Akut Miyeloid Lösemide Kök Hücreleri Toplu AltÜlmelerden Ayırt Etmek İçin NKG2D Ligand Yüzey Tespitinin İki Akış Sitometrik Yaklaşımı

Özet

İnsan primer akut miyeloid lösemi (AML) örneklerinde NKG2D ligand (NKG2DL) tespiti için iki farklı boyama protokolü sunuyoruz. İlk yaklaşım, bilinen ve potansiyel olarak henüz bilinmeyen tüm ligandları tanıyabilen bir füzyon proteinine dayanırken, ikinci protokol birden fazla anti-NKG2DL antikorunun eklenmesine dayanır.

Özet

Aynı hastada, NKG2D ligandlarının (NKG2DL) yüzey ekspresyonunun yokluğunun, benzer lösemi spesifik genetik mutasyonlar taşımalarına rağmen hastalık başlatma potansiyeli olmayan daha farklılaştırılmış muadil lösemi hücrelerinden kök hücre özelliklerine (lökemik kök hücreler, LSC'ler olarak adlandırılır) sahip lösemik subpopulasyonları ayırt ettiği gösterilmiştir. NKG2DL biyokimyasal olarak çok çeşitli MHC sınıfı I benzeri öz moleküllerdir. Homeostatik koşullardaki sağlıklı hücreler genellikle hücre yüzeyinde NKG2DL'i ifade etmez. Bunun yerine, bu ligandların ekspresyasyonu, doğal öldürücü (NK) hücreler gibi NKG2D reseptör ifade eden bağışıklık hücreleri aracılığıyla lizis yoluyla hasarlı hücrelerin ortadan kaldırılmasını tetiklemek için hücresel strese (örneğin onkojenik dönüşüm veya enfeksiyöz uyaranlar) maruz kalma üzerine indüklenmiştir. İlginçtir ki, NKG2DL yüzey ekspresyözü LSC alt nüfuslarında seçici olarak bastırılır ve bu hücrelerin NKG2D aracılı bağışıklık gözetiminden kaçınmasına izin verir. Burada, kanser hücreleri üzerinde NKG2DL yüzey ekspresyonunun araştırılmasına izin veren iki farklı akış sitometri yönteminin yan yana analizini sunuyoruz, yani pan-ligand tanımayı içeren bir yöntem ve tek ligandlara karşı birden fazla antikor ile boyama içeren bir yöntem. Bu yöntemler, putatif kanser kök hücre özelliklerine sahip canlı NKG2DL negatif hücresel alt nüfusları NKG2DL pozitif LSC olmayanlardan ayırmak için kullanılabilir.

Giriş

NK hücreleri, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin kötü huylu hücreleri veya stresli sağlıklı hücreleri (örneğin, viral bir enfeksiyonla) önceden antijen stimülasyonu olmadan tanıyabilen ve ortadan kaldırabilen önemli etkileridir^1. Bu işlem, doğal sitotoksisite reseptörleri (NCR), NKG2D ve CD16 gibi aktif reseptörler ve büyük ölçüde öldürücü immünoglobulin benzeri reseptörler (KIR)²ile temsil edilen inhibitör reseptörleri ile sıkı bir şekilde düzenlenir. KIR'lerin somatik hücreler üzerinde insan lökosit antijen (HLA) sınıfı I moleküllerine bağlanması, kendini tanımayı sağlar ve NK hücre toleransını iletir. Öte yandan, kendini tanımanın olmaması ve reseptörlerin hedef hücrelerdeki ligandlarına aktive etmenin artan bağlanması, NK hücre aracılı sitotoksikliğe yol açan sitotoksik granüllerin salınımını tetikler¹. Son olarak, NK hücreleri, aktive edici reseptör CD16'yı Ig (FcR)^2'ninFc kısmını ifade eden hedeflere bağlayarak antikora bağımlı hücresel sitotoksiklik (ADCC) uygulayabilir. Doğrudan sitotoksikliğin yanı sıra, NK hücreleri de doğuştan gelenleri adaptif bağışıklık sistemi ile köprüleyen sitokin salınımını tetikleyebilir³.

