NK também podem desencadear a liberação de citocinas conectando o inato com o sistema imunológico adaptativo³.

NKG2D é um receptor de ativação importante expresso em NK, NKT, γδ T, e células T CD8+⁴ que permitem que tais células imunes citotóxicas reconheçam e lise NKG2D ligand (NKG2DL) expressem células-alvo. Células saudáveis geralmente não expressam NKG2DL. Em vez disso, a expressão NKG2DL é regulada em células malignas ou infectadas por vírus para torná-las favoráveis à liberação imunológica⁵.

A família humana NKG2DL compreende oito moléculas conhecidas entre as quais as duas moléculas relacionadas à cadeia MHC I A e B (MICA e MICB⁶) e as proteínas de ligação citomegalovírus UL16 1-6 (ULBP1-6⁷). A expressão de NKG2DL é regulada nos níveis transcricional, pós-transcricional, bem como nos níveis pós-translacional⁸. Como tal, enquanto a expressão NKG2DL é comumente não detectável na superfície de células saudáveis, nKG2DL mRNA⁹ e expressão de proteína intracelular foram relatados em tecidos saudáveis. A relevância funcional de tal expressão e os mecanismos subjacentes a tais padrões de expressão discretos permanecem a ser definidos¹⁰.

A regulação mecanicista da expressão NKG2DL nas células cancerosas é uma área fascinante de investigação. Vias conhecidas por estarem envolvidas tanto no estresse celular, por exemplo, na via de estresse de choque térmico⁹, ou em vias associadas a danos no DNA, como a ataxia telangiectasia mutada (ATM) e a via Rad3 relacionada (ATR)^11,bem como infecções virais ou bacterianas foram diretamente ligadas à indução da expressão NKG2DL¹². No entanto, mesmo que a expressão superficial do NKG2DL tenha sido efetivamente induzida, essa expressão pode ser perdida novamente através do derramamento mediado proteolítico, um mecanismo associado à fuga imunológica e ao prognóstico clínico ruim em alguns cânceres¹³.

A ausência de nKG2DL de superfície celular também pode desempenhar papéis importantes em pacientes com LMA. Aqui, o tratamento com quimioterapia intensiva muitas vezes induz a remissão, mas a recaída ocorre frequentemente a partir de células-tronco leucmicas (LSC), que sobrevivem seletivamente às quimioterapias e evitam a resposta imune. Como mostramos recentemente, os LSCs, por exemplo, escapam da lise celular NK suprimindo a expressão de superfície NKG2DL¹⁴.

Inversamente, a ausência de expressão NKG2DL superficial pode ser usada como um método para identificar e isolar viávelmente subpopulações putativas semelhantes a troncos de células de subpopulações leucêmicas de contrapartida em massa. Aqui, apresentamos duas abordagens citométricas de fluxo que podem ser usadas para detectar a expressão da superfície NKG2DL e, assim, identificar células-tronco nkg2DL negativas na leucemia e talvez também em outros cânceres: Um método para reconhecimento da superfície pan-ligante e um método envolvendo coloração com anticorpos uni ou agrupados reconhecendo proteínas NKG2DL conhecidas.

Protocolo

As amostras dos pacientes foram coletadas após aprovação do Conselho de Revisão ética dos Hospitais Universitários de Basileia e Tuebingen.

1. Biotintilação da proteína de fusão NKG2D

NOTA: Esta etapa é realizada com um kit de biotiningação (ver Tabela de Materiais) de acordo com a instrução do fabricante. Esta etapa do protocolo deve ser realizada pelo menos 24 horas antes da coloração. A proteína de fusão NKG2D biotinilada deve ser armazenada a -20 °C.

1. Descongele tanto a biotina, quanto os tubos de proteína de fusão NKG2D à temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Se as células precisarem ser estéreis para uso experimental adicional (injeção em camundongos, ensaios da unidade formadora de colônias, etc.), reconstitua a proteína de fusão sob uma capa de fluxo laminar para evitar contaminação. Caso contrário, cada passo pode ser realizado em um banco.
2. Gire rapidamente os 50μg de proteína de fusão NKG2D liofilizada. Adicione 500 μL de soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para reconstituir o pó e misturar completamente usando uma micropipette P1000.
3. Adicione 100 μL da proteína de fusão NKG2DL a um tubo de biotina para obter uma concentração final de estoque de 100 μg/mL.
4. Misture bem a solução com um resususus com uma micropipette P100.
5. Incubar a solução de proteína/biotina de fusão em um RT controlado por 24 h. A proteína de fusão está pronta para uso.

2. Descongelamento de células AML primárias

NOTA: Aproximadamente 5.000.000 células leucêmicas congeladas por paciente armazenadas em nitrogênio líquido foram descongeladas e depois usadas para os ensaios imediatamente. As células leucêmicas foram obtidas e congeladas como descrito anteriormente¹⁵. Resumidamente, amostras de sangue periférico coletadas de pacientes com LMA e altas porcentagens de células de explosão (>90% das explosões entre as células mononucleares) foram processadas com uma separação gradiente de densidade para obter células mononucleares e, posteriormente, congeladas no soro da panturrilha fetal (FCS) contendo 10% de solução de sulfóxido de dimetil (DMSO). O número de células altamente variado entre os pacientes em dependência da concentração de leucócitos no paciente (faixa: 1.000.000 a 30.000.000 células leucêmicas por mL sangue).

1. Meio RPMI pré-aquecido contendo 10% de FCS a 37 °C usando um banho de água. Para cada frasco de células AML (até 30.000.000 células em 1 mL FCS + 10% DMSO), adicione 10 mL de meio pré-aquecido a um tubo de reação de 15 mL.
2. Remova o criovial contendo LMA primária do armazenamento de nitrogênio líquido e descongele imediatamente as células usando um banho de água de 37 °C. Mova suavemente o tubo para frente e para trás na água, permitindo que o conteúdo do frasco descongele até que haja apenas um pequeno cristal de gelo.
3. Transfira imediatamente as células descongeladas para o tubo de média contenção e enxágue o frasco usando 1 mL de meio.
4. Centrifugar as células a 300 x g por 10 minutos e descartar o supernasce sem perturbar a pelota.
5. Lave as células com 5 mL de meio RPMI contendo 10% de FCS e centrífuga a 300 x g por 10 min.

3. Contagem celular

1. Resuspende a pelota de célula em um volume conhecido de meio RPMI contendo 10% de FCS.
2. Transfira um pequeno volume da suspensão celular para um tubo de microcentrifutura de 1,5 mL e dilua em uma proporção conhecida com azul tripano ou qualquer outro corante alternativo que permita discriminação celular viva/célula morta.
3. Use qualquer dispositivo para contar as células.
4. Centrifugar as células a 300 x g por 10 minutos e descartar o supernasce sem perturbar a pelota.

4. Coloração de células AML primárias usando a proteína de fusão NKG2D biotinilada

1. Prepare o tampão de coloração suplementando 500 mL PBS com albumina de soro bovino (BSA) e ácido traacético etilenodiaminete (EDTA) a uma concentração final de 0,07 mM e 2 mM, respectivamente. Ajuste o pH (7.2-7.4) se necessário.
2. Resuspengem a pelota celular com tampão de coloração a uma concentração final de 0,5 x 10⁷ células/mL.
   NOTA: Opcionalmente, antes da coloração, as células podem ser incubadas com um agente de bloqueio (por exemplo, hIgG (1μg/ml) por 30 min no RT ou no agente de bloqueio fcr)..
3. Transfira 100 μL da suspensão celular para uma placa de fundo U de 96 poços e centrifugar a placa a 300 x g por 10 minutos. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota.
4. Prepare uma mistura mestre de proteína de fusão NKG2D biotinilada para que as células sejam resuspendidas em um volume final de 50 μL por poço com uma concentração final de 10 μg/mL por poço.
5. Adicione a mistura mestre preparada na etapa 4.4 usando uma pipeta de 100 μL e resuspenda as pelotas de célula com uma pipeta multicanal de 300 μL.
   NOTA: Reduza o volume final de acordo com o número de células para reduzir a quantidade de proteína de fusão necessária para a coloração.
6. Incubar a suspensão da célula por 25 min na RT ou 50 min a 4 °C.
7. Lave as células adicionando 200 μL de tampão de coloração por poço com uma pipeta multicanal de 300 μL.
8. Centrifugar a placa a 300 x g por 10 minutos e descartar o supernatante sem perturbar a pelota.
9. Repita as etapas 4.7 e 4.8.
   NOTA: A coloração descrita aqui é realizada em uma cultura celular de 96 poços placa de fundo U. Portanto, as etapas de lavagem são realizadas duas vezes devido à pequena capacidade de volume dessas placas. A coloração também pode ser realizada em outros tubos e as etapas de lavagem podem então ser realizadas apenas uma vez usando um volume maior.
10. Prepare uma mistura mestra usando Streptavidin-PE (ver Tabela 1 para diluições) para que as células sejam resuspendidas em um volume final de 50 μL.
    NOTA: Adicione anticorpos de seleção para o tipo de interesse do seu celular, como por exemplo, CD33, CD34.... para AML.
11. Adicione a mistura mestre preparada na etapa 4.10 usando uma pipeta de 100 μL e resuspenda as pelotas de célula com uma pipeta multicanal de 300 μL.
12. Incubar as suspensões celulares por 15 min em RT ou 30 min a 4 °C no escuro.
13. Lave as células adicionando 200 μL de tampão de coloração por poço com uma pipeta multicanal de 300 μL.
14. Centrifugar a placa a 300 x g por 10 minutos e descartar o supernatante sem perturbar a pelota.
15. Repita as etapas 4.13 e 4.14.
16. Prepare uma solução de tampão de coloração incluindo 7-AAD (7-Aminoactinomicina D, 1:1000) ou qualquer reagente para distinguir entre células vivas e mortas.
17. Pelotas de células resuspendas em tampão de coloração de 200 μL + 7-AAD preparados na etapa 4.16 no uso de uma micropipette multicanal de 300 μL.
18. Analise as células usando um dispositivo de citometria de fluxo.

5. Coloração de anticorpos anti-NKG2DL únicos únicos ou agrupados

1. Use a mesma suspensão celular da etapa 4.2.
2. Transfira 100 μL da suspensão celular para uma placa de fundo U de cultura celular de 96 poços usando uma pipeta multicanal de 300 μL e centrifugar a placa a 300 x g por 10 minutos. Descarte o supernatante sem perturbar a pelota.
3. Prepare uma mistura mestre de anticorpos para cada anticorpo primário ou anticorpos agrupados (ver Tabela 2 para diluições) para que as células sejam resuspendidas em um volume final de 50 μL.
4. Adicione a mistura mestre preparada na etapa 5.3 usando uma pipeta de 100 μL e resuspenda as pelotas de célula com uma pipeta multicanal de 300 μL.
5. Incubar as células por 25 min na RT.
6. Lave as células adicionando 200 μL de tampão de coloração por poço usando uma pipeta multicanal de 300 μL.
7. Centrifugar a cultura celular 96-bem placa de fundo U a 300 x g por 10 minutos e descartar o supernatante sem perturbar a pelota.
8. Repita as etapas 5.6 e 5.7.
9. Prepare uma mistura mestre de anticorpos adicionando o anticorpo secundário (ver Tabela 2 para diluições) para que as células sejam resuspended em um volume final de 50 μL por poço.
10. Adicione a mistura mestre preparada na etapa 5.9 usando uma pipeta de 100 μL e resuspenda as pelotas de célula com uma pipeta multicanal de 300 μL.
11. Incubar por 15 min no RT ou 30 min a 4 °C no escuro.
12. Lave adicionando 200 μL de tampão de coloração por poço usando uma pipeta multicanal de 300 μL.
13. Centrifugar a suspensão celular a 300 x g por 10 minutos e descartar o supernatante sem perturbar a pelota.
14. Repita as etapas 5.12 e 5.13.
15. Pelotas de células resuspendas em tampão de coloração de 200 μL contendo 7-AAD preparados na etapa 4.16.
16. Analise as células usando um dispositivo de citometria de fluxo, conforme descrito na etapa 6.

6. Aquisição de dados

NOTA: Certifique-se de que os controles semanais de qualidade do citômetro de fluxo sejam realizados para garantir que os lasers estejam funcionando corretamente. Para o protocolo aqui apresentado, é realizado um processo semanal de Cytometer and Tracking (CTS) com contas relativas para verificar o desempenho a laser em todos os canais. Após o CTS, 10.000 eventos são registrados usando as contas de 8 picos como controle interno. Todos os picos devem estar na mesma posição dentro de seus portões e bem separados um do outro.

1. Crie a compensação matricial para subtrair a sobreposição espectral entre detectores com contas ou com células¹⁶.
2. Registo 10.000 eventos para as celas não manchadas e as únicas contas manchadas. Para os controles de fluorescência menos um (FMO), registos recordem 50.000 eventos e para as amostras manchadas completas registram até 100.000 eventos.
   NOTA: Alternativamente, podem ser realizadas amostras únicas manchadas nas células. Se assim for, certifique-se de que as células tenham um sinal positivo para o marcador desejado.
3. Adquira uma única célula manchada ou amostra de contas para cada fluoróforo usado no experimento para revelar a quantidade de sobreposição espectral. Use o criador de compensação do dispositivo de citometria de fluxo para calcular valores de derramamento e aplicar a matriz de compensação a todas as amostras medidas.
   NOTA: Os anticorpos secundários não podem ser utilizados para a criação de indenizações usando contas se a compensação for calculada com contas. Dependendo do tipo de contas de compensação, anticorpos secundários não podem ser usados para compensação com contas.
4. Para os controles FMO e as amostras manchadas completas com a proteína de fusão, em primeiro lugar, selecione as células com base em sua dispersão dianteira (FSC) e dispersão lateral (SSC). Após a exclusão de doublets, portal as células com base em sua negatividade para 7-AAD (PercP-Cy5.5) sinal para excluir as células mortas (ver passo 5.15). O enredo final mostra a expressão de CD34 (eixo Y) e NKG2DL (eixo X) em singlets vivos.
5. Para os anticorpos anti-NKG2DL únicos, aplique a mesma estratégia nas amostras, mas note que a positividade de ligantes está no Alexa Fluor 488 e não no canal PE.
6. Ajuste os portões de acordo com os controles FMO para a estratégia de gating das etapas 6.4 e 6.5 (ver Tabela 3) para que os controles FMO apropriados realizem este experimento: No software de análise, desenhe um portão sobre a fração negativa. Ao registrar a amostra totalmente manchada, as células acima do portão criado anteriormente são positivas para o marcador analisado.

Resultados

Ambos os protocolos aqui apresentados permitem o enriquecimento da LSC AML por meio de análises citométricas de fluxo utilizando CD34, um marcador conhecido de LSC¹⁷, em combinação com a expressão de superfície NKG2DL, utilizando reconhecimento pan-ligante ou colorindo com anticorpos agrupados contra ligantes individuais. Na Figura 1,mostramos que as amostras de LMA analisadas são positivas para CD34 e NKG2DL, mas também existem subpopulações negativas, o qu...

Discussão

Aqui apresentamos dois métodos citométricos de fluxo que podem detectar a expressão da superfície NKG2DL em células LMA primárias humanas. Mostramos que ambos os métodos de detecção podem ser usados em conjunto com outras manchas de anticorpos (por exemplo, detectando a expressão CD34). Manchas semelhantes também podem ser realizadas em outros tipos de células primárias e linhas celulares.

Recentemente, mostramos que a ausência de NKG2DL na superfície das explosões de pacientes...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-amminoactinomycin D (7-AAD)	Invitrogen	A1310	Viability dye
96 well plate U bottom	Sarstedt	833925500	96 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34	BD	555824	Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614
Bovine Serum Albumin	PanReac AppliChem	A1391,0050	Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Roth	8043.1	Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS)	BioConcept	2-01F10-I	Component of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2	BD	/	Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A21222	Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF	R&D	1299-NK-050	Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID:
Human ULBP-1 Antibody	R&D	AF1380	Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 Antibody	R&D	AF1298	Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725
Human ULBP-3 Antibody	R&D	AF1517	Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835
MICA Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-35346	Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-66698	Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions	Miltenyibiotec	130-093-385	Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-500ML	Component of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A11034	Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um	Spherotech Inc.	RCP-30-20A	Beads used for flow cytometry device maintainance
RPMI medium	Sigma Aldrich	R8758-500ML	Cell culture medium
RayBright Universal Compensation Beads	Raybiotech	137-00013-100	Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL	Invitrogen	S866	Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection