Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מציגים שני פרוטוקולי הכתמה שונים עבור NKG2D ליגנד (NKG2DL) זיהוי בלוקמיה מיאלואידית חריפה אנושית (AML) דגימות. הגישה הראשונה מבוססת על חלבון היתוך, המסוגל לזהות את כל הליבנדים הידועים ואולי עדיין לא ידועים, בעוד הפרוטוקול השני מסתמך על תוספת של נוגדנים מרובים נגד NKG2DL.

Abstract

בתוך אותו חולה, היעדר ליגנדים NKG2D (NKG2DL) ביטוי פני השטח הוכח להבחין בין תת אוכלוסין לוקמי עם תכונות תאי גזע (מה שנקרא תאי גזע לויקמיים, LSCs) מתאים לויקמיים עמיתים מובחנים יותר חסרי פוטנציאל חניכת מחלות למרות שהם נושאים מוטציות גנטיות ספציפיות לוקמיה דומות. NKG2DL הן ביוכימיות מגוונות מאוד MHC בכיתה I כמו מולקולות עצמיות. תאים בריאים בתנאים הומיאוסטטיים בדרך כלל אינם מבטאים NKG2DL על פני התא. במקום זאת, ביטוי של ליגנדים אלה מושרה עם חשיפה ללחץ תאי (למשל, טרנספורמציה אונקוגנית או גירויים זיהומיים) כדי לעורר חיסול של תאים פגומים באמצעות תמוגה באמצעות תאי מערכת החיסון קולטן NKG2D כגון תאי רוצח טבעי (NK). מעניין, ביטוי פני השטח NKG2DL מודחק באופן סלקטיבי בתת-אוכלוסין LSC, ומאפשר לתאים אלה להתחמק ממעקב חיסוני בתיווך NKG2D. כאן, אנו מציגים ניתוח זה לצד זה של שתי שיטות ציטומטריית זרימה שונות המאפשרות חקירה של ביטוי פני השטח NKG2DL על תאים סרטניים כלומר, שיטה הכוללת זיהוי פאן-ליגנד ושיטה הכוללת כתמים עם נוגדנים מרובים נגד ליגנדים בודדים. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להפריד תת-אוכלוסין תאיים שלילי NKG2DL קיימא עם תכונות תאי גזע סרטן putative מ NKG2DL חיובי שאינו LSC.

Introduction

תאי NK הם משפיעים חשובים של מערכת החיסון המולדת שיכולים לזהות ולחסל תאים ממאירים או תאים בריאים לחוצים (למשל, על ידי זיהום ויראלי) ללא גירוי אנטיגן קודם1. תהליך זה מוסדר היטב באמצעות רפרטואר מורכב של הפעלת קולטנים - כגון קולטני ציטוטוקסיות טבעיים (NCRs), NKG2D ו- CD16 - וקולטנים מעכבים המיוצגים במידה רבה על ידי קולטנים דמויי אימונוגלובולין רוצח (KIRs)2. קשירת KIRs למולקולות אנטיגן מסוג לויקוציטים אנושי (HLA) מסוג I על תאים סומטיים מבטיחה הכרה עצמית ומעבירה סובלנות לתאי NK. מצד שני, היעדר הכרה עצמית וקשירה מוגברת של הפעלת קולטנים לליגנדים שלהם על תאי היעד מפעילים את שחרורם של גרגירים ציטוטוקסיים המובילים לציטוקסיות בתיווך תא NK1. לבסוף, תאי NK יכולים להפעיל ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) על ידי כריכה של קולטן הפעלת CD16 ליעדים המבטאים את החלק Fc של Ig (FcR)2. מלבד ציטוטוקסיות ישירה, תאי NK יכולים גם לעורר שחרור ציטוקינים המגשר בין המולדת למערכת החיסון האדפטיבית3.

NKG2D הוא קולטן הפעלה מרכזי המתבטא ב- NK, NKT, γδ T, ותאי CD8 + T נאיביים4 המאפשרים לתאי חיסון ציטוקסיים כאלה לזהות וליזה ליגנד NKG2D (NKG2DL) המבטאים תאי יעד. תאים בריאים בדרך כלל אינם מבטאים NKG2DL. במקום זאת, ביטוי NKG2DL הוא upregulated על תאים ממאירים או נגועים בווירוס כדי להפוך אותם נוחים לאישור מערכת החיסון5.

משפחת NKG2DL האנושית כוללת שמונה מולקולות ידועות ביניהן שתי המולקולות הקשורות לשרשרת MHC I A ו- B (MICA ו- MICB6) וחלבוני cytomegalovirus UL16 מחייבים 1-6 (ULBP1-67). הביטוי של NKG2DL מוסדר על תמלול, לאחר תמלול, כמו גם את הרמות שלאחר התרגום8. ככזה, בעוד ביטוי NKG2DL הוא בדרך כלל לא ניתן לזהות על פני השטח של תאים בריאים, NKG2DL mRNA9 וביטוי חלבון תאי דווחו ברקמות בריאות. הרלוונטיות התפקודית של ביטוי כזה והמנגנונים שבביד דפוסי ביטוי אי התאמה כאלה נותרים מוגדרים10.

הרגולציה המכניסטית של ביטוי NKG2DL בתאי הסרטן היא תחום חקירה מרתק. מסלולים ידועים להיות מעורבים או מתח תאי, למשל, מסלול הלחץ הלם חום9, או נתיבים הקשורים נזק DNA, כגון אטקסיה telangiectasia מוטציה (ATM) ו Rad3 הקשורים (ATR) מסלול11, כמו גם זיהומים ויראליים או חיידקיים קושרו ישירות אינדוקציה של ביטוי NKG2DL12. עם זאת, גם אם ביטוי פני השטח של NKG2DL הושרה ביעילות, ביטוי זה יכול ללכת לאיבוד שוב באמצעות שפיכה בתיווך פרוטאוליטי, מנגנון הקשורים לבריחה חיסונית ופרוגנוזה קלינית לקויה בכמה סוגי סרטן13.

היעדר משטח התא NKG2DL עשוי גם לשחק תפקידים חשובים בחולים עם AML. כאן, טיפול עם כימותרפיה אינטנסיבית לעתים קרובות גורם הפוגה, אבל הישנות מתרחשת לעתים קרובות מתאי גזע לויקמיים (LSC), אשר באופן סלקטיבי לשרוד כימותרפיה ולהתחמק תגובה חיסונית. כפי שהראינו לאחרונה, LSCs, למשל, לברוח תמוגה תא NK על ידי דיכוי ביטוי פני השטח NKG2DL14.

הפוך, היעדר ביטוי NKG2DL משטח יכול לשמש כשיטה לזהות ולבודד באופן מעשי תת-אוכלוסין דמוי גזע putative של תאים מתת אוכלוסין לויקמי מקביל בתפזורת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ציטומטריות זרימה שניתן להשתמש בהן כדי לזהות ביטוי פני שטח NKG2DL ובכך לזהות תאי גזע שליליים NKG2DL בלוקמיה ואולי גם בסרטנים אחרים: שיטה לזיהוי משטח פאן-ליגנד ושיטה הכוללת כתמים בנוגדנים בודדים או מרופדים המזהים חלבוני NKG2DL ידועים בודדים.

Protocol

דגימות מטופלים נאספו לאחר אישור הוועדה לבדיקת אתיקה של בתי החולים האוניברסיטאיים באזל וטובינגן.

1. ביו-טינילציה של חלבון ההיתוך NKG2D

הערה: שלב זה מבוצע עם ערכת ביוטינילציה (ראה טבלת חומרים) בהתאם להוראת היצרן. שלב זה של הפרוטוקול חייב להתבצע לפחות 24 שעות לפני הכתם. חלבון ההיתוך NKG2D הביוטיניל צריך להיות מאוחסן ב -20 °C (50 °F).

  1. להפשיר הן את הביוטין, כמו גם את צינורות חלבון היתוך NKG2D בטמפרטורת החדר (RT).
    הערה: אם התאים צריכים להיות סטריליים לשימוש ניסיוני נוסף (הזרקה בעכברים, מושבה להרכיב ישבן יחידה, וכו '), לבסס מחדש את חלבון ההיתוך תחת מכסה המנוע זרימה למינאר כדי למנוע זיהום. אחרת, כל צעד יכול להתבצע על ספסל.
  2. ספין במהירות את 50μg של חלבון היתוך NKG2D ליופילי. הוסיפו 500 מיקרו-אל של תמיסת מלח (PBS) עם אגירה בפוספט כדי ליישב מחדש את האבקה ולערבב היטב באמצעות מיקרופיט P1000.
  3. הוסף 100 μL של חלבון היתוך NKG2DL לצינור ביוטין כדי להשיג ריכוז מלאי סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל.
  4. ערבבו את הפתרון ביסודיות על ידי הוצאה חוזרת רציפה עם מיקרופיט P100.
  5. לדגור על פתרון חלבון היתוך / ביוטין ב RT מבוקר עבור 24 שעות. חלבון ההיתוך מוכן כעת לשימוש.

2. הפשרת תאי AML ראשוניים

הערה: כ -5,000,000 תאים לויקמיים קפואים לכל מטופל המאוחסנים בחנקן נוזלי הופשרו ולאחר מכן שימשו לבדיקות מיד. תאים לויקמיים הושגו והוקפאו כפי שתואר בעבר15. בקצרה, דגימות דם היקפיות שנאספו מחולים עם AML ואחוזי תאי פיצוץ גבוהים (>90% מהתפוצצויות בקרב תאים מונונוקלאריים) עובדו עם הפרדה הדרגתית בצפיפות כדי להשיג תאים מונונוקלאריים ולאחר מכן קפוא בסרום עגל עוברי (FCS) המכיל 10% תמיסת דימתיל סולפוקסיד (DMSO). מספרי התאים מגוונים מאוד בין חולים בתלות בריכוז לויקוציטים בחולה (טווח: 1,000,000 עד 30,000,000 תאים לויקמיים לדם mL).

  1. מדיום RPMI חם מראש המכיל 10% של FCS ב 37 °C (50 °F) באמצעות אמבט מים. עבור כל מ"ל של תאי AML (עד 30,000,000 תאים ב FCS 1 מ"ל + 10% DMSO), להוסיף 10 מ"ל של בינוני מחומם מראש לצינור תגובה 15 מ"ל.
  2. הסר את cryovial המכיל AML ראשוני מאחסון חנקן נוזלי מיד להפשיר את התאים באמצעות אמבט מים 37 °C. מעבירים בעדינות את הצינור קדימה ואחורה במים, ומאפשרים לתוכן המצוין להפשיר עד שנותר רק גבישי קרח קטן.
  3. מיד להעביר את התאים המופשרים לתוך הצינור המכיל בינוני ולשטוף את המשחקון באמצעות 1 מ"ל של בינוני.
  4. צנטריפוגות התאים ב 300 x g במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור.
  5. לשטוף את התאים עם 5 מ"ל של RPMI בינוני המכיל 10% של FCS וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות.

3. ספירת תאים

  1. resuspend גלולה התא בנפח ידוע של RPMI בינוני המכיל 10% של FCS.
  2. העבר נפח קטן של מתלה התא לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל לדלל ביחס ידוע עם כחול טריפן או כל צבע חלופי אחר המאפשר אפליה של תאים חיים / תאים מתים.
  3. השתמש בכל התקן כדי לספור את התאים.
  4. צנטריפוגות התאים ב 300 x g במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור.

4. הכתמה של תאי AML ראשוניים באמצעות חלבון היתוך NKG2D ביוטיניל

  1. הכן את מאגר הכתמים על ידי שכשהם 500 מ"ל PBS עם אלבומין בסרום בקר (BSA) וחומצה אתילנדימינטראצטית (EDTA) לריכוז סופי של 0.07 מ"מ ו-2 מ"מ, בהתאמה. התאימו את ה-pH (7.2–7.4) במידת הצורך.
  2. resuspend גלולה התא עם חוצץ כתמים לריכוז הסופי של 0.5 x 107 תאים / מ"ל.
    הערה: אופציונלי, לפני הכתמה, התאים יכולים להיות דגירה עם סוכן חסימה (למשל hIgG (1μg/ml) במשך 30 דקות ב סוכן חסימת RT או FcR)..
  3. העבר 100 μL של השעיית התא לתרבות תא 96-well U-למטה צלחת צנטריפוגה את הצלחת ב 300 x g במשך 10 דקות. השליכו את הסופר-טבעי מבלי להפריע לכדור.
  4. הכן תערובת ראשית של חלבון היתוך ביוטינילציה NKG2D כך שהתאים יתמכו מחדש בנפח סופי של 50 μL לבאר עם ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל לבאר.
  5. הוסף את תערובת האב מוכן בשלב 4.4 באמצעות פיפטה 100 μL ו resuspend כדורי התא עם 300 μL pipette רב ערוצי.
    הערה: להקטין את הנפח הסופי בהתאם למספר התאים כדי להפחית את כמות חלבון ההיתוך הדרוש להכתמה.
  6. לדגור על השעיית התא במשך 25 דקות ב RT או 50 דקות ב 4 °C (70 °F).
  7. לשטוף את התאים על ידי הוספת 200 μL של חיץ כתמים לכל באר עם 300 μL pipette רב ערוצי.
  8. צנטריפוגות את הצלחת ב 300 x g במשך 10 דקות להשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור.
  9. חזור על שלבים 4.7 ו- 4.8.
    הערה: הכתמים המתוארים כאן מבוצעים בצלחת U-תחתית 96-well. לכן, צעדי כביסה מבוצעים פעמיים בגלל קיבולת נפח קטנה של צלחות כאלה. הכתמים יכולים להתבצע גם בצינורות אחרים וצעדי כביסה עשויים להתבצע רק פעם אחת באמצעות נפח גדול יותר.
  10. הכן תערובת אב באמצעות Streptavidin-PE (ראה טבלה 1 עבור דילול) כך שהתאים יתחנכו מחדש באמצעי אחסון סופי של 50 μL.
    הערה: הוסף נוגדני בחירה עבור סוג העניין של התא שלך כ- CD33, CD34.... עבור AML.
  11. הוסף את תערובת האב מוכן בשלב 4.10 באמצעות פיפטה 100 μL ו resuspend כדורי התא עם 300 μL pipette רב ערוצי.
  12. לדגור על השעיות התא במשך 15 דקות ב RT או 30 דקות ב 4 °C (50 °F) בחושך.
  13. לשטוף את התאים על ידי הוספת 200 μL של חיץ כתמים לכל באר עם 300 μL pipette רב ערוצי.
  14. צנטריפוגות את הצלחת ב 300 x g במשך 10 דקות להשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור.
  15. חזור על שלבים 4.13 ו-4.14.
  16. הכן פתרון של חיץ כתמים כולל 7-AAD (7-Aminoactinomycin D, 1:1000) או כל ריאגנט להבחין בין תאים חיים ומתים.
  17. כדורים של תאים resuspend במאגר כתמים μL 200 + 7-AAD מוכן בשלב 4.16 באמצעות 300 μL רב ערוצית מיקרופיפט.
  18. נתח את התאים באמצעות התקן ציטומטריית זרימה.

5. הכתמה של נוגדנים יחידים או מאוגדים יחידים נגד NKG2DL

  1. השתמש באותו השעיית תא כמו בשלב 4.2.
  2. העבר 100 μL של השעיית התא לתרבות תא 96-well U-bottom צלחת באמצעות 300 μL pipette רב ערוצי וצנטריפוגה את הצלחת ב 300 x g במשך 10 דקות. השליכו את הסופר-טבעי מבלי להפריע לכדור.
  3. הכן תערובת אב נוגדנים עבור כל נוגדן ראשוני או נוגדנים מקבצים (ראה טבלה 2 עבור דילול) כך התאים הם resuspended בנפח סופי של 50 μL.
  4. הוסף את תערובת האב מוכן בשלב 5.3 באמצעות פיפטה 100 μL ו resuspend כדורי התא עם 300 μL pipette רב ערוצי.
  5. לדגור על התאים במשך 25 דקות ב RT.
  6. לשטוף את התאים על ידי הוספת 200 μL של חיץ כתמים לכל באר באמצעות 300 μL pipette רב ערוצי.
  7. צנטריפוגות את תרבית התא 96-היטב U-צלחת תחתון ב 300 x g במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור.
  8. חזור על שלבים 5.6 ו- 5.7.
  9. הכן תערובת אב נוגדנים על-ידי הוספת הנוגדן המשני (ראה טבלה 2 לדילול) כך שהתאים יתמכו מחדש בנפח סופי של 50 μL לבאר.
  10. הוסף את תערובת האב מוכן בשלב 5.9 באמצעות פיפטה 100 μL ו resuspend כדורי התא עם 300 μL pipette רב ערוצית.
  11. דגירה במשך 15 דקות ב RT או 30 דקות ב 4 °C (50 °F) בחושך.
  12. לשטוף על ידי הוספת 200 μL של חיץ כתמים לכל באר באמצעות 300 μL pipette רב ערוצי.
  13. צנטריפוגות השעיית התא ב 300 x g במשך 10 דקות ולהשליך את supernatant מבלי להפריע לכדור.
  14. חזור על שלבים 5.12 ו- 5.13.
  15. חידשו את כדורי התא במאגר הכתמים של 200 מיקרו-לן המכיל 7-AAD שהוכן בשלב 4.16.
  16. נתח את התאים באמצעות התקן ציטומטריית זרימה כמתואר בשלב 6.

6. רכישת נתונים

הערה: ודא כי בקרות איכות שבועיות של cytometer הזרימה מבוצעות כדי להבטיח כי לייזרים מתפקדים כראוי. עבור הפרוטוקול המוצג כאן, תהליך Cytometer ומעקב שבועי (CTS) מבוצע עם חרוזים יחסית לבדיקת הופעות לייזר בכל הערוצים. לאחר CTS, 10,000 אירועים נרשמים באמצעות חרוזים 8-שיא כבקרה פנימית. כל הפסגות צריכות להיות באותה תנוחה בתוך השערים שלהן ומופרדות היטב זו מזו.

  1. צור את פיצוי מטריצה כדי להפחית חפיפה ספקטרלית בין גלאים עם חרוזים או עם תאים16.
  2. תעד 10,000 אירועים עבור התאים הלא מזוהמים והחרוזים המוכתמים הבודדים. עבור פקדי הפלואורסצנטיות מינוס פקד אחד (FMO), תעד 50,000 אירועים ועל הדגימות המוכתמות במלואן רשמו עד 100,000 אירועים.
    הערה: לחלופין, ניתן לבצע דגימות מוכתמות בודדות על התאים. אם כן, ודא כי התאים יש אות חיובי עבור הסמן הרצוי.
  3. לרכוש תא מוכתם יחיד או מדגם חרוז עבור כל פלואורופור המשמש בניסוי כדי לחשוף את כמות החפיפה הספקטרלית. השתמש ביוצר הפיצוי של התקן ציטומטריית הזרימה כדי לחשב ערכי גלישה וליישם את מטריצת הפיצוי על כל הדגימות שנמדדו.
    הערה: לא ניתן להשתמש בנוגדנים משניים ליצירת פיצוי באמצעות חרוזים אם הפיצוי מחושב עם חרוזים. בהתאם לסוג חרוזי הפיצוי, לא ניתן להשתמש בנוגדנים משניים לפיצוי עם חרוזים.
  4. עבור פקדי FMO ואת הדגימות המוכתמות המלאות עם חלבון ההיתוך, ראשית, לבחור את התאים בהתבסס על הפיזור הקדמי שלהם (FSC) ופיזור צד (SSC). לאחר ההדרה של כפולים, שער התאים בהתבסס על השליליות שלהם עבור 7-AAD (PercP-Cy5.5) אות כדי לא לכלול את התאים המתים (ראה שלב 5.15). העלילה הסופית מציגה את הביטוי של CD34 (ציר Y) ו- NKG2DL (ציר X) על סינגלים חיים.
  5. עבור נוגדנים יחידים נגד NKG2DL, להחיל את אותה אסטרטגיה על הדגימות אבל לשים לב כי חיוביות ליגנד טמון אלכסה Fluor 488 ולא ערוץ PE.
  6. התאם שערים בהתאם לבקרות FMO לאסטרטגיית גיטינג החל מהשלב 6.4 ו- 6.5 (ראה טבלה 3) לפקדי FMO מתאימים לביצוע עבור ניסוי זה: בתוכנת הניתוח, צייר שער על השבר השלילי. בעת הקלטת המדגם המוכתם במלואו, התאים מעל השער שנוצר בעבר הם חיוביים עבור הסמן המנותח.

תוצאות

שני הפרוטוקולים המוצגים כאן מאפשרים העשרה של AML LSC על ידי ניתוחים ציטומטריים זרימה באמצעות CD34, סמן ידוע של LSC17, בשילוב עם ביטוי פני השטח NKG2DL על ידי שימוש בזיהוי פאן-ליגנד או כתמים עם נוגדנים משולבים נגד ליגנדים בודדים. באיור 1, אנו מראים כי דגימות AML המנותחות חיוב?...

Discussion

כאן אנו מציגים שתי שיטות ציטומטריות זרימה שיכולות לזהות ביטוי פני שטח NKG2DL על תאי AML ראשיים אנושיים. אנו מראים כי ניתן להשתמש בשתי שיטות הזיהוי בשילוב עם כתמי נוגדנים אחרים (למשל, זיהוי ביטוי CD34). כתמים דומים עשויים להתבצע גם בסוגי תאים ראשיים אחרים וקווי תאים.

לאחרונה הראינו ?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים של הקרן הלאומית למדע השוויצרית (179239), הקרן למאבק בסרטן (Zuerich), קרן וילהלם סנדר ל- CL (2019.042.1) וקרן נוברטיס למחקר רפואי-ביולוגי ל- C.L. יתר על כן, פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענקים מארי Skłodowska-Curie מס '765104. אנו מודים למתקן ציטומטריית הזרימה בבאזל על התמיכה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
7-amminoactinomycin D (7-AAD)InvitrogenA1310Viability dye
96 well plate U bottomSarstedt83392550096 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34BD555824Antibody detecting CD34
RRID: AB_398614
Bovine Serum AlbuminPanReac AppliChemA1391,0050Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acidRoth8043.1Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS)BioConcept2-01F10-IComponent of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2BD/Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488Thermo ScientificA21222Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB
RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CFR&D1299-NK-050Fusion Protein detecting all NKG2DLs
RRID:
Human ULBP-1 AntibodyR&DAF1380Antibody detecting ULBP1
RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 AntibodyR&DAF1298Antibody detecting ULBP2/5/6
RRID: AB_354725
Human ULBP-3 AntibodyR&DAF1517Antibody detecting ULBP3
RRID: AB_354835
MICA Polyclonal AntibodyThermo ScientificPA5-35346Antibody detecting MICA
RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal AntibodyThermo ScientificPA5-66698Antibody detecting MICB
RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactionsMiltenyibiotec130-093-385Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered SalineSigma AldrichD8537-500MLComponent of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488Thermo ScientificA11034Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs
RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 umSpherotech Inc.RCP-30-20ABeads used for flow cytometry device maintainance
RPMI mediumSigma AldrichR8758-500MLCell culture medium
RayBright Universal Compensation BeadsRaybiotech137-00013-100Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mLInvitrogenS866Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection

References

  1. Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger. Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
  2. Campbell, K. S., Hasegawa, J. Natural killer cell biology: an update and future directions. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (3), 536-544 (2013).
  3. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  4. Wensveen, F. M., Jelenčić, V., Polić, B. NKG2D: A master regulator of immune cell responsiveness. Frontiers in Immunology. 9, 441 (2018).
  5. Zingoni, A., et al. NKG2D and its ligands: "One for All, All for One". Frontiers in Immunology. 9, 476 (2018).
  6. Eagle, R. A., Trowsdale, J. Promiscuity and the single receptor: NKG2D. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 737-744 (2007).
  7. El-Gazzar, A., Groh, V., Spies, T. Immunobiology and conflicting roles of the human NKG2D lymphocyte receptor and its ligands in cancer. Journal of Immunology. 191 (4), 1509-1515 (2013).
  8. Venkataraman, G. M., Suciu, D., Groh, V., Boss, J. M., Spies, T. Promoter region architecture and transcriptional regulation of the genes for the MHC class I-related chain A and B ligands of NKG2D. Journal of Immunology. 178 (2), 961-969 (2007).
  9. Long, E. O. Negative signaling by inhibitory receptors: the NK cell paradigm. Immunological Reviews. 224, 70-84 (2008).
  10. Hüe, S., et al. A direct role for NKG2D/MICA interaction in villous atrophy during celiac disease. Immunity. 21 (3), 367-377 (2004).
  11. Gasser, S., Raulet, D. H. Activation and self-tolerance of natural killer cells. Immunological Reviews. 214, 130-142 (2006).
  12. Groh, V., et al. Cell stress-regulated human major histocompatibility complex class I gene expressed in gastrointestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (22), 12445-12450 (1996).
  13. Maurer, S., et al. Platelet-mediated shedding of NKG2D ligands impairs NK cell immune-surveillance of tumor cells. Oncoimmunology. 7 (2), 1364827 (2018).
  14. Paczulla, A. M., et al. Absence of NKG2D ligands defines leukaemia stem cells and mediates their immune evasion. Nature. 572 (7768), 254-259 (2019).
  15. Paczulla, A. M., et al. Long-term observation reveals high-frequency engraftment of human acute myeloid leukemia in immunodeficient mice. Haematologica. 102 (5), 854-864 (2017).
  16. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
  17. Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).
  18. Taussig, D. C., et al. Leukemia-initiating cells from some acute myeloid leukemia patients with mutated nucleophosmin reside in the CD34(-) fraction. Blood. 115 (10), 1976-1984 (2010).
  19. Zhou, J., Chng, W. J. Identification and targeting leukemia stem cells: the path to the cure for acute myeloid leukemia. World Journal of Stem Cells. 6 (4), 473-484 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

168NKG2DLCD34AMLLSCFACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved