Microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) para el estudio de espinas dendríticas

Resumen

La microscopía electrónica de barrido serial de cara de bloque (SBEM) se aplica para obtener imágenes y analizar espinas dendríticas en el hipocampo murino.

Resumen

La microscopía electrónica tridimensional (3D EM) da la posibilidad de analizar parámetros morfológicos de espinas dendríticas con resolución a nanoescala. Además, algunas características de las espinas dendríticas, como el volumen de la columna vertebral y la densidad postsináptica (PSD) (que representa la parte postsináptica de la sinapsis), la presencia de terminal presináptico y el retículo endoplásmico liso o la forma atípica de PSD (por ejemplo, espinas multiinervadas), se pueden observar solo con EM 3D. Mediante el empleo de la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie (SBEM) es posible obtener datos EM 3D más fácilmente y de una manera más reproducible que cuando se realiza la sección en serie tradicional. Aquí mostramos cómo preparar muestras de hipocampo de ratón para el análisis de SBEM y cómo este protocolo se puede combinar con el estudio de inmunofluorescencia de espinas dendríticas. La perfusión de fijación leve nos permite realizar estudios de inmunofluorescencia con microscopía de luz en una mitad del cerebro, mientras que la otra mitad fue preparada para SBEM. Este enfoque reduce el número de animales que se utilizarán para el estudio.

Introducción

La mayoría de las sinapsis excitatorias en el sistema nervioso central se encuentran en las espinas dendríticas, pequeñas protuberancias de una membrana neuronal. Estas protuberancias forman compartimentos bioquímicos confinados que controlan la transducción de señales intracelulares. La plasticidad estructural de las espinas dendríticas y las sinapsis está estrechamente relacionada con los cambios funcionales en la eficacia sináptica que subyacen a procesos tan importantes como el aprendizaje y la memoria^1,2. Es importante tener en cuenta que la microscopía electrónica (EM) es la única técnica que permite determinar si una columna dendrítica tiene una entrada presináptica. La resolución EM también es necesaria para estudiar detalles ultraestructurales como la forma de una densidad postsináptica (PSD), que representa una parte postsináptica de una sinapsis, o las dimensiones de una columna dendrítica, así como el tamaño y la forma de un bouton axonal. Además, con EM es posible visualizar las sinapsis y su entorno.

Gracias a los avances en las tecnologías de imagen y computación es posible reconstruir circuitos neuronales completos. Las técnicas de microscopía electrónica de volumen, como la microscopía electrónica de transmisión de sección serie (ssTEM), la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque serie (SBEM) y la microscopía electrónica de barrido de haz de iones enfocado (FIB-SEM) se utilizan comúnmente para reconstrucciones de circuitos neuronales³.

En nuestros estudios, el método SBEM se emplea con éxito para investigar la plasticidad estructural de las espinas dendríticas y las PSD en muestras del hipocampo del ratón y cortes cerebrales organotípicos ^4,5. El SBEM se basa en la instalación de un ultramicrotomo en miniatura dentro de la cámara del microscopio electrónico de barrido^6,7,8,9. Se toma una imagen de la parte superior del bloque de muestra, y luego el ultramicrotomo corta la muestra a una profundidad especificada, revelando una nueva cara de bloque, que se vuelve a obtener una imagen y luego se repite el proceso⁸. Como resultado, solo queda la imagen de una cara de bloque, mientras que la rebanada que se ha cortado se pierde como escombros. Es por eso que SBEM se llama una técnica destructiva, lo que significa que no es posible obtener imágenes del mismo lugar nuevamente. Sin embargo, la ventaja de los métodos destructivos en bloque es que no sufren problemas de deformación y pérdida de sección que pueden afectar significativamente la calidad de los datos y el análisis de datos³. Además, SBEM ofrece la posibilidad de obtener imágenes de un campo de visión relativamente grande (> 0,5 mm × 0,5 mm) a alta resolución³.

Para emplear SBEM, las muestras deben prepararse de acuerdo con un protocolo dedicado y altamente contrastante debido al detector de electrones retrodibuerados utilizado para adquirir imágenes. Mostramos aquí cómo realizar la preparación de muestras de acuerdo con el protocolo basado en un procedimiento desarrollado por Deerinck¹⁰ (método del Centro Nacional de Microscopía e Investigación de Imágenes (NCMIR)), utilizando tinciones reducidas de osmio-tiocarbohidrazida-osmio (rOTO) desarrolladas en la década de 1980^8,11. Además, introducimos un enfoque de fijación en dos pasos, con perfusión de fijación leve que permite utilizar el mismo cerebro tanto para estudios de inmunofluorescencia con microscopía de luz como para SBEM.

En el protocolo, un cerebro de ratón se fija principalmente con un fijador suave, y luego se corta en mitades, y un hemisferio se posfija y se prepara para la inmunofluorescencia (IF), mientras que el otro para los estudios EM(Figura 1).

Figura 1. Representación esquemática del flujo de trabajo para la preparación de espinas dendríticas para el análisis con SBEM. Los ratones fueron sacrificados y perfundidos con un fijador primario suave. El cerebro se cortó en mitades, y un hemisferio se colocó con fijador dedicado a la inmunofluorescencia (IF), crioprotegido, se cortó en rodajas con un criostato y se procesó para estudios de FI, mientras que el otro hemisferio se posfijó con fijador EM, se cortó con el vibrátomo y se preparó para los estudios em. Las rebanadas cerebrales para los estudios de SBEM se contrastaron, se incrustaron de forma plana en resina, luego se montó una región CA1 del hipocampo en el pasador y se tomaron imágenes con SBEM(Figura 1). La parte del protocolo resaltada en un cuadro amarillo se presentó en el video. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocolo

La investigación se realizó de conformidad con las directrices del Instituto Nencki y el permiso del Comité De Ética Local. Los estudios se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas de 24 de noviembre de 1986 (86/609/CEE), Ley de Protección animal de Polonia y aprobados por el primer Comité de Ética Local en Varsovia. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados y su sufrimiento.

PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos descritos a continuación deben llevarse a cabo en una campana extractora de humos de laboratorio. Debido a la naturaleza peligrosa de los reactivos utilizados. Se requieren medidas de seguridad personal como guantes, bata de laboratorio, gafas de seguridad y una máscara facial.

1. Preparación del fijador para perfusión (2% en peso/vol paraformaldehído (PFA) y 0,5% vol/vol glutaraldehído (GA) en tampón de fosfato (PB) de 0,1 M, pH 7,4)

NOTA: Prepare la solución fijadora el mismo día en que se usará y no la almacene por más de 3 horas. En caso de escasez de tiempo, prepare el PFA al 2% en 0,1 M PB el día anterior, guárdelo a 4 °C y agregue GA fresco poco antes de la perfusión.

1. Tome 400 ml de agua destilada doble estéril (ddH₂O) y caliéle a 60 °C con una placa caliente de agitación. Luego agregue 20 g de PFA. Agregue gotas de 1 M de NaOH hasta que el PFA se disuelva por completo y deje que la mezcla se enfríe.
2. Añadir 500 mL de 0,2 M PB (pH 7,4).
3. Filtre la solución para eliminar cualquier depósito y enfríelo a 4 °C.
4. Justo antes de la perfusión, agregue 20 ml de GA al 25% a la solución y luego rellene el volumen con ddH₂O a 1 L.

2. Preparación del fijador postperfusión para SBEM (2% wt/vol PFA y 2,5% vol/vol GA en 0,1 M PB, pH 7,4)

1. Tomar 50 ml del fijador para perfusión (2% de PFA y 0,5% de GA en 0,1 M de PB).
2. Agregue 5 ml de 25% de GA.

3. Preparación de fijador postperfusión para tinción de IF (4% de PFA en solución salina tamponada con fosfato (PBS))

1. Disuelva una tableta de 1x PBS (pH 7.4) en agua purificada y desionizada (H₂O) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
2. Utilice una placa caliente de agitación para calentar la solución a 60 °C y agregue 40 g de PFA.
3. Agregue gotas de 1 M de NaOH hasta que el PFA se disuelva completamente y deje que la mezcla se enfríe.
4. Ajuste el pH de la solución a 7.5 con 1 M HCl y luego rellene el volumen con H₂O a 1 L.
5. Filtre la solución para eliminar cualquier depósito.

4. Perfusión transcárdica de animales

NOTA: Todos los desechos de PFA y GA deben recolectarse y almacenarse para su eliminación de acuerdo con las regulaciones locales. La anestesia y la perfusión deben seguir las regulaciones locales. En el protocolo descrito se utilizaron ratones adultos de 3 meses de edad y 20±1 mes de edad Thy1-GFP(M) (Thy1-GFP ^+/-)¹² que expresan proteína de fluorescencia verde (GFP) en una población escasamente distribuida de neuronas glutamatérgicas, pero también se puede usar cualquier otra. Los animales fueron criados como heterocigotos con el fondo C57BL / 6J en la Casa animal del Instituto Nencki de Biología Experimental.

1. Antes de la perfusión, anestesiar a un ratón mediante la administración de una mezcla de ketamina/xilazina (hasta 90 mg/kg de ketamina de peso corporal y 10 mg/kg de xilazina de peso corporal) mediante inyección intraperitoneal (aguja calibre 27).
   1. Evalúe si la profundidad de la anestesia es suficiente comprobando los estímulos reflejos al dolor (pellizco) y el reflejo corneal (entrecerrar los ojos).
2. Después de 20 minutos realizar una inyección intraperitoneal (aguja calibre 27) de pentobarbital sódico (50 mg/kg de peso corporal).
3. Perfundir un ratón según un protocolo de cirugía de perfusión descrito por Gage et al.¹³ (ver punto 4; Figura 5-6). Usando una bomba de perfusión comience con un tampón de fosfato de 0.1 M, pH 7.4 (30 mL) durante 3 minutos y continúe con 2% de PFA y 0.5% de GA en 0.1 M PB, pH 7.4 durante 6 minutos (80 mL).
   1. Diseccionar suavemente el cerebro del cráneo y dividirlo por la mitad (ver Figura 9-10 en Gage et al., 2012¹³). Coloque una pieza en un vial que contenga fijador para SBEM y la segunda en el vial con 4% de PFA/PBS para la tinción de IF.
   2. Mantenga los hemisferios en el fijador a 4 °C durante la noche.

5. Preparación de cortes cerebrales para microscopía electrónica

1. Elija la configuración del vibratomo (velocidad de desplazamiento de la cuchilla: 0.075 mm / s, frecuencia de corte: 80 Hz).
2. Coloque la cámara de rebanada en el soporte, conéctela al vibratomo y rodéela con hielo. Luego coloque una cuchilla de afeitar en el soporte de la cuchilla vibratome.
3. Use una cuchara u objeto similar y coloque el cerebro frío (superficie dorsal hacia arriba) sobre una superficie de corte resistente (por ejemplo, una tapa de placa de Petri de vidrio). Para preparar una rebanada coronal del hipocampo hacer un corte perpendicular entre el hemisferio cerebral y el cerebelo con una cuchilla de afeitar o bisturí, eliminando así el cerebelo. El bulbo olfativo también se puede eliminar.
4. Aplique pegamento de cianoacrilato en la plataforma seca del vibratomo.
5. Recoge el cerebro con forrceps y séquelo cuidadosamente en papel de filtro.
6. Pegue el hemisferio a la plataforma cerca de la cuchilla de corte con la punta rostral hacia arriba. Conecte la plataforma al soporte e inmediatamente llénelo con 0.1 M PB helado, pH 7.4. Si el corte perpendicular se realiza correctamente, el hemisferio se mantendrá recto proporcionando el ángulo de 90 ° requerido para hacer un corte coronal simétrico que contenga el hipocampo. Asegúrese de que el cerebro esté cubierto de PB.
7. Coloque la hoja del vibratomo delante del hemisferio y bajéela hacia el lado coronal del hemisferio. Baje la cuchilla a 400 μm más en la dirección caudal y comience a cortar. Continúe cortando hasta que las dos primeras rebanadas estén completamente separadas del bloque de tejido.
8. Retraiga la cuchilla y baje otros 100 μm, luego vuelva a cortar.
9. Cuando el hipocampo se hace visible (use el atlas cerebral de ratón Paxinos y Franklin, 2004¹⁴⁾recoja las rodajas con el pequeño pincel o la pipeta Pasteur de plástico ensanchado.
10. Transfiera las rodajas a una placa de 12 pozos llena de PB frío de 0.1 M, pH 7.4.
11. Diseccionar el hipocampo en una placa de Petri de vidrio llena de 0.1 M PB, pH 7.4 usando una cuchilla de afeitar o bisturí, y ponerlo en viales de vidrio con el mismo tampón de fosfato.
    NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo de las rebanadas, complemente 0.1 M PB con azida de sodio al 0.05% (NaN_3).

6. Preparación de muestras cerebrales para la inmunotinción

1. Después de la fijación durante la noche en una solución de PFA/PBS al 4% en una campana extractora de humos, coloque el tejido cerebral en la solución de criopreservación (sacarosa al 30% en PBS con NaN_{3 al 0,05%)}y manténgalo a 4 °C durante 2 días (hasta que se hunda).
2. Preparar una solución anticongelante (15% sacarosa/30% etilenglicol/0,05% NaN_3/PBS).
3. Ajuste la temperatura del gabinete del criostato a -19 ° C y asegúrese de que se alcance la temperatura antes de continuar. Durante la sección, asegúrese de que la temperatura del gabinete permanezca entre -18 ° C y -20 ° C.
4. Use una cuchara u objeto similar y coloque el cerebro frío (superficie dorsal hacia arriba) sobre una superficie de corte resistente (por ejemplo, una tapa de placa de Petri de vidrio). Para preparar una rebanada coronal del hipocampo hacer un corte perpendicular entre el hemisferio cerebral y el cerebelo con una cuchilla de afeitar o bisturí, eliminando así el cerebelo.
5. Seleccione un disco de muestra preenfriado, cúbralo con un medio para congelar en un estante liberador y use forzadores fije el hemisferio al disco con una punta rostral hacia arriba y espere hasta que el espécimen esté completamente congelado. Inserte el disco de la muestra en una cabeza de muestra.
6. Instale una cuchilla en un soporte de cuchilla dentro de la criocámara y corte rodajas de 40 μm de grosor.
7. Transfiera las rodajas con un pincel pequeño a la placa de 96 pozos llena de solución anticongelante fría y desenrolle suavemente las secciones (recoja una rebanada después de cada ronda de corte para evitar que se pierdan en la cámara de rebanadas).
   NOTA: Los cerebros o secciones se pueden almacenar en una solución anticongelante a -20 ° C durante mucho tiempo.

7. Inmunotinción de cortes cerebrales

NOTA: Todos los pasos de tinción se realizaron en una placa de 24 pozos en un agitador de plataforma.

1. Lave las rodajas con PBS tres veces, cada vez durante 6 minutos.
2. Incubar rodajas en 300 μL de solución bloqueadora (5% de suero normal de burro [NDS]/0,3% Tritón X-100) durante 1 hora con agitación suave en un rotador.
3. Incubar las rodajas con el anticuerpo primario contra PSD-95 diluido 1:500 en 5% NDS/0,3% Triton X-100/PBS (300 μL por pozo) durante la noche a 4 °C. La concentración final del anticuerpo primario es de 2 μg/ml.
4. Lave las rodajas con Triton X-100/PBS al 0,3% a temperatura ambiente (RT) tres veces, cada vez durante 6 minutos.
5. Incubar rodajas con el anticuerpo secundario diluido 1:500 en 300 μL de Tritón X-100/PBS al 0,3% durante 90 minutos. La concentración final del anticuerpo secundario es de 4 μg/mL.
6. Lave las rodajas con PBS tres veces, cada vez durante 6 minutos.
7. Monte las rodajas en diapositivas con un medio de montaje y luego ciéntelas con una diapositiva de cubierta.
8. Examinar las muestras utilizando un microscopio confocal (63 × objetivo de aceite, NA 1,4, tamaño de píxel 0,13 μm × 0,13 μm).
   NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo: mantenga las muestras a 4 °C, protéjalas de la luz.

8. Preparación de muestras SBEM

PRECAUCIÓN: Debido a la naturaleza peligrosa de los reactivos utilizados, todos los procedimientos descritos a continuación deben llevarse a cabo en una campana extractora de humos de laboratorio. Antes de usar estos productos químicos, lea detenidamente las hojas de datos de seguridad de materiales proporcionadas por los fabricantes y pregunte al oficial de seguridad sobre las reglas locales para garantizar un manejo seguro y la eliminación de desechos.

1. Muestra de contraste
   NOTA: Los lavados de rodajas y la incubación a temperatura ambiente deben llevarse a cabo con agitación leve (por ejemplo, en un agitador de plataforma). Se utilizó agua desgasificación en autoclave.
   1. Lavar las rodajas con 0,1 M pb frío, pH 7,4 cinco veces, cada vez durante 3 minutos.
   2. Prepare una mezcla 1:1 de tetróxido de osmio acuoso al 4% y ferrocianuro de potasio al 3% (1:1 por vol). El producto final se volverá marrón. Sumergir las muestras en esta mezcla, colocarlas sobre hielo, y a partir de esta etapa es importante protegerlas de la luz. Incubarlos con un suave agitación durante 1 hora.
   3. Mientras tanto, prepare una solución de tiocarbohidrazida (TCH). Mezclar 10 ml de H₂O (ddH2 O) de doble destilación y 0,1 g de TCH y colocarlo en un horno a 60 °C durante 1 hora. Es importante girar la solución de vez en cuando (por ejemplo, cada 10 minutos). Cuando esté listo, enfríelo a temperatura ambiente.
   4. Lavar las rodajas con ddH₂O cinco veces, cada vez durante 3 minutos.
   5. Filtre la solución de TCH con un filtro de jeringa de 0,22 μm y sumerja la muestra en una solución filtrada. Las rodajas se volverán negras. Incubarlos durante 20 minutos a temperatura ambiente.
   6. Lave las muestras con ddH₂O cinco veces, cada vez durante 3 minutos.
   7. Incubar las muestras con una solución acuosa al 2% de OsO₄ durante 30 minutos a temperatura ambiente.
   8. Lave las muestras con ddH₂O cinco veces, cada vez durante 3 minutos.
   9. Coloque las muestras en acetato de uranilo acuoso al 1% filtrado e incube a 4 °C durante la noche. Utilice un filtro de jeringa de 0,22 μm para la filtración.
   10. Prepare la solución de ácido L-aspártico mezclando 0,4 g de ácido L-aspártico y 80 ml de ddH₂O, ajuste el pH a 3,8 para una disolución más fácil y luego rellene con agua a 100 ml.
   11. Al día siguiente, comience con la preparación del aspartato¹⁵ de Walton. Mezclar 0,066 g de nitrato de plomo con 10 ml de solución de ácido L-aspártico (punto 8.1.10) precalentada a 60 °C y ajustar el pH a 5,5 (medido a 60 °C) con 1 M de NaOH. Cierre el vial con aspartato de plomo y déjelo a 60 °C durante 30 minutos en un baño de agua. La solución debe ser clara. Si se vuelve turbio, debe descartarse y se debe preparar uno nuevo.
   12. Mientras tanto, lave las muestras con ddH₂O desgasificación cinco veces, cada vez durante 3 minutos. A continuación, manténgalos en el horno a 60 °C durante 30 minutos.
   13. Sumergir las muestras en la solución de aspartato de plomo recién preparada e incubarlas en el horno a 60 °C durante 20 minutos.
   14. Lave las muestras con ddH₂O desgasesado cinco veces, cada vez durante 3 minutos.
2. Deshidratación e incrustación de resina
   1. Preparar resina epoxi. Pesar los ingredientes (33,3 g de componente A/M, 33,3 g de componente B y 1 g de componente D) y mezclar bien la resina (por ejemplo, agitarla en un agitador rotativo en un tubo de 15 ml) durante al menos 30 minutos antes de agregar 16 gotas de acelerador DMP 30. Revuelva de nuevo durante otros 10 minutos.
      NOTA: Pesa los ingredientes debajo de la campana de humos. Esta cantidad de componentes da aproximadamente 60 ml de resina, lo que es suficiente para 15 viales con muestras. Puede preparar menos o almacenar el resto de la resina en una jeringa a 4 °C y utilizarla al día siguiente. Recuerde sellar la punta de la jeringa.
   2. Preparar viales con diluciones graduadas de etanol (30%, 50%, 70%, 90%, 100%, 100% etanol en agua y 100% secado en un tamiz molecular).
   3. Mezclar la resina con etanol al 100% en proporción 1:1 para obtener un 50% de resina. Mézclalo bien.
   4. Deshidratar las muestras durante 5 minutos en cada dilución de etanol a partir del 30% y terminando con etanol 100% anhidro secado en tamiz molecular. Recuerde, las muestras nunca deben secarse por completo.
   5. Infiltrar las muestras primero en resina al 50% durante 30 minutos, luego en resina 100% durante una hora, y luego nuevamente en resina al 100% durante la noche. Realice todos los pasos de infiltración con agitación lenta constante.
   6. Al día siguiente, coloque las muestras en resina fresca 100% durante una hora y luego insértelas entre las láminas de incrustación de fluoropolímeros. Desengrase trozos de lámina de incrustación con etanol, y planplan las muestras entre dos capas de la misma, utilizando dos portaobjetos de vidrio como soporte. Trate de evitar las burbujas de aire en la resina en o cerca de la muestra.
   7. Curar las muestras en el horno a 70 °C durante al menos 48 horas.
3. Recorte y montaje
   1. Separe las hojas de incrustación y corte un trozo de la muestra incrustada (aproximadamente 1 mm x 1 mm) con una cuchilla de afeitar. Transfiéralo a una película parafilm. Esto minimizará el peligro de perder la muestra debido a la electrostática.
   2. Tome un pasador de aluminio que haya sido desengrasado con etanol. Mezcle bien un epoxi conductor y use una pequeña cantidad de él para montar la muestra en el pasador. Curar epoxi conductor a 70 °C durante 10 minutos.
   3. Recorte cada lado del bloque de muestra con el cuchillo de diamante y luego pula la cara del bloque hasta que el tejido quede expuesto.
      NOTA: En este paso, confirme la presencia de una región de interés recolectando algunas secciones y realizando tinción azul toluidina¹⁶ o verificando bajo el microscopio electrónico.
   4. Reduzca el tamaño de la muestra tanto como sea posible. Luego moele la muestra al pasador con pintura conductora y cújela (durante 24 horas a temperatura ambiente o en el horno a 65 ° C durante 40 minutos).
   5. Para minimizar los artefactos de carga, cubra las muestras con una capa delgada de oro u oro / paladio.

9. Imágenes SBEM

1. Coloque el pasador con una muestra en la cámara del microscopio electrónico de barrido de cara de bloque serie. Alinee la muestra con el cuchillo. Cierre la cámara y establezca los parámetros.
2. Recopile una pila de imágenes con el aumento deseado, el tamaño de píxel, el grosor de la rebanada, el voltaje acelerado (EHT), la apertura, la presión, etc.
   NOTA: Los parámetros dependen de la muestra y del objetivo del experimento. En la tabla de materiales se incluyen ajustes de imagen iniciales ejemplares.

10.3D reconstrucciones

NOTA: Para los pasos mencionados a continuación, utilizamos software de acceso abierto, por ejemplo, FijiJ¹⁷ (ImageJ versión 1.49b), Microscopy Image Browser (MIB)¹⁸ y Reconstruct^19, pero se puede emplear otro software.

1. Convierta archivos de micrografía digital (dm) a formato TIFF. Primero importe la secuencia de imágenes (en FijiJ: File > Import > Image sequence > Choose 8 Bit Format)y luego guárdela como TIFF (en FijiJ: File > Save As > Image Sequence > Choose Tiff).
2. Ajuste el brillo y el contraste de la pila de imágenes (en FijiJ: Image > Adjust > Brightness/Contrast)y, si es necesario, denóselo (use el complemento DenoisEM para FijJ^20: Plugins > DenoiseEM > Denoise).
3. Alinear la pila (en FijiJ: Plugins > StagReg o MIB: Dataset > Alignment Tools).
4. Segmentar espinas dendríticas y sinapsis (en el software MIB o Reconstruct, hay tutoriales completos disponibles (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).

Resultados

Utilizando el método descrito anteriormente de alto contraste, se pueden obtener imágenes de buena resolución del tejido cerebral del ratón. Un gran campo de visión proporcionado por la técnica SBEM facilita la selección precisa de la región de interés. La imagen grande de la región CA1 del hipocampo se tomó para medir la longitud del estrato radiatum (SR)(Figura 2A)y para establecer la imagen con precisión en el centro(Figura 2B). A continu...

Discusión

Hay muchas variaciones del método NCMIR primario descrito por Deerinck en 2010¹⁰. Los principios básicos siguen siendo los mismos pero, dependiendo del tipo de material estudiado, se implementan ligeros cambios. Anteriormente se describió que se pueden utilizar diferentes resinas para incrustar especímenes para SBEM y por ejemplo en el caso de las plantas, Spurr's es la resina de elección debido a su baja viscosidad que permite una mejor infiltración a través de las paredes celulares

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthetic:
Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin)	Biowet Pulawy, Pulawy, Poland
Sodium pentobarbital (Morbital)	Biowet Pulawy, Pulawy, Poland
Fixatives:
Glutaraldehyde (GA)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	G5882	Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative
Hydrochloric acid (HCl)	POCH, Gliwice, Poland	575283115	pure p.a.
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	441244	prilled, 95%
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	P4417-50TAB	tablets
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S5881	reagent grade, 98%, pellets (anhydrous)
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S3264
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S3139
Perfusion:
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm)	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	14519-14
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8")	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	10091-12
Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle)	KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany	KD-FINE 900413	1.80 x 40 mm
Pair of fine (Graefe) tweezers	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	11050-10
Perfusion pump	Lead Fluid	BQ80S
Plastic vials	Profilab, Warsaw, Poland	534.02	plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm
Straight iris scissors (~9 cm)	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	14058-11
Brain slices preparation for EM:
12-well plate	NEST, Rahway, NJ, USA	712001
Cyanoacrylic glue	Fenedur, Montevideo, Uruguay
Glass vials	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72632	20 ml Scintillation Vial, a pack of 100
Pasteur pipette	VWR, Radnor, PA, USA	612-4545	LDPE, disposable, 7.5 ml
Razor blade	Wilkinson Sword, London, UK		Classic double edge safety razor blades
Scalpel blade	Swann-Morton, Sheffield, UK	No. 20
Vibratome	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica VT1000 S
Brain slices preparation for IF:
96-well plate	NEST, Rahway, NJ, USA	701101
Criostat	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica CM 1950
Ethylene glycol	Bioshop, Burlington, Canada	ETH001
Low-profile disposable blade 819	Leica Biosystems Inc., USA	14035838925
Scalpel blade	Swann-Morton, Sheffield, UK	No. 20
Sodium azide (NaN3)	POCH, Gliwice, Poland	792770426
Sucrose	POCH, Gliwice, Poland	772090110
Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound	Leica Biosystems, Switzerland	14020108926
Immunostaining:
24-well plate	NEST, Rahway, NJ, USA	702001
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody	Merck-Millipore, Burlington, MA, USA	MAB1598
Confocal microscope	Zeiss, Göttingen, Germany		Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm)
Cover slide	Menzel Glaser, Braunschweig, Germany	B-1231	24 x 60 mm
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	A31570
Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	00-4959-52
Microscope slide	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	AGAA00008	SuperFrost
Normal donkey serum (NDS)	Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA	017-000-121
Shaker	JWElectronic, Warsaw, Poland	KL-942
TritonT X-100 Reagent Grade	Bioshop, Burlington, Canada	TRX506
Electron microsocpy sample preparation
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	POCH, Gliwice, Poland	746980113
Aclar 33C Film	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	50425	Fluoropolymer Film embedding sheet
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	T58203	Epoxy embedding medium accelerator
Durcupan ACM single component A, M	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44611	Durcupan ACM single component A, M epoxy resin
Durcupan ACM single component B	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44612	Durcupan ACM single component B, hardener 964
Durcupan ACM single component D	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	44614	Durcupan ACM single component D , plasticizer
Ethyl alcohol absolute	POCH, Gliwice, Poland	64-17-5	Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC
Genlab laboratory oven	Wolflabs, York, UK	Mino/18/SS	Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply
L-Aspartic acid	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	A-9256	reagent grade, 98% (HPLC)
Lead (II) nitrate	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	467790	99.95% trace metals basis
Osmium tetroxide	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	75632	for electron microscopy, 4% in H2O
pH meter	Elmetron, Zabrze, Poland	CP-5-5
Rotator	BioSan, Józefów, Poland	Multi Bio RS-24	rotator Multi Bio RS-24
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	S5881	reagent grade, 98%, pellets (anhydrous)
Sunflower mini shaker	Grant bio, Shepreth,UK	PD-3D
Syringe filter	Millipore, Burlington, MA, USA	SLGP033NB	0,22 µm pore size
Thiocarbohydrazide	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	88535	purum p.a., for electron microscopy, 99.0% (N)
Uranyl acetate	Serva, Heidelberg, Germany	77870	Uranyl acetate·2H2O, research grade
Water bath	WSL, Swietochlowice, Poland	LWT
Specimen mounting for SBEM
96-well culture plate	VWR, Radnor, PA, USA	734-2782	96-well plates, round bottom, non treated
AM Gatan 3View stub handling tweezers	Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands	50-001521
Binocular	OPTA-TECH, Warsaw, Poland	X2000
Conductive glue	Chemtronics, Georgia, USA	CW2400	conductive eopxy
Gatan 3View sample pin stubs	Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands	10-006003
Parafilm	Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA	P7793	roll size 20 in. × 50 ft
Pelco conductive silver paint	Ted Pella, Redding, CA, USA	16062-15	PELCO® Conductive Silver Paint, 15g
Razor blades double edge	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72000	Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box.
Scanning Electron Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm
trim 90° diamond knife	Diatome Ltd., Nidau, Switzerland	DTB90
Ultramicrotome	Leica Microsystems, Vienna, Austria	Leica ultracutR
Software	webpage		tutorials
FijiJ	https://fiji.sc/
Microscopy Image Browser	http://mib.helsinki.fi/		http://mib.helsinki.fi/tutorials.html
Reconstruct	https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0		https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)
Animals
Mice	Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology.