NKG2D 利甘德表面检测的两种流细胞学方法，以区分干细胞与急性骨髓性白血病中的散装亚群

摘要

我们在人类原发性急性骨髓性白血病 （AML） 样本中提出了 NKG2D 配体 （NKG2DL） 检测的两种不同的染色方案。第一种方法基于融合蛋白，能够识别所有已知和潜在的未知配体，而第二种方法依赖于添加多个抗NKG2DL抗体。

摘要

在同一患者中，NKG2D配体（NKG2DL）表面表达的缺失被证明能够区分具有干细胞特性的白血病亚群（所谓的白血病干细胞，LSC）和更差异化的对应白血病细胞，这些白血病细胞虽然携带类似的白血病特异性基因突变，但缺乏疾病启动潜力。NKG2DL 是生化高度多样化的 MHC 类 I 类自分子。在家居静止条件下的健康细胞通常不会在细胞表面表达 NKG2DL。相反，这些配体的表达是在接触细胞应激（如致癌转化或传染性刺激）时诱发的，通过NKG2D受体表达免疫细胞（如自然杀手（NK）细胞，通过裂解触发受损细胞的消除。有趣的是，NKG2DL表面表达在LSC亚聚众中被选择性地抑制，使这些细胞能够逃避NKG2D介质的免疫监测。在这里，我们提出了两种不同的流细胞学方法的并排分析，允许对癌细胞上的 NKG2DL 表面表达进行调查，即涉及泛配体识别的方法和涉及对单个配体的多种抗体染色的方法。这些方法可用于将具有假定癌症干细胞特性的可行 NKG2DL 负细胞亚聚众与 NKG2DL 阳性非 LSC 分离。

引言

NK细胞是先天免疫系统的重要影响者，可以识别和消除恶性细胞或有压力的健康细胞（例如，通过病毒感染），而无需事先刺激抗原^1。这个过程通过激活受体的复杂剧目（如天然细胞毒性受体 （NCR）、NKG2D 和 CD16） 以及主要由杀手免疫球蛋白样受体 （KIR）²表示的抑制受体进行严格调控。KIR 与人体白细胞抗原 （HLA） I 类分子结合在体细胞上，确保自我识别并传达 NK 细胞耐受性。另一方面，缺乏自我识别和激活受体对目标细胞的配体的结合增加，导致细胞毒性颗粒的释放，导致NK细胞介导细胞毒性^1。最后，NK细胞可以通过将激活受体CD16与表示Ig （FcR）²Fc 部分的目标结合来发挥抗体依赖性细胞毒性 （ADCC） 的作用。除了直接细胞毒性，NK细胞还可以触发细胞因子释放桥接与自适应免疫系统³与先天。

NKG2D 是 NK、NKT、+T 和天真的 CD8+ T 细胞⁴上表达的主要激活受体，使此类细胞毒性免疫细胞能够识别和解解 NKG2D 配体 （NKG2DL） 表达目标细胞。健康细胞通常不表达 NKG2DL。相反，NKG2DL表达是对恶性或病毒感染细胞的调节，使这些适应免疫清除^5。

人类NKG2DL家族由8个已知分子组成，其中两个MHC I链相关分子A和B（MICA和MICB^6）和巨细胞病毒UL16结合蛋白1/6（ULBP1-6^7）。NKG2DL 的表达在转录、转录后以及后翻译级别⁸上进行调节。因此，虽然NKG2DL表达在健康细胞表面通常无法检测到，但NKG2DL mRNA⁹和细胞内蛋白质表达在健康组织中报告。这种表达的功能相关性和这种不同表达模式背后的机制仍有^待界定。

癌细胞中NKG2DL表达的机械调控是一个引人入胜的调查领域。已知与细胞应激（如热冲击应激通路^9）或 DNA 损伤相关通路（如厌食性泰兰吉拉西亚变异 （ATM） 和 Rad3 相关 （ATR） 通路^11）以及病毒或细菌感染有关的通路与 NKG2DL 表达¹²的诱导直接相关。然而，即使NKG2DL的表面表达已被有效地诱导，这种表达可以通过原解剖介质脱落再次丢失，这种机制与免疫逃生和一些癌症的临床预后差^有关。

细胞表面 NKG2DL 的缺失也可能对 AML 患者发挥重要作用。在这里，用强化化疗治疗通常诱导缓解，但复发通常发生在白血病干细胞（LSC），选择性地生存化疗和逃避免疫反应。例如，正如我们最近所表明的，LSC通过抑制NK2DL表面表达¹⁴来逃避NK细胞裂解。

相反，没有表面NKG2DL表达可以作为一种方法来识别和恶毒地分离假定干细胞状细胞的亚群从散装对应白血病亚群。在这里，我们提出了两种流细胞学方法，可用于检测 NKG2DL 表面表达，从而识别白血病中的 NKG2DL 阴性干细胞，也许还可以用于其他癌症:泛配体表面识别方法和涉及单个或池状抗体染色的方法，以识别单个已知 NKG2DL 蛋白质。

研究方案

患者样本是在巴塞尔和图本根大学医院伦理审查委员会批准后采集的。

1. NKG2D融合蛋白的生物酸化

注:此步骤根据制造商的说明，用生物素化套件（参见 材料表）执行。协议的此步骤必须在染色前至少执行 24 小时。生物素化 NKG2D 融合蛋白应存储在 -20 °C 下。

1. 解冻生物素，以及NKG2D聚变蛋白管在室温下（RT）。
   注:如果细胞需要无菌供进一步实验使用（在小鼠中注射，菌落形成单元检测等），在层压流罩下重组融合蛋白以避免污染。否则，每一步都可以在长凳上执行。
2. 快速旋转 50μg 的冻血 NKG2D 融合蛋白。加入 500 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 以重组粉末，并使用 P1000 微管进行彻底混合。
3. 将 100 μL NKG2DL 融合蛋白添加到生物素管中，以获得 100 μg/mL 的最终库存浓度。
4. 通过连续重复与 P100 微管混合解决方案。
5. 在受控 RT 下孵育融合蛋白/生物素溶液 24 小时。融合蛋白现已准备就绪。

2. 解冻原发性AML细胞

注:每名储存在液氮中的病人大约5，000，000个冷冻白血病细胞被解冻，然后立即用于检测。白血病细胞获得和冻结如前所述^15。简言之，从AML和高爆炸细胞百分比（> 单核细胞中90%的爆炸）患者身上采集的周围血液样本通过密度梯度分离处理，以获得单核细胞，随后冷冻在含有10%二甲基硫氧化物溶液（DMSO）的胎儿小腿血清（FCS）中。依赖患者白细胞浓度的患者之间的细胞数量差异很大（范围:每 mL 血液 1，000，000 到 30，000，000 个白血病细胞）。

1. 使用水浴在 37 °C 时含有 10% FCS 的预热 RPMI 介质。对于每瓶 AML 细胞（1 mL FCS 中最多 30，000，000 个细胞 = 10% DMSO），在 15 mL 反应管中加入 10 mL 预热介质。
2. 从液氮储存中取出含有原位 AML 的冷冻剂，然后立即使用 37 °C 水浴解冻细胞。轻轻地在水中来回移动管子，让小瓶内的内容解冻，直到只剩下一个小冰晶。
3. 立即将解冻的细胞转移到含中等的管子中，然后用 1 mL 的中等冲洗小瓶。
4. 将细胞以 300 x g 离心 10 分钟，并丢弃超高分子，而不会干扰颗粒。
5. 用 5 mL 的 RPMI 介质（含 10% 的 FCS）和离心机在 300 x g 下清洗电池 10 分钟。

3. 细胞计数

1. 将细胞颗粒重新吸收到已知体积的 RPMI 介质中，其中包含 10% 的 FCS。
2. 将少量的细胞悬浮液转移到 1.5 mL 微中心管中，并以已知比例稀释，使用 Trypan 蓝色或任何其他允许活细胞/死细胞歧视的替代染料。
3. 使用任何设备计算细胞。
4. 将细胞以 300 x g 离心 10 分钟，并丢弃超高分子，而不会干扰颗粒。

4. 使用生物镀锡NKG2D聚变蛋白对原发性AML细胞进行染色

1. 通过补充500 mL PBS与牛血清白蛋白（BSA）和乙酰胺醋酸（EDTA）的最终浓度分别为0.07 mM和2mM，准备染色缓冲器。如有必要，调整 pH 值 （7.2 至 7.4）。
2. 将带染色缓冲器的细胞颗粒重新用于最终浓度为 0.5 x 10⁷ 细胞/mL。
   注意:可选，在染色之前，细胞可以用阻塞剂（例如 hIgG（1μg/ml）在 RT 或 FcR 阻滞剂中孵育 30 分钟）。
3. 将 100 μL 的电池悬架转移到细胞培养 96 井 U 底板，并在 300 x g 下离心板 10 分钟。丢弃超高纳特而不干扰颗粒。
4. 准备生物受精NDG2D融合蛋白的主混合物，使细胞在每口井50微升的最终体积中重新使用，最终浓度为每口井10微克/mL。
5. 使用 100 μL 移液器添加第 4.4 步准备的主组合，然后用 300 μL 多通道移液器重新使用细胞颗粒。
   注:根据细胞数量缩小最终体积，以减少染色所需的融合蛋白量。
6. 在 RT 孵育细胞悬浮 25 分钟或在 4 °C 时孵化 50 分钟。
7. 使用 300 μL 多通道移液器每口井添加 200 μL 的染色缓冲器，从而清洗细胞。
8. 将板离心 300 x g 10 分钟，并丢弃超高纳特，而不会干扰颗粒。
9. 重复步骤 4.7 和 4.8。
   注:此处描述的染色是在细胞培养 96 井 U 底板中执行的。因此，由于此类板材体积小，因此要执行两次洗涤步骤。染色也可以在其他管子中执行，然后洗涤步骤可能仅使用较大的体积执行一次。
10. 使用 Streptavidin-PE（参见表 1 进行稀释）准备主混合物，以便将细胞重新悬念在 50 μL 的最终体积中。
    注意:添加选择抗体，用于您的细胞类型的兴趣，如CD33，CD34....对于 AML。
11. 使用 100 μL 移液器添加第 4.10 步准备的主组合，然后用 300 μL 多通道移液器重新使用细胞颗粒。
12. 在 RT 孵育细胞悬浮 15 分钟，在黑暗中在 4 °C 时孵化 30 分钟。
13. 使用 300 μL 多通道移液器每口井添加 200 μL 的染色缓冲器，从而清洗细胞。
14. 将板离心 300 x g 10 分钟，并丢弃超高纳特，而不会干扰颗粒。
15. 重复步骤 4.13 和 4.14。
16. 准备染色缓冲液的溶液，包括 7-AAD（7-氨基霉素 D， 1:1000）或任何试剂，以区分活细胞和死细胞。
17. 使用 300 μL 多通道微管在步骤 4.16 中准备的 200 μL 染色缓冲器中重新使用电池颗粒 。
18. 使用流细胞学设备分析细胞。

5. 单个或汇集单个抗 NKG2DL 抗体的染色

1. 使用与第 4.2 步相同的单元格悬浮。
2. 使用 300 μL 多通道移液器将 100 μL 的电池悬架转移到细胞培养 96 井 U 底板上，并在 300 x g 下离心板 10 分钟。丢弃超高纳特而不干扰颗粒。
3. 为每个初级抗体或汇集抗体准备抗体主组合（参见 表 2 以稀释），以便细胞在最后体积为 50 μL 中重新悬念。
4. 使用 100 μL 移液器添加第 5.3 步准备的主组合，然后用 300 μL 多通道移液器重新使用细胞颗粒。
5. 在 RT 孵育细胞 25 分钟。
6. 使用 300 μL 多通道移液器每口井添加 200 μL 的染色缓冲器，从而清洗细胞。
7. 将细胞培养 96 井 U 底板离心，在 300 x g 下 10 分钟，在不干扰颗粒的情况下丢弃超高纳特。
8. 重复步骤 5.6 和 5.7。
9. 通过添加辅助抗体（参见 表 2 进行稀释）来准备抗体主混合物，以便细胞以每口井 50 μL 的最终体积重新悬念。
10. 使用 100 μL 移液器添加第 5.9 步准备的主组合，然后用 300 μL 多通道移液器重新使用细胞颗粒。
11. 在 RT 孵育 15 分钟，在黑暗中 4 °C 孵育 30 分钟。
12. 使用 300 μL 多通道移液器每口井添加 200 μL 的染色缓冲器来清洗。
13. 将细胞悬浮离心在 300 x g 下 10 分钟，并在不干扰颗粒的情况下丢弃超高纳特。
14. 重复步骤 5.12 和 5.13。
15. 在 200 μL 染色缓冲器中重新使用电池颗粒，其中包含 7-AAD，在步骤 4.16 中准备。
16. 使用第 6 步中描述的流细胞测量设备分析细胞。

6. 数据采集

注意:确保每周对流量细胞计进行质量控制，以确保激光器正常工作。对于此处提出的协议，每周使用相对珠子执行细胞计和跟踪 （CTS） 过程，以检查所有通道上的激光性能。CTS 之后，使用 8 峰珠作为内部控制记录 10，000 个事件。所有的山峰都应该在大门内处于同一位置，彼此之间相隔很远。

1. 创建矩阵补偿，以减去探测器与珠子或细胞¹⁶之间的光谱重叠。
2. 记录 10，000 个未受污染的细胞和单个染色珠子的事件。对于荧光减去一 （FMO） 控制，记录 50，000 个事件，对于全染色样品记录多达 100，000 个事件。
   注意:或者，单个染色样品可以在细胞上执行。如果是这样，请确保细胞对所需的标记有一个正信号。
3. 获取实验中使用的每个荧光片的单个染色细胞或珠子样本，以揭示光谱重叠的数量。使用流细胞测量设备的补偿创建者计算溢出值，并将补偿矩阵应用于所有测量的样本。
   注:如果补偿是用珠子计算的，则不能使用珠子进行辅助抗体的补偿创造。根据补偿珠的类型，二次抗体不能用于珠子的补偿。
4. 对于FMO控制和融合蛋白的完整染色样品，首先，根据其前向散射（FSC）和侧散射（SSC）选择细胞。排除双子细胞后，根据细胞的消极性对 7-AAD （PercP-Cy5.5） 信号进行门禁，以排除死细胞（参见步骤 5.15）。最后的情节显示了CD34（Y轴）和NKG2DL（X轴）在活单的表达。
5. 对于单个抗 NKG2DL 抗体，对样品应用相同的策略，但请注意，配体积极性位于 Alexa Fluor 488，而不是 PE 通道。
6. 根据 FMO 控件调整闸门，以便从第 6.4 步和 6.5 步（参见 表 3）调整门，以便为此实验执行适当的 FMO 控件:在分析软件中，在负分数上绘制一个门。在记录全染色样品时，先前创建的门上方的细胞对分析标记呈阳性。

结果

这里提出的两个协议都允许使用CD34（LSC¹⁷的已知标记）的流细胞分析来丰富AML LSC，同时利用泛配体识别或与单个配体的组合抗体进行染色，从而与NKG2DL表面表达相结合。在图1中，我们显示分析的AML样本对CD34和NKG2DL呈阳性反应，但也存在阴性亚群，这表现在总共有四个不同的种群。我们的数据显示了这种染色的典型盖子策略，从通过 FSC 和 SSC 选择细胞的主...

讨论

在这里，我们提出了两种流细胞测量方法，可以检测人类原体AML细胞上的NKG2DL表面表达。我们表明，这两种检测方法都可以与其他抗体染色（例如检测 CD34 表达式）配合使用。类似的染色也可以在其他主要细胞类型和细胞系上执行。

我们最近表明，在AML患者爆炸表面没有NKG2DL可以丰富LSC^14。在 AML 中，NKG2DL 阴性但非 NKG2DL 阳性白血病亚聚众具有克隆和 体?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-amminoactinomycin D (7-AAD)	Invitrogen	A1310	Viability dye
96 well plate U bottom	Sarstedt	833925500	96 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34	BD	555824	Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614
Bovine Serum Albumin	PanReac AppliChem	A1391,0050	Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Roth	8043.1	Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS)	BioConcept	2-01F10-I	Component of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2	BD	/	Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A21222	Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF	R&D	1299-NK-050	Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID:
Human ULBP-1 Antibody	R&D	AF1380	Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 Antibody	R&D	AF1298	Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725
Human ULBP-3 Antibody	R&D	AF1517	Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835
MICA Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-35346	Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-66698	Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions	Miltenyibiotec	130-093-385	Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-500ML	Component of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A11034	Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um	Spherotech Inc.	RCP-30-20A	Beads used for flow cytometry device maintainance
RPMI medium	Sigma Aldrich	R8758-500ML	Cell culture medium
RayBright Universal Compensation Beads	Raybiotech	137-00013-100	Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL	Invitrogen	S866	Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection