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Method Article
La microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBEM) est appliquée pour imager et analyser les épines dendritiques de l’hippocampe murin.
La microscopie électronique tridimensionnelle (3D EM) donne la possibilité d’analyser les paramètres morphologiques des épines dendritiques avec une résolution à l’échelle nanométrique. En outre, certaines caractéristiques des épines dendritiques, telles que le volume de la colonne vertébrale et la densité post-synaptique (PSD) (représentant la partie post-synaptique de la synapse), la présence de terminal présynaptique et le réticulum endoplasmique lisse ou la forme atypique de PSD (par exemple, les épines multi-innervées), ne peuvent être observées qu’avec l’EM 3D. En utilisant la microscopie électronique à balayage série bloc-face (SBEM), il est possible d’obtenir des données 3D EM plus facilement et de manière plus reproductible que lors de la section série traditionnelle. Nous montrons ici comment préparer des échantillons d’hippocampe de souris pour l’analyse SBEM et comment ce protocole peut être combiné avec une étude d’immunofluorescence des épines dendritiques. La perfusion de fixation légère nous permet d’effectuer des études d’immunofluorescence avec microscopie optique sur une moitié du cerveau, tandis que l’autre moitié a été préparée pour SBEM. Cette approche réduit le nombre d’animaux à utiliser pour l’étude.
La plupart des synapses excitatrices du système nerveux central sont situées sur des épines dendritiques - de petites protubérances d’une membrane neuronale. Ces protubérances forment des compartiments biochimiques confinés qui contrôlent la transduction du signal intracellulaire. La plasticité structurelle des épines dendritiques et des synapses est étroitement liée aux changements fonctionnels de l’efficacité synaptique qui sous-tendent des processus aussi importants que l’apprentissage et la mémoire1,2. Il est important de noter que la microscopie électronique (EM) est la seule technique qui permet de déterminer si une colonne vertébrale dendritique a une entrée présynaptique. La résolution EM est également nécessaire pour étudier des détails ultrastructuraux tels que la forme d’une densité postsynaptique (PSD), représentant une partie postsynaptique d’une synapse, ou les dimensions d’une colonne vertébrale dendritique, ainsi que la taille et la forme d’une bouton axonale. De plus, avec EM, il est possible de visualiser les synapses et leur environnement.
Grâce aux progrès des technologies d’imagerie et de calcul, il est possible de reconstruire des circuits neuronaux entiers. Les techniques de microscopie électronique volumique, telles que la microscopie électronique à transmission à section série (ssTEM), la microscopie électronique à balayage série bloc-face (SBEM) et la microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM) sont couramment utilisées pour les reconstructions de circuits neuronaux3.
Dans nos études, la méthode SBEM est utilisée avec succès pour étudier la plasticité structurelle des épines dendritiques et des PSD dans des échantillons de l’hippocampe de la souris et des tranches de cerveau organotypiques 4,5. Le SBEM est basé sur l’installation d’un ultramicrotome miniature à l’intérieur de la chambre de microscope électronique à balayage6,7,8,9. Le haut du bloc d’échantillon est imagé, puis l’échantillon est coupé à une profondeur spécifiée par l’ultramicrotome, révélant une nouvelle face de bloc, qui est à nouveau imagée, puis le processus est répété8. En conséquence, seule l’image d’une face de bloc est laissée tandis que la tranche qui a été coupée est perdue sous forme de débris. C’est pourquoi SBEM est appelé une technique destructrice, ce qui signifie qu’il n’est pas possible d’imager à nouveau le même endroit. Cependant, l’avantage des méthodes on-block destructrices est qu’elles ne souffrent pas de problèmes de déformation et de perte de section pouvant affecter de manière significative la qualité des données et l’analyse des données3. De plus, SBEM donne la possibilité d’imager un champ de vision relativement grand (> 0,5 mm × 0,5 mm) à haute résolution3.
Pour utiliser SBEM, les échantillons doivent être préparés selon un protocole dédié et très contrasté en raison du détecteur d’électrons rétrodéclant utilisé pour l’acquisition d’images. Nous montrons ici comment effectuer la préparation des échantillons selon le protocole basé sur une procédure développée par Deerinck10 (méthode du National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR),en utilisant des taches réduites d’osmium-thiocarbohydrazide-osmium (rOTO) développées dans les années 19808,11. En outre, nous introduisons une approche de fixation en deux étapes, avec une perfusion de fixation légère qui permet d’utiliser le même cerveau à la fois pour les études d’immunofluorescence avec la microscopie optique et SBEM.
Dans le protocole, un cerveau de souris est principalement fixé avec un fixateur léger, puis coupé en deux, et un hémisphère est postfixé et préparé pour l’immunofluorescence (FI), tandis que l’autre pour les études EM (Figure 1).
Graphique 1. Représentation schématique du flux de travail pour la préparation des épines dendritiques pour l’analyse avec SBEM. Les souris ont été sacrifiées et perfusées avec un fixateur primaire léger. Le cerveau a été coupé en deux, et un hémisphère a été postfixé avec un fixateur dédié à l’immunofluorescence (FI), cryoprotégé, tranché à l’aide d’un cryostat et traité pour les études IF, tandis que l’autre hémisphère a été postfixé avec un fixateur EM, tranché avec le vibratome et préparé pour les études EM. Les tranches de cerveau pour les études SBEM ont été contrastées, à plat incorporé dans de la résine, puis une région CA1 de l’hippocampe a été montée sur l’épingle et imagée avec SBEM (Figure 1). La partie du protocole mise en évidence dans une boîte jaune a été présentée dans la vidéo. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La recherche a été réalisée conformément aux directives de l’Institut Nencki et à l’autorisation du comité d’éthique local. Les études ont été réalisées conformément à la directive du Conseil des Communautés européennes du 24 novembre 1986 (86/609/CEE), loi polonaise sur la protection des animaux et approuvées par le premier comité local d’éthique à Varsovie. Tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre d’animaux utilisés et leurs souffrances.
ATTENTION : Toutes les procédures décrites ci-dessous doivent être effectuées dans une hotte de laboratoire. En raison de la nature dangereuse des réactifs utilisés. Des mesures de sécurité personnelle telles que des gants, un manteau de laboratoire, des lunettes de sécurité et un masque facial sont requises.
1. Préparation du fixateur pour perfusion (2 % p/vol de paraformaldéhyde (PFA) et 0,5 % vol/vol de glutaraldéhyde (GA) dans un tampon phosphate (PB) de 0,1 M, pH 7,4)
REMARQUE: Préparez la solution fixative le jour même où elle sera utilisée et ne la conservez pas plus de 3 heures. En cas de manque de temps, préparer 2% de PFA dans 0,1 M PB la veille, le conserver à 4 °C et ajouter de l’AG fraîche peu de temps avant la perfusion.
2. Préparation du fixateur post-perfusion pour SBEM (2 % p./vol de PFA et 2,5 % vol/vol d’AG en 0,1 M PB, pH 7,4)
3. Préparation du fixateur post-perfusion pour la coloration IF (4% PFA dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS))
4. Perfusion transcardique d’animaux
REMARQUE: Tous les déchets PFA et GA doivent être collectés et stockés pour élimination conformément aux réglementations locales. L’anesthésie et la perfusion doivent respecter les réglementations locales. Dans le protocole décrit, des souris Thy1-GFP(M) adultes de 3 mois et femelles de 20±1 mois ont été utilisées, mais toute autreexprimant la protéine de fluorescence verte (GFP) dans une population peu distribuée de neurones glutamatergiques a été utilisée, mais toute autre peut également être utilisée. Les animaux ont été élevés en tant qu’hétérozygotes avec le fond C57BL / 6J dans la maison des animaux de l’Institut Nencki de biologie expérimentale.
5. Préparation de tranches de cerveau pour la microscopie électronique
6. Préparation d’échantillons de cerveau pour l’immunocoloration
7. Immunocoloration des tranches de cerveau
REMARQUE: Toutes les étapes de coloration ont été effectuées dans une plaque de 24 puits sur un agitateur de plate-forme.
8. Préparation de l’échantillon SBEM
ATTENTION: En raison de la nature dangereuse des réactifs utilisés, toutes les procédures décrites ci-dessous doivent être effectuées dans une hotte de laboratoire. Avant d’utiliser ces produits chimiques, lisez attentivement les fiches de données de sécurité fournies par les fabricants et interrogez l’agent de sécurité sur les règles locales pour assurer une manipulation et une élimination des déchets en toute sécurité.
9. Imagerie SBEM
10.3D reconstructions
REMARQUE: Pour les étapes mentionnées ci-dessous, nous utilisons des logiciels en libre accès, par exemple FijiJ17 (ImageJ version 1.49b), Microscopy Image Browser (MIB)18 et Reconstruct19, mais divers autres logiciels peuvent être utilisés.
En utilisant la méthode décrite ci-dessus à contraste élevé, des images de bonne résolution du tissu cérébral de la souris peuvent être obtenues. Un large champ de vision fourni par la technique SBEM facilite la sélection précise de la région d’intérêt. La grande image de la région CA1 de l’hippocampe a été prise pour mesurer la longueur de la couche radiale (SR)(Figure 2A)et pour fixer l’imagerie précisément au centre (Figure 2B
Il existe de nombreuses variantes de la méthode NCMIR primaire décrite par Deerinck en 201010. Les principes de base restent les mêmes mais, selon le type de matériel étudié, de légers changements sont mis en œuvre. Il a été décrit précédemment que différentes résines peuvent être utilisées pour intégrer des spécimens pour SBEM et par exemple dans le cas des plantes, Spurr est la résine de choix en raison de sa faible viscosité qui permet une meilleure infiltration à travers ...
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
L’imagerie SBEM, l’imagerie par microscopie optique et la préparation d’échantillons de microscopie électronique ont été réalisées à l’utilisation de l’équipement du Laboratoire d’imagerie des tissus et des fonctions qui sert d’installation centrale d’imagerie à l’Institut Nencki de biologie expérimentale.
Pour la préparation de la figure 1, l’image d’une souris (Souris_02) et un flacon de la https://smart.servier.com/ ont été utilisés.
Ce travail a été soutenu par la subvention Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603) du Centre national des sciences (Pologne) attribuée à KR.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anesthetic: | |||
Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
Sodium pentobarbital (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
Fixatives: | |||
Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | G5882 | Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative |
Hydrochloric acid (HCl) | POCH, Gliwice, Poland | 575283115 | pure p.a. |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 441244 | prilled, 95% |
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | tablets |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, ![]() |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3264 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3139 | |
Perfusion: | |||
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany | KD-FINE 900413 | 1.80 x 40 mm |
Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
Perfusion pump | Lead Fluid | BQ80S | |
Plastic vials | Profilab, Warsaw, Poland | 534.02 | plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm |
Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
Brain slices preparation for EM: | |||
12-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | |
Cyanoacrylic glue | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
Glass vials | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100 |
Pasteur pipette | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, disposable, 7.5 ml |
Razor blade | Wilkinson Sword, London, UK | Classic double edge safety razor blades | |
Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
Vibratome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica VT1000 S | |
Brain slices preparation for IF: | |||
96-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 701101 | |
Criostat | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica CM 1950 | |
Ethylene glycol | Bioshop, Burlington, Canada | ETH001 | |
Low-profile disposable blade 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
Sodium azide (NaN3) | POCH, Gliwice, Poland | 792770426 | |
Sucrose | POCH, Gliwice, Poland | 772090110 | |
Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound | Leica Biosystems, Switzerland | 14020108926 | |
Immunostaining: | |||
24-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 702001 | |
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm) | |
Cover slide | Menzel Glaser, Braunschweig, Germany | B-1231 | 24 x 60 mm |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
Microscope slide | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
Shaker | JWElectronic, Warsaw, Poland | KL-942 | |
TritonT X-100 Reagent Grade | Bioshop, Burlington, Canada | TRX506 | |
Electron microsocpy sample preparation | |||
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | POCH, Gliwice, Poland | 746980113 | |
Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | Fluoropolymer Film embedding sheet |
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | T58203 | Epoxy embedding medium accelerator |
Durcupan ACM single component A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM single component A, M epoxy resin |
Durcupan ACM single component B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM single component B, hardener 964 |
Durcupan ACM single component D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM single component D , plasticizer |
Ethyl alcohol absolute | POCH, Gliwice, Poland | 64-17-5 | Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC |
Genlab laboratory oven | Wolflabs, York, UK | Mino/18/SS | Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply |
L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | A-9256 | reagent grade, ![]() |
Lead (II) nitrate | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | ![]() |
Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 75632 | for electron microscopy, 4% in H2O |
pH meter | Elmetron, Zabrze, Poland | CP-5-5 | |
Rotator | BioSan, Józefów, Poland | Multi Bio RS-24 | rotator Multi Bio RS-24 |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, ![]() |
Sunflower mini shaker | Grant bio, Shepreth,UK | PD-3D | |
Syringe filter | Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 µm pore size |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., for electron microscopy, ![]() |
Uranyl acetate | Serva, Heidelberg, Germany | 77870 | Uranyl acetate·2H2O, research grade |
Water bath | WSL, Swietochlowice, Poland | LWT | |
Specimen mounting for SBEM | |||
96-well culture plate | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | 96-well plates, round bottom, non treated |
AM Gatan 3View stub handling tweezers | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands | 50-001521 | |
Binocular | OPTA-TECH, Warsaw, Poland | X2000 | |
Conductive glue | Chemtronics, Georgia, USA | CW2400 | conductive eopxy |
Gatan 3View sample pin stubs | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands | 10-006003 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P7793 | roll size 20 in. × 50 ft |
Pelco conductive silver paint | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® Conductive Silver Paint, 15g |
Razor blades double edge | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72000 | Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box. |
Scanning Electron Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm | |
trim 90° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau, Switzerland | DTB90 | |
Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica ultracutR | |
Software | webpage | tutorials | |
FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
Microscopy Image Browser | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
Reconstruct | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
Animals | |||
Mice | Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology. |
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