급성 골수성 백혈병의 대량 하위 집단으로부터 줄기 세포를 구별하기 위해 NKG2D 리간드 표면 검출의 두 개의 흐름 세포 측정 접근법

요약

우리는 인간 1 차급성 골수성 백혈병 (AML) 견본에 있는 NKG2D 리간드 (NKG2DL) 검출을 위한 2개의 다른 염색 프로토콜을 제시합니다. 첫 번째 접근법은 융합 단백질을 기반으로 하며, 알려진 모든 잠재적으로 알려지지 않은 리간드를 인식할 수 있으며, 두 번째 프로토콜은 다중 항 NKG2DL 항체의 첨가에 의존한다.

초록

동일한 환자 내에서, NKG2D 리간드 (NKG2DL) 표면 발현의 부재는 유사한 백혈병 특정 유전 돌연변이를 전송하지만 질병 개시 잠재력이 부족한 보다 분화된 상대 백혈병 세포로부터 줄기 세포 특성(소위 백혈병 줄기 세포, LSC)을 가진 백혈병 하위 집단을 구별하는 것으로 나타났다. NKG2DL은 생화학적으로 매우 다양한 MHC 클래스 I-like 자가 분자입니다. 상근 성 조건에서 건강한 세포는 일반적으로 세포 표면에 NKG2DL을 발현하지 않습니다. 대신, 이러한 리간드의 발현은 NKG2D 수용체 표현 면역 세포를 통해 용해를 통해 손상된 세포의 제거를 촉발하기 위해 세포 스트레스(예를 들어, 온코겐성 변환 또는 전염성 자극)에 노출되면 유도되어 천연 킬러(NK) 세포와 같은 면역 세포를 발현한다. 흥미롭게도, NKG2DL 표면 발현은 LSC 하위 집단에서 선택적으로 억제되어 이러한 세포가 NKG2D 매개 면역 감시를 회피할 수 있게 합니다. 여기서, 우리는 암세포에 대한 NKG2DL 표면 발현의 조사를 허용하는 2개의 상이한 유동 세포측정 방법에 대한 나란히 분석을 제시하고, 단일 리간드에 대하여 다중 항체로 염색하는 것을 포함하는 범리간 인식 및 방법을 관련시키는 방법. 이러한 방법은 NKG2DL 양성 비 LSC로부터 세포암 줄기 세포 특성을 가진 실행 가능한 NKG2DL 음성 세포 하위 집단을 분리하는 데 사용될 수 있다.

서문

NK 세포는 선행 항원 자극¹없이 악성 세포 또는 스트레스가 있는 건강한 세포(예를 들어, 바이러스 감염에 의한)를 인식하고 제거할 수 있는 선천성 면역 계통의 중요한 이펙터이다. 이 과정은 자연 세포 독성 수용체(NcRs), NKG2D 및 CD16과 같은 활성 수용체의 복잡한 레퍼토리를 통해 엄격하게 조절되며, 주로 킬러 면역글로불린과 같은 수용체(KIRs)^2에의해 표현되는 억제 수용체(IS) 2. 체세포에 대한 인간 백혈구 항원(HLA) 클래스 I 분자에 대한 KIRs의 결합은 자가 인식을 보장하고 NK 세포 내성을 전달합니다. 한편, 표적 세포상에서 자신의 리간드에 수용체를 활성화시키는 자기 인식및 증가된 결합의 부재는 NK 세포 매개 세포 독성^1로이어지는 세포독성 과립의 방출을 유발한다. 마지막으로, NK 세포는 Ig(FcR) 2의 Fc 부분을 발현하는 표적에 활성 수용체 CD16의 결합을 함으로써 항체 의존성 세포 세포 독성(ADCC)을 발휘할 수^있다. 직접적인 세포 독성 외에도, NK 세포는 적응형 면역 계통^3을가진 선천적인 브리징 사이토카인 방출을 시작할 수 있다.

NKG2D는 NK, NKT, γδ T 및 순진한 CD8+ T 세포^4에 발현된 주요 활성화 수용체로, 이러한 세포독성 면역 세포가 표적 세포를 현현하는 NKG2D 리간드(NKG2DL)를 인식하고 라이세할 수 있게 한다. 건강한 세포는 일반적으로 NKG2DL을 발현하지 않습니다. 대신, NKG2DL 발현은 악성 또는 바이러스에 감염된 세포에 대해 이러한 면역 통관^5에대한 의존성 있게 하기 위해 과소 조절된다.

인간 NKG2DL 제품군은 2개의 MHC I 사슬 관련 분자 A와 B(MICA 및 MICB⁶⁾및 사이토메갈로바이러스 UL16 결합 단백질 1-6 (ULBP1-6^7)이있는 8개의 공지된 분자를 포함한다. NKG2DL의 발현은 전사, 포스트 전사뿐만 아니라 번역 후 수준^8에규제된다. 이와 같이, NKG2DL 발현은 건강한 세포의 표면에서 일반적으로 검출할 수 없지만, NKG2DL mRNA⁹ 및 세포내 단백질 발현은 건강한 조직에서 보고되었다. 이러한 표현식의 기능적 관련성및 이러한 불일치 식 패턴의 기본 메커니즘은^10으로정의되어야 한다.

암세포에서 NKG2DL 발현의 기계론적 조절은 매혹적인 조사 영역이다. 세포 스트레스, 예를 들어, 열 충격 응력^경로(9)또는 DNA 손상 관련 경로(ATM) 및 Rad3 관련(ATR)^{경로(11)와}같은 DNA 손상 관련 경로뿐만 아니라 바이러스 또는 세균 감염이 NKG2DL 발현^12의유도에 직접 연결되어 왔다. 그러나, NKG2DL의 표면 발현이 효과적으로 유도되더라도, 이러한 발현은 일부^{암(13)에서}면역 탈출 및 열악한 임상 예후와 관련된 기전인 프로테오리틱 중재 흘리기(proteolytic-mediated 흘리기)를 통해 다시 손실될 수 있다.

세포 표면 NKG2DL의 부재는 또한 AML를 가진 환자에서 중요한 역할을 할 수 있습니다. 여기서, 집중적인 화학요법을 가진 처리는 수시로 면제를 유도합니다, 그러나 재발은 수시로 화학요법을 생존하고 면역 반응을 회피하는 백혈병 줄기 세포 (LSC)에서 수시로 생깁니다. 최근에 나타난 바와 같이, LSC는 예를 들어 NKG2DL 표면^{발현(14)을}억제하여 NK 셀 용해를 탈출한다.

반대로, 표면 NKG2DL 발현의 부재는 대량 대응 백혈병 하위 집단으로부터 세포의 세포줄기와 같은 하위 집단을 식별하고 유리하게 분리하는 방법으로 사용될 수 있다. 여기서, 우리는 NKG2DL 표면 발현을 검출하고 따라서 백혈병에 있는 NKG2DL 음성 줄기 세포를 확인하고 그(것)들을 확인하는 2개의 유동 세포 측정 접근법을 제시합니다: 범리간 표면 인식을 위한 방법 및 개별적인 NKG2DL 단백질을 인식하는 단 하나 또는 풀링된 항체로 염색하는 방법을.

프로토콜

환자 샘플은 바젤과 투빙겐 대학 병원의 윤리 검토 위원회의 승인에 따라 수집되었습니다.

1. NKG2D 융합 단백질의 바이오티니클레이션

참고: 이 단계는 제조업체의지시에 따라 생체 개화 키트(재료 표 참조)로 수행됩니다. 프로토콜의 이 단계는 염색하기 전에 적어도 24시간 수행되어야 합니다. 생체화 NKG2D 융합 단백질은 -20°C에 보관되어야 한다.

1. 실온(RT)에서 바이오틴과 NKG2D 융합 단백질 튜브를 모두 해동합니다.
   참고: 세포가 추가 실험용(쥐의 주입, 식민지 형성 단위 애세 등)을 위해 멸균되어야 하는 경우, 오염을 피하기 위해 라미나르 플로우 후드 하에서 융합 단백질을 재구성한다. 그렇지 않으면 각 단계는 벤치에서 수행 할 수 있습니다.
2. lyophilized NKG2D 융합 단백질의 50μg를 빠르게 회전시하십시오. 500μL의 인산완충식염(PBS)을 추가하여 분말을 재구성하고 P1000 마이크로파이프를 사용하여 철저히 혼합합니다.
3. 100 μg/mL의 최종 재고 농도를 얻기 위해 비오틴 튜브에 NKG2DL 융합 단백질의 100 μL을 추가합니다.
4. P100 마이크로파이프와 연속 재연으로 용액을 철저히 섞는다.
5. 24시간 동안 제어된 RT에서 융합 단백질/비오틴 용액을 배양합니다. 융합 단백질은 이제 사용할 준비가 되었습니다.

2. 1 차 AML 셀의 해동

참고: 액체 질소에 저장된 환자 당 약 5,000,000개의 냉동 백혈병 세포가 해동된 다음 즉시 검사에 사용되었습니다. 류혈증 세포는 이전에 설명된^15와같이 얻어서 동결하였다. 간단히, AML 및 높은 폭발 세포 백분율 (>90%의 단핵 세포 중 폭발)를 가진 환자에게서 집합된 말초 혈액 견본은 단핵 세포를 얻기 위하여 밀도 그라데이션 분리로 처리되고 그 후에 태아 송아지 혈청에서 동결 (FCS) 10% 디메틸 설프리옥사이드 용액 (DMSO)를 포함하는 태아 송아지 혈청에서 동결하였다. 세포 수는 환자에서 백혈구 농도에 의존하는 환자 들 사이에서 매우 다양합니다 (범위 : mL 혈액 당 1,000,000 ~ 30,000,000 백혈구).

1. 수조를 사용하여 37°C에서 FCS의 10%를 함유하는 미리 웜 RPMI 배지. AML 세포의 각 유리병에 대해 (1 mL FCS에 최대 30,000,000 세포 + 10 % DMSO), 15 mL 반응 튜브에 10 mL의 미리 따뜻해지는 배지를 추가하십시오.
2. 액체 질소 저장에서 1차 AML을 함유하는 극저온을 제거하고 37°C 수조를 사용하여 세포를 즉시 해동한다. 튜브를 물 속앞뒤로 부드럽게 움직여 작은 얼음 결정만 남을 때까지 유리병의 내용물이 해동할 수 있도록 합니다.
3. 해동된 세포를 즉시 중간 함유 튜브로 이송하고 1mL의 배지를 사용하여 바이알을 헹구십시오.
4. 세포를 300 x g에서 10분 동안 원심분리하고 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 버립니다.
5. FCS와 원심분리기의 10%를 함유한 RPMI 배지 5mL로 셀을 10분 동안 300 x g로 세척합니다.

3. 셀 카운트

1. FCS의 10%를 포함하는 RPMI 배지의 알려진 부피에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
2. 소량의 셀 현탁액을 1.5 mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기고 trypan blue 또는 살아있는 세포/죽은 세포 차별을 허용하는 다른 대체 염료로 알려진 비율로 희석한다.
3. 모든 장치를 사용하여 셀을 계산합니다.
4. 세포를 300 x g에서 10분 동안 원심분리하고 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 버립니다.

4. 바이오티닝 NKG2D 융합 단백질을 이용한 1차 AML 세포의 염색

1. 소 세럼 알부민(BSA)과 에틸렌디아민테트라아세산(EDTA)을 각각 0.07mMMM 및 2mMM의 최종 농도로 500mL PBS를 보충하여 염색 버퍼를 준비한다. 필요한 경우 pH(7.2-7.4)를 조정합니다.
2. 0.5 x 10⁷ 셀/mL의 최종 농도로 염색 버퍼로 세포 펠릿을 다시 중단합니다.
   참고: 선택적으로, 염색하기 전에, 세포는 차단제(예를 들어, hIgG(1μg/ml)로 RT 또는 FcR 차단 제에서 30분 동안 배양될 수 있다.
3. 셀 현탁액의 100 μL을 세포 배양 96-웰 U-바닥 플레이트로 옮기고 10분 동안 300 x g로 플레이트를 원심분리한다. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.
4. 생체분해된 NKG2D 융합 단백질의 마스터 믹스를 준비하여 세포가 우물당 10μg/mL의 최종 농도로 잘 당 50 μL의 최종 부피로 재장매되도록 한다.
5. 100 μL 파이펫을 사용하여 4.4 단계에서 준비된 마스터 믹스를 추가하고 300 μL 멀티채널 파이펫으로 셀 펠릿을 다시 매복합니다.
   참고: 염색에 필요한 융합 단백질의 양을 줄이기 위해 세포 수에 따라 최종 부피를 축소합니다.
6. 4°C에서 25분 또는 50분 동안 셀 서스펜션을 배양한다.
7. 300 μL 멀티채널 파이펫으로 잘 당 200 μL의 염색 버퍼를 추가하여 셀을 세척합니다.
8. 플레이트를 300 x g에서 10분 동안 원심분리하고 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 버립니다.
9. 4.7 및 4.8 단계를 반복합니다.
   참고: 여기서 설명된 염색은 세포 배양 96-웰 U-바닥 플레이트에서 수행됩니다. 따라서, 이러한 플레이트의 소량 용량으로 인해 세척 단계가 두 번 수행됩니다. 염색은 다른 튜브에서도 수행될 수 있으며 세척 단계는 더 큰 부피를 사용하여 한 번만 수행 될 수 있습니다.
10. 스트렙타비딘-PE를 사용하여 마스터 믹스를 준비하십시오(희석용 표 1 참조) 세포가 50 μL의 최종 부피로 다시 리시프되도록 합니다.
    참고: CD33, CD34 와 같은 관심의 세포 유형에 대한 선택 항체를 추가합니다.... AML용.
11. 100 μL 파이펫을 사용하여 4.10 단계에서 준비된 마스터 믹스를 추가하고 300 μL 멀티채널 파이펫으로 셀 펠릿을 다시 매복합니다.
12. 어두운 에서 4 °C에서 RT 또는 30 분 동안 세포 현탁액을 배양하십시오.
13. 300 μL 멀티채널 파이펫으로 잘 당 200 μL의 염색 버퍼를 추가하여 셀을 세척합니다.
14. 플레이트를 300 x g에서 10분 동안 원심분리하고 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 버립니다.
15. 4.13 및 4.14 단계를 반복합니다.
16. 7-AAD(7-Aminoactinomycin D, 1:1000) 또는 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위한 시약을 포함한 염색 버퍼의 용액을 준비한다.
17. 300 μL 멀티채널 마이크로파이프를 이용하여 4.16단계에서 제조된 200 μL 염색 버퍼 + 7-AAD에서 세포 펠릿을 재차판으로 재차한다.
18. 유동 세포측정 장치를 사용하여 세포를 분석합니다.

5. 단일 또는 풀링 된 단일 항 NKG2DL 항체의 염색

1. 4.2 단계와 동일한 셀 서스펜션을 사용하십시오.
2. 세포 현탁액의 100 μL을 세포 배양 96웰 U-바닥 플레이트로 전송하여 300 μL 멀티채널 파이펫및 원심분리판을 300 x g에서 10분 동안 분리한다. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.
3. 각 1차 항체 또는 풀링된 항체에 대한 항체 마스터 믹스를 준비(희석제에 대한 표 2 참조) 세포가 50 μL의 최종 부피로 재장매되도록 한다.
4. 100 μL 파이펫을 사용하여 5.3 단계에서 준비된 마스터 믹스를 추가하고 300 μL 멀티채널 파이펫으로 셀 펠릿을 다시 매복합니다.
5. RT에서 25분 동안 세포를 배양합니다.
6. 300 μL 멀티채널 파이펫을 사용하여 우물당 200μL의 염색 버퍼를 추가하여 셀을 세척합니다.
7. 원심분리기 세포 배양 96-웰 U-바닥 플레이트에서 300 x g에서 10 분 동안 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼네티드를 버립니다.
8. 5.6 및 5.7 단계를 반복합니다.
9. 이차 항체를 추가하여 항체 마스터 믹스를 준비합니다(희석제에 대한 표 2 참조) 세포가 우물당 50 μL의 최종 부피로 재장매되도록 한다.
10. 100 μL 파이펫을 사용하여 5.9 단계에서 준비된 마스터 믹스를 추가하고 300 μL 멀티채널 파이펫으로 셀 펠릿을 다시 매복합니다.
11. RT에서 15분 또는 어둠 속에서 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
12. 300 μL 멀티채널 파이펫을 사용하여 우물당 200 μL의 염색 버퍼를 추가하여 세척하십시오.
13. 10 분 동안 300 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리하고 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 폐기하십시오.
14. 5.12 및 5.13 단계를 반복합니다.
15. 4.16 단계에서 제조된 7-AAD를 포함하는 200 μL 염색 완충제에서 세포 펠릿을 재중단한다.
16. 6단계에서 설명된 바와 같이 유동 세포측정 장치를 사용하여 세포를 분석한다.

6. 데이터 수집

참고: 레이저가 제대로 작동하는지 확인하기 위해 유동 사이토미터의 주간 품질 제어가 수행되는지 확인하십시오. 여기에 제시된 프로토콜의 경우, 주간 사이토미터 및 추적(CTS) 프로세스는 모든 채널에서 레이저 성능을 확인하기 위해 상대 구슬로 수행됩니다. CTS 이후 8성 구슬을 내부 제어로 사용하여 10,000개의 이벤트가 기록됩니다. 모든 봉우리들은 게이트 내부와 동일한 위치에 있어야 하며 서로 잘 분리되어야 합니다.

1. 매트릭스 보정을 만들어 구슬이 있는 검출기 또는^셀(16)의스펙트럼 중첩을 뺍니다.
2. 스테인드 되지 않은 세포와 단일 스테인드 구슬에 대한 10,000개의 이벤트를 기록합니다. 형광 마이너스 1(FMO) 컨트롤의 경우 50,000개의 이벤트를 기록하고 전체 염색 된 샘플은 최대 100,000 개의 이벤트를 기록합니다.
   참고: 또는, 단일 염색된 견본은 세포에서 수행될 수 있습니다. 그렇다면 세포에 원하는 마커에 대한 양수 신호가 있는지 확인하십시오.
3. 실험에서 사용되는 각 플루오로포어에 대해 단일 스테인드 셀 또는 비드 샘플을 획득하여 스펙트럼 중첩의 양을 나타낸다. 유동 세포측정 장치의 보상 작성자는 유출 값을 계산하고 보상 매트릭스를 모든 측정된 샘플에 적용합니다.
   참고: 보상이 구슬로 계산되는 경우 비드를 사용하여 보상 생성에 이차 항체를 사용할 수 없습니다. 보상 구슬의 종류에 따라, 이차 항체는 구슬을 가진 보상에 사용될 수 없습니다.
4. 융합 단백질을 가진 FMO 컨트롤 및 전체 염색 된 샘플의 경우, 첫째, 전방 분산 (FSC) 및 측면 분산 (SSC)에 기초하여 세포를 선택하십시오. 이중의 배제 후, 7-AAD (PercP-Cy5.5) 신호에 대한 그들의 부정성에 기초하여 세포를 게이트 (단계 5.15 참조). 마지막 플롯은 살아있는 싱글t의 CD34(Y축) 및 NKG2DL(X축)의 표현을 보여 줄 수 있습니다.
5. 단일 안티-NKG2DL-항체의 경우, 샘플에 동일한 전략을 적용하지만 리그랜드 양성은 PE 채널이 아닌 알렉사 플루어 488에 있다는 점에 유의하십시오.
6. 이 실험에 적합한 FMO 컨트롤을 위해 6.4 단계 및 6.5(표 3참조)에서 게이팅 전략에 대한 FMO 컨트롤에 따라 게이트를 조정합니다. 전체 스테인드 샘플을 기록하는 동안, 이전에 생성된 게이트 위의 셀은 분석된 마커에 대해 양수이다.

결과

여기에 제시된 두 프로토콜 모두 LSC^17의알려진 마커인 CD34를 사용하여 AML LSC의 농축을 허용하며, NKG2DL 표면 발현과 함께 개별 리간드에 대한 풀링된 항체로 염색함으로써. 도 1에서,분석된 AML 샘플은 CD34 및 NKG2DL에 대해 양수이지만 부정적인 하위 집단도 존재하며, 이는 총 4개의 상이한 집단의 존재에 의해 나타난다. 우리의 데이터는 그들의 FSC와 SSC를 통해 ...

토론

여기서 우리는 인간 1차 AML 세포에서 NKG2DL 표면 발현을 검출할 수 있는 2개의 유동 세포측정 방법을 제시합니다. 우리는 두 가지 검출 방법이 다른 항체 염색체와 함께 사용될 수 있음을 보여줍니다 (예를 들어, CD34 발현을 검출). 유사한 얼룩은 또한 그밖 1 차적인 세포 모형 및 세포주에서 수행될 수 있습니다.

우리는 최근에 AML 환자 폭발의 표면에 NKG2DL의 부재가 LSC

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-amminoactinomycin D (7-AAD)	Invitrogen	A1310	Viability dye
96 well plate U bottom	Sarstedt	833925500	96 Well plate for our Flow cytometer
APC Mouse Anti-Human cd34	BD	555824	Antibody detecting CD34 RRID: AB_398614
Bovine Serum Albumin	PanReac AppliChem	A1391,0050	Component of the staining buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid	Roth	8043.1	Component of the staining buffer
Fetal Calf Serum (FCS)	BioConcept	2-01F10-I	Component of the supplemented RPMI medium
FlowJo 10.2	BD	/	Software enabling data analysis for flow cytometry experiment
Goat- anti-Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A21222	Secondary antibody detecting the primary antibodies for MICA and MICB RRID: AB_1037853
Human NKG2D Fc Chimera Protein, CF	R&D	1299-NK-050	Fusion Protein detecting all NKG2DLs RRID:
Human ULBP-1 Antibody	R&D	AF1380	Antibody detecting ULBP1 RRID: AB_354765
Human ULBP-2/5/6 Antibody	R&D	AF1298	Antibody detecting ULBP2/5/6 RRID: AB_354725
Human ULBP-3 Antibody	R&D	AF1517	Antibody detecting ULBP3 RRID: AB_354835
MICA Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-35346	Antibody detecting MICA RRID: AB_2552656
MICB Polyclonal Antibody	Thermo Scientific	PA5-66698	Antibody detecting MICB RRID: AB_2663413
One-step Antibody Biotinylation Kit 1 strip, for 8 reactions	Miltenyibiotec	130-093-385	Biotinylation kit for the NKG2DL fusion protein
Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-500ML	Component of the staining buffer
Rabbit anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A11034	Secondary antibody detecting the primary antibodies for the ULBPs RRID: AB_2576217
Rainbow Calibration Particles (8-peaks) 3.0 um	Spherotech Inc.	RCP-30-20A	Beads used for flow cytometry device maintainance
RPMI medium	Sigma Aldrich	R8758-500ML	Cell culture medium
RayBright Universal Compensation Beads	Raybiotech	137-00013-100	Beads used to create the compensation matrix
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) - 1 mg/mL	Invitrogen	S866	Seondary step for the biotinylated NKG2DL fusion protein detection