NKG2D, NK, NKT, φδ T ve naif CD8+ T hücreleri^4'te ifade edilen ve bu tür sitotoksik bağışıklık hücrelerinin hedef hücreleri ifade eden NKG2D ligand 'ı (NKG2DL) tanımasını ve 2.zıdamasını sağlayan önemli bir aktive edici reseptördür. Sağlıklı hücreler genellikle NKG2DL'i ifade etmez. Bunun yerine, NKG2DL ekspresyözü kötü huylu veya virüs bulaşmış hücrelerde, bunları bağışıklık açıklığı^5'euygun hale getirmek için yükseltilir.

İnsan NKG2DL ailesi, aralarında MHC I zincirine bağlı iki molekül A ve B (MICA ve MICB⁶⁾ve sitomegalovirüs UL16 bağlayıcı proteinlerin 1–6 (ULBP1-6⁷⁾bulunduğu bilinen sekiz molekülden oluşur. NKG2DL'nin ifadesi transkripsiyon, transkripsiyon sonrası ve çeviri sonrası düzeyler üzerinde düzenlenir⁸. Bu nedenle sağlıklı dokularda NKG2DL ekspresyözü sağlıklı hücrelerin yüzeyinde yaygın olarak saptanamazken, NKG2DL mRNA⁹ ve hücre içi protein ekspresyözü bildirilmiştir. Bu tür ifadenin işlevsel ilgisi ve bu tür gizli ifade desenlerinin altında kalan mekanizmalar tanımlanmaya devam eder¹⁰.

Kanser hücrelerinde NKG2DL ekspresyonunun mekanistik düzenlemesi büyüleyici bir araştırma alanıdır. Hücresel streste yer aldığı bilinen yollar, örneğin ısı şoku stres yolu⁹veya ATAKSI TELANGIEKTEKTAZI mutasyona uğramış (ATM) ve Rad3 ile ilgili (ATR) yol¹¹gibi DNA hasarı ile ilişkili yollar ve viral veya bakteriyel enfeksiyonlar doğrudan NKG2DL ekspresyonunun indüksiyonu ile bağlantılıdır¹². Bununla birlikte, NKG2DL'nin yüzey ekspresyonu etkili bir şekilde indüklenmiş olsa bile, bu ifade, bazı kanserlerde bağışıklık kaçışı ve zayıf klinik prognoz ile ilişkili bir mekanizma olan proteolitik aracılı dökülme yoluyla tekrar kaybolabilir¹³.

Hücre yüzeyi NKG2DL'nin yokluğu da AML'li hastalarda önemli roller oynayabilir. Burada, yoğun kemoterapi ile tedavi genellikle remisyona neden olur, ancak nüks genellikle kemoterapilerden seçici olarak kurtulan ve bağışıklık tepkisinden kaçan lösemik kök hücrelerden (LSC) ortaya çıkar. Son zamanlarda gösterdiğimiz gibi, LSC'ler, örneğin, NKG2DL yüzey ifadesini bastırarak NK hücre lizizinden kaçar¹⁴.

Tersine, yüzey NKG2DL ekspresyonunun yokluğu, hücrelerin putatif kök benzeri alt nüfuslarını toplu muadil lösemik alt nüfuslardan tanımlamak ve canlı bir şekilde izole etmek için bir yöntem olarak kullanılabilir. Burada, NKG2DL yüzey ekspresyonünü tespit etmek ve böylece lösemide ve belki de diğer kanserlerde NKG2DL negatif kök hücrelerini tanımlamak için kullanılabilecek iki akış sitometrik yaklaşımı sunuyoruz: Pan-ligand yüzey tanıma için bir yöntem ve bilinen NKG2DL proteinlerini tanıyan tek veya havuzlu antikorlarla boyama içeren bir yöntem.

Protokol

Basel ve Tuebingen Üniversite Hastaneleri Etik İnceleme Kurulu'nun onayı sonrasında hasta örnekleri alındı.

1. NKG2D füzyon proteininin biyotinilasyonu

NOT: Bu adım, üreticinin talimatına göre bir biyotinilasyon kiti (bkz. Malzeme Tablosu)ile gerçekleştirilir. Protokolün bu adımı lekelenmeden en az 24 saat önce yapılmalıdır. Biyotinillenmiş NKG2D füzyon proteini -20 °C'de saklanmalıdır.

1. Hem biotin hem de NKG2D füzyon protein tüplerini oda sıcaklığında (RT) çözün.
   NOT: Hücrelerin daha fazla deneysel kullanım için steril olması gerekiyorsa (farelerde enjeksiyon, koloni şekillendirme ünitesi tahlilleri, vb.), kirlenmeyi önlemek için füzyon proteinini bir laminer akış başlığı altında yeniden oluşturun. Aksi takdirde, her adım bir tezgahta gerçekleştirilebilir.
2. 50μg'lik lyophilized NKG2D füzyon proteinini hızla aşağı çevirin. Tozu yeniden inşa etmek ve bir P1000 mikropipette kullanarak iyice karıştırmak için 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
3. 100 μg/mL'lik son stok konsantrasyonunu elde etmek için bir biotin tüpüne 100 μL NKG2DL füzyon proteini ekleyin.
4. P100 mikropipette ile sürekli canlandırma ile çözeltiyi iyice karıştırın.
5. Füzyon proteini/biotin çözeltisini kontrollü bir RT'de 24 saat kuluçkaya yatırın. Füzyon proteini kullanıma hazır.

2. Birincil AML hücrelerinin çözülmesi

NOT: Sıvı azot içinde depolanan hasta başına yaklaşık 5.000.000 dondurulmuş lösemik hücre çözülmüş ve daha sonra tahliller için hemen kullanılmıştır. Lösemik hücreler elde edildi ve daha önce açıklandığı gibi donduruldu¹⁵. Kısaca, AML ve yüksek patlama hücresi yüzdesi olan hastalardan toplanan periferik kan örnekleri (mononükleer hücreler arasındaki patlamaların% >90'ı) mononükleer hücreler elde etmek için yoğunluk gradyan ayrımı ile işlendi ve daha sonra% 10 dimetil süloksit çözeltisi (DMSO) içeren fetal baldır serumunda (FCS) donduruldu. Hücre sayıları, hastadaki lökosit konsantrasyonuna bağımlılıkta hastalar arasında oldukça çeşitlidir (aralık: mL kan başına 1.000.000 ila 30.000.000 lösemik hücre).

1. Bir su banyosu kullanarak 37 °C'de FCS'nin% 10'unu içeren önceden ılık RPMI ortamı. Her bir AML hücresi şişesi için (1 mL FCS + % 10 DMSO'da 30.000.000 hücreye kadar), 15 mL reaksiyon tüpüne 10 mL önceden ısıtılmış ortam ekleyin.
2. Birincil AML içeren cryovial'ı sıvı azot deposundan çıkarın ve hücreleri 37 °C su banyosu kullanarak hemen çözün. Tüpü suda hafifçe ileri geri hareket ettirerek şişenin içeriğinin sadece küçük bir buz kristali kalana kadar çözülmesini sağlar.
3. Çözülen hücreleri hemen orta içeren tüpe aktarın ve şişeyi 1 mL orta kullanarak durulayın.
4. Hücreleri 300 x g'da 10 dakika santrifüj edin ve peletin rahatsız etmeden süpernatantı atın.
5. Hücreleri 5 mL FCS'nin %10'unu içeren RPMI ortamı ve 300 x g'da santrifüj ile 10 dakika yıkayın.

3. Hücre sayımı

1. Hücre peletini FCS'nin %10'unu içeren bilinen bir RPMI ortamı hacminde yeniden kullanın.
2. Hücre süspansiyonunun küçük bir hacmini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve trypan mavisi veya canlı hücre / ölü hücre ayrımcılığına izin veren başka bir alternatif boya ile bilinen bir oranda seyreltin.
3. Hücreleri saymak için herhangi bir cihazı kullanın.
4. Hücreleri 300 x g'da 10 dakika santrifüj edin ve peletin rahatsız etmeden süpernatantı atın.

4. Biyotinillenmiş NKG2D füzyon proteini kullanılarak birincil AML hücrelerinin boyanması

1. 500 mL PBS'yi sığır serum albümini (BSA) ve Etilenediaminetetraasetik asit (EDTA) ile sırasıyla 0,07 mM ve 2 mM'lik son konsantrasyona takviye ederek boyama tamponu hazırlayın. Gerekirse pH'ı (7,2–7,4) ayarlayın.
2. Hücre peletini boyama tamponu ile 0,5 x 10⁷ hücre/mL'lik son konsantrasyona yeniden biriktirin.
   NOT: İsteğe bağlı olarak, boyamadan önce, hücreler bir engelleme maddesiyle (örneğin RT veya FcR engelleyici maddede 30 dakika boyunca hIgG (1μg/ml) ) inkübe edilebilir).
3. Hücre süspansiyonunun 100 μL'lik kısmını 96 kuyulu U-alt plakaya aktarın ve plakayı 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Peletin rahatsız etmeden süpernatant atın.
4. Biyotinillenmiş NKG2D füzyon proteininin ana karışımını hazırlayın, böylece hücreler kuyu başına 50 μL'lik son bir hacimde, kuyu başına 10 μg / mL'lik son konsantrasyonda yeniden kullanılır.
5. 4.4. adımda hazırlanan ana karışımı 100 μL pipet kullanarak ekleyin ve hücre peletlerini 300 μL çok kanallı pipetle yeniden atın.
   NOT: Boyama için gerekli füzyon proteini miktarını azaltmak için son hacmi hücre sayısına göre ölçeklendirin.
6. Hücre süspansiyonu RT'de 25 dakika veya 4 °C'de 50 dakika kuluçkaya yatırın.
7. 300 μL çok kanallı pipetle kuyu başına 200 μL boyama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.
8. Plakayı 300 x g'da 10 dakika santrifüj edin ve peletin rahatsız etmeden süpernatantı atın.
9. 4.7 ve 4.8.
   NOT: Burada açıklanan lekeleme, hücre kültürü 96 kuyulu U-bottom plakada gerçekleştirilir. Bu nedenle, bu tür plakaların küçük hacim kapasitesi nedeniyle yıkama adımları iki kez gerçekleştirilir. Boyama diğer tüplerde de yapılabilir ve yıkama adımları daha büyük bir hacim kullanılarak yalnızca bir kez yapılabilir.
10. Streptavidin-PE kullanarak bir ana karışım hazırlayın (seyreltmeler için Tablo 1'e bakın) böylece hücreler 50 μL'lik son bir hacimde yeniden biriktirilir.
    NOT: Hücrenizin ilgi alanı için CD33, CD34 gibi seçim antikorları ekleyin.... AML için.
11. 4.10. adımda hazırlanan ana karışımı 100 μL pipet kullanarak ekleyin ve hücre peletlerini 300 μL çok kanallı pipetle yeniden atın.
12. Hücre süspansiyonlarını RT'de 15 dakika veya karanlıkta 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
13. 300 μL çok kanallı pipetle kuyu başına 200 μL boyama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.
14. Plakayı 300 x g'da 10 dakika santrifüj edin ve peletin rahatsız etmeden süpernatantı atın.
15. 4.13 ve 4.14 adımlarını yineleyin.
16. Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için 7-AAD (7-Aminoactinomycin D, 1:1000) veya herhangi bir reaktif dahil olmak üzere bir lekelenme tamponu çözeltisi hazırlayın.
17. 300 μL çok kanallı mikropipette kullanılarak 4.16 adımda hazırlanan 200 μL boyama tamponu + 7-AAD'de hücre peletlerini yeniden dirsindirin.
18. Akış sitomemetrisi aygıtı kullanarak hücreleri analiz edin.

5. Tek veya havuza tek anti-NKG2DL antikorlarının lekelenerek boyanması

1. 4.2. adımdakiyle aynı hücre süspansiyonu kullanın.
2. Hücre süspansiyonunun 100 μL'lik kısmını 300 μL çok kanallı pipet kullanarak hücre kültürü 96 kuyulu U-alt plakaya aktarın ve plakayı 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin. Peletin rahatsız etmeden süpernatant atın.
3. Her birincil antikor veya havuzalanmış antikor için bir antikor ana karışımı hazırlayın (seyreltmeler için Tablo 2'ye bakınız), böylece hücreler 50 μL'lik son bir hacimde yeniden canlanır.
4. 5.3. adımda hazırlanan ana karışımı 100 μL pipet kullanarak ekleyin ve hücre peletlerini 300 μL çok kanallı pipetle yeniden atın.
5. RT'de hücreleri 25 dakika kuluçkaya yatırın.
6. 300 μL çok kanallı pipet kullanarak kuyu başına 200 μL boyama tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.
7. Hücre kültürünü 10 dakika boyunca 300 x g'da 96 kuyulu U-alt plakayı santrifüj edin ve peletin rahatsız etmeden süpernatantı atın.
8. 5.6 ve 5.7.
9. İkincil antikoru ekleyerek bir antikor ana karışımı hazırlayın (seyreltmeler için Tablo 2'ye bakınız), böylece hücreler kuyu başına 50 μL'lik son bir hacimde yeniden atlanır.
10. 100 μL pipet kullanarak 5.9 adımında hazırlanan ana karışımı ekleyin ve hücre peletlerini 300 μL çok kanallı pipetle yeniden atın.
11. RT'de 15 dakika veya karanlıkta 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
12. 300 μL çok kanallı pipet kullanarak kuyu başına 200 μL boyama tamponu ekleyerek yıkayın.
13. Hücre süspansiyonunu 300 x g'da 10 dakika santrifüj edin ve peletin rahatsız etmeden üstnatantı atın.
14. 5.12 ve 5.13 adımlarını yineleyin.
15. 4.16. adımda hazırlanan 7-AAD içeren 200 μL boyama tamponunda hücre peletlerini yeniden süsün.
16. 6. adımda açıklandığı gibi bir akış sitometri aygıtı kullanarak hücreleri analiz edin.

6. Veri toplama

NOT: Lazerlerin düzgün çalıştığından emin olmak için akış sitometresinin haftalık kalite kontrollerinin yapıldığından emin olun. Burada sunulan protokol için, tüm kanallardaki lazer performanslarını kontrol etmek için göreli boncuklarla haftalık Sitometre ve İzleme (CTS) işlemi gerçekleştirilir. CTS'den sonra, 8 tepeli boncuklar dahili kontrol olarak kullanılarak 10.000 olay kaydedilir. Tüm zirveler kapılarının içinde aynı konumda olmalı ve birbirlerinden iyi ayrılmalıdır.

1. Boncuklu veya¹⁶hücreli dedektörler arasındaki spektral çakışmayı çıkarmak için matris telafisini oluşturun.
2. Lekelenmemiş hücreler ve tek lekeli boncuklar için 10.000 olay kaydedin. Floresan eksi bir (FMO) kontrolleri için 50.000 olay ve tam lekeli örnekler için 100.000 olaya kadar kayıt kaydedin.
   NOT: Alternatif olarak, hücreler üzerinde tek lekeli numuneler yapılabilir. Öyleyse, hücrelerin istenen işaretleyici için pozitif bir sinyale sahip olduğundan emin olun.
3. Spektral çakışma miktarını ortaya çıkarmak için deneyde kullanılan her florofor için tek bir lekeli hücre veya boncuk örneği alın. Dökülme değerlerini hesaplamak ve ölçülen tüm örneklere kompanzasyon matrisini uygulamak için akış sitometri cihazının kompanzasyon oluşturucusunun kullanımını kullanın.
   NOT: İkincil antikorlar, tazminat boncuklarla hesaplanırsa boncuk kullanılarak tazminat oluşturulması için kullanılamaz. Kompanzasyon boncuklarının türüne bağlı olarak, ikincil antikorlar boncuklarla tazminat için kullanılamaz.
4. FDO kontrolleri ve füzyon proteini ile tam lekeli numuneler için öncelikle hücreleri ileri saçılmalarına (FSC) ve yan dağılımlarına (SSC) göre seçin. Çiftlerin dışlanmasından sonra, ölü hücreleri dışlamak için 7-AAD (PercP-Cy5.5) sinyali için olumsuzluklarına dayanarak hücreleri kapıya tutun (bkz. adım 5.15). Son çizim, cd34 (Y ekseni) ve NKG2DL (X ekseni) ifadelerini canlı singlet'larda gösterir.
5. Tek anti-NKG2DL antikorları için, örneklere aynı stratejiyi uygulayın, ancak ligand pozitifliğinin PE kanalında değil Alexa Fluor 488'de olduğunu unutmayın.
6. Bu deneme için uygun FDO denetimleri için 6.4 ve 6.5 adımlarından gating stratejisi için FMO kontrollerine göre kapıları ayarlayın (bkz. Tablo 3): Analiz yazılımında, negatif kesir üzerine bir kapı çizin. Tam lekeli numune kayıt edilirken, daha önce oluşturulan kapının üzerindeki hücreler analiz edilen işaretleyici için pozitiftir.

Sonuçlar

Burada sunulan protokollerin her ikisi de AML LSC'nin, LSC^17'ninbilinen bir belirteci olan CD34 kullanılarak akış sitometrik analizleri ile zenginleştirilmesine izin verir, NKG2DL yüzey ekspresyonu ile birlikte pan-ligand tanıma veya bireysel ligandlara karşı havuzalanmış antikorlarla boyama. Şekil 1'de,analiz edilen AML örneklerinin CD34 ve NKG2DL için pozitif olduğunu, ancak toplamda dört farklı popülasyonun varlığıyla gösterilen negatif alt pop...

Tartışmalar

Burada, insan birincil AML hücrelerinde NKG2DL yüzey ekspresyonünü tespit edebilecek iki akış sitometrik yöntemi sunuyoruz. Her iki algılama yönteminin de diğer antikor lekeleri ile birlikte kullanılabileceğini gösteriyoruz (örneğin CD34 ekspresyonun algılanmasını). Benzer boyamalar diğer birincil hücre tiplerinde ve hücre hatlarında da yapılabilir.

Son zamanlarda AML hasta patlamalarının yüzeyinde NKG2DL'nin bulunmamasının LSC^14'izenginleşt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-amminoactinomycin D (7-AAD)	Invitrogen	A1310	Viability dye
96 well plate U bottom	Sarstedt	833925500	96 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34	BD	555824	Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614
Bovine Serum Albumin	PanReac AppliChem	A1391,0050	Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Roth	8043.1	Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS)	BioConcept	2-01F10-I	Component of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2	BD	/	Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A21222	Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF	R&D	1299-NK-050	Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID:
Human ULBP-1 Antibody	R&D	AF1380	Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 Antibody	R&D	AF1298	Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725
Human ULBP-3 Antibody	R&D	AF1517	Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835
MICA Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-35346	Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-66698	Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions	Miltenyibiotec	130-093-385	Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-500ML	Component of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A11034	Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um	Spherotech Inc.	RCP-30-20A	Beads used for flow cytometry device maintainance
RPMI medium	Sigma Aldrich	R8758-500ML	Cell culture medium
RayBright Universal Compensation Beads	Raybiotech	137-00013-100	Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL	Invitrogen	S866	Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection