JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Последовательная блочно-лицевая сканирующая электронная микроскопия (SBEM) применяется для изображения и анализа дендритных шипов в мышином гиппокампе.

Аннотация

Трехмерная электронная микроскопия (3D EM) дает возможность анализировать морфологические параметры дендритных шипов с наноразмерным разрешением. Кроме того, некоторые особенности дендритных шипов, такие как объем позвоночника и постсинаптическая плотность (PSD) (представляющая постсинаптическую часть синапса), наличие пресинаптического терминала и гладкого эндоплазматического ретикулума или атипичной формы PSD (например, мультииннервированные шипы), могут наблюдаться только при 3D EM. Используя последовательную блочно-лицевую сканирующую электронную микроскопию (SBEM), можно получить 3D EM-данные проще и воспроизводимее, чем при выполнении традиционного последовательного сечения. Здесь мы покажем, как подготовить образцы гиппокампа мышей для анализа SBEM и как этот протокол можно сочетать с иммунофлуоресцентным исследованием дендритных шипов. Мягкая фиксация перфузии позволяет проводить иммунофлуоресцентные исследования с помощью световой микроскопии на одной половине мозга, в то время как другая половина была подготовлена к SBEM. Такой подход уменьшает количество животных, которые будут использоваться для исследования.

Введение

Большинство возбуждающих синапсов в центральной нервной системе расположены на дендритных шипах - небольших выступах мембраны нейрона. Эти протрузии образуют замкнутые биохимические компартменты, которые контролируют внутриклеточную трансдукцию сигнала. Структурная пластичность дендритных шипов и синапсов тесно связана с функциональными изменениями синаптической эффективности, лежащими в основе таких важных процессов, как обучение и память1,2. Важно отметить, что электронная микроскопия (ЭМ) является единственным методом, позволяющим определить, имеет ли дендритный позвоночник пресинаптический вход. Разрешение ЭМ также необходимо для изучения ультраструктурных деталей, таких как форма постсинаптической плотности (PSD), представляющая собой постсинаптическую часть синапса, или размеры дендритного позвоночника, а также размер и форма аксонального бутона. Кроме того, с помощью ЭМ можно визуализировать синапсы и их окружение.

Благодаря достижениям в области визуализации и вычислительных технологий можно реконструировать целые нейронные цепи. Методы объемной электронной микроскопии, такие как просвечивающая электронная микроскопия с последовательным сечением (ssTEM), последовательная блочная сканирующая электронная микроскопия (SBEM) и сфокусированная ионно-лучевая сканирующая электронная микроскопия (FIB-SEM), обычно используются для реконструкций нейронныхцепей 3.

В наших исследованиях метод SBEM успешно используется для исследования структурной пластичности дендритных шипов и PSD в образцах гиппокампа мыши и органотипических срезов мозга 4,5. SBEM основан на установке миниатюрного ультрамикротома внутри камеры сканирующего электронного микроскопа6,7,8,9. Верхняя часть блока образца визуалируется, а затем образец разрезается на заданную глубину ультрамикротомом, выявляя новую грань блока, которая снова визуализирована, а затем процесс повторяется8. В результате остается только изображение грани блока, в то время как вырезанный срез теряется в виде обломков. Вот почему SBEM называют деструктивной техникой, что означает, что невозможно снова изобразить одно и то же место. Однако преимущество деструктивных методов on-block заключается в том, что они не страдают от проблем деформации и потери секций, что может существенно повлиять на качество данных и анализ данных3. Кроме того, SBEM дает возможность изображения относительно большого поля зрения (> 0,5 мм × 0,5 мм) при высоком разрешении3.

Чтобы использовать SBEM, образцы должны быть подготовлены в соответствии со специальным, высококонтрастным протоколом из-за обратно рассеянного электронного детектора, используемого для получения изображений. Здесь мы покажем, как выполнять пробоподготовку по протоколу, основанному на процедуре, разработанной Методом Deerinck10 (Метод Национального центра микроскопии и визуализации (NCMIR)), с использованием восстановленных пятен осмий-тиокарбогидразид-осмий (rOTO), разработанных в 1980-хгодах8,11. Кроме того, мы вводим двухэтапный подход фиксации, с мягкой фиксацией перфузии, что позволяет использовать один и тот же мозг как для иммунофлуоресцентных исследований с помощью световой микроскопии, так и SBEM.

В протоколе мозг мыши в первую очередь фиксируется мягким фиксатором, а затем разрезается на половинки, а одно полушарие постфиксируется и готовится к иммунофлуоресценции (ИФ), а другое для ЭМ-исследований(Рисунок 1).

figure-introduction-4014
Рисунок 1. Схематическое представление рабочего процесса подготовки дендритных шипов к анализу с помощью SBEM. Мышей приносили в жертву и перфузировали мягким первичным фиксатором. Мозг разрезали на половинки, и одно полушарие было постфиксировано иммунофлуоресцентным (IF) фиксатором, криопротекционировано, разрезано с использованием криостата и обработано для исследований ПЧ, в то время как другое полушарие было постфиксировано ЭМ-фиксатором, разрезано вибратомом и подготовлено для эм-исследований. Срезы мозга для исследований SBEM были противопоставлены, плоско встроены в смолу, затем область CA1 гиппокампа была установлена на штифт и изображена с помощью SBEM(рисунок 1). Часть протокола, выделенная в желтом поле, была показана в видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

протокол

Исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами Института Ненцки и разрешением Местного этического комитета. Исследования проводились в соответствии с Директивой Совета Европейских сообществ от 24 ноября 1986 года (86/609/EEC), Законом о защите животных Польши и одобрены первым Местным комитетом по этике в Варшаве. Были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму количество используемых животных и их страдания.

ВНИМАНИЕ: Все процедуры, описанные ниже, должны проводиться в лабораторном вытяжном капюшоне. Из-за опасного характера используемых реагентов. Необходимы меры личной безопасности, такие как перчатки, лабораторный халат, защитные очки и маска для лица.

1. Приготовление фиксатора для перфузии (2% мас./об.параформальдегида (ПФА) и 0,5% об/об глутаральдегида (ГА) в 0,1 М фосфатного буфера (ПБ), рН 7,4)

ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте лечебный раствор в тот же день, когда он будет использоваться, и не храните его дольше, чем в течение 3 часов. В случае нехватки времени приготовьте 2% PFA в 0,1 М ПБ накануне, храните его при 4 °C и добавляйте свежий GA незадолго до перфузии.

  1. Возьмите 400 мл стерильной двойной дистиллированной воды (ddH2O) и нагрейте ее до 60 °C с помощью перемешивающей конфорки. Затем добавить 20 г PFA. Добавьте капли по 1 М NaOH до полного растворения PFA и дайте смеси остыть.
  2. Добавить 500 мл 0,2 М ПБ (рН 7,4).
  3. Отфильтруйте раствор, чтобы удалить любые отложения, и охладите его до 4 °C.
  4. Непосредственно перед перфузией добавьте в раствор 20 мл 25% GA, а затем добавьте объем ddH2O до 1 л.

2. Приготовление постперфузионного фиксатора для SBEM (2% мас./об.ПФА и 2,5% об/об ГА в 0,1 М ПБ, рН 7,4)

  1. Принимать 50 мл фиксатора для перфузии (2% PFA и 0,5% GA в 0,1 М ПБ).
  2. Добавьте 5 мл 25% GA.

3. Приготовление постперфузионного фиксатора для окрашивания ПЧ (4% PFA в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS))

  1. Растворите таблетку 1x PBS (pH 7,4) в очищенной и деионизированной воде (H2O) в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Используйте помешивающую конфорку, чтобы нагреть раствор до 60 °C и добавить 40 г PFA.
  3. Добавьте капли по 1 М NaOH до полного растворения PFA и дайте смеси остыть.
  4. Отрегулируйте pH раствора до 7,5 с 1 M HCl, затем дополните объем с H2O до 1 л.
  5. Отфильтруйте раствор, чтобы удалить все отложения.

4. Транскардиальная перфузия животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Все отходы PFA и GA должны быть собраны и сохранены для удаления в соответствии с местными правилами. Анестезия и перфузия должны соответствовать местным правилам. В описанном протоколе использовались взрослые 3-месячные и 20±1-месячные самки мышей Thy1-GFP(M) (Thy1-GFP +/-)12 экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP) в разрозненно распределенной популяции глутаматергических нейронов, но также могут быть использованы любые другие. Животные были выведены как гетерозиготы с фоном C57BL / 6J в Доме животных Института экспериментальной биологии Ненцки.

  1. Перед перфузией обезболивают мышь введением смеси кетамин/ксилазин (до 90 мг/кг массы тела кетамина и 10 мг/кг массы тела ксилазина) с помощью внутрибрюшинной инъекции (игла 27-го калибра).
    1. Оцените, достаточна ли глубина анестезии, проверив рефлекс на болевые раздражители (защемление) и рефлекс роговицы (косоглазие).
  2. Через 20 минут выполняют внутрибрюшинную инъекцию (игла 27-го калибра) пентобарбитала натрия (50 мг/кг массы тела).
  3. Перфьюзия мыши в соответствии с протоколом перфузионной хирургии, описанным Gage et al.13 (см. пункт 4; Рисунок 5-6). Используя перфузионный насос, начните с 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,4 (30 мл) в течение 3 минут и продолжайте с 2% PFA и 0,5% GA в 0,1 М ПБ, рН 7,4 в течение 6 минут (80 мл).
    1. Осторожно рассеките мозг от черепа и разделите его пополам (см. Рисунок 9-10 в Gage et al., 201213). Поместите один кусок во флакон, содержащий фиксатор для SBEM, а второй во флакон с 4% PFA/ PBS для окрашивания ПЧ.
    2. Держите полушария в фиксаторе при 4 °C в течение ночи.

5. Подготовка срезов мозга к электронной микроскопии

  1. Выберите настройки вибратома (скорость перемещения лезвия: 0,075 мм/с, частота резки: 80 Гц).
  2. Поместите камеру для срезов в держатель, прикрепите ее к вибратому и окружите льдом. Затем поместите лезвие бритвы в держатель лезвия вибратома.
  3. Используйте ложку или аналогичный предмет и поместите охлажденный мозг (дорсальная поверхность вверх) на жесткую режущую поверхность (например, стеклянную крышку чашки Петри). Для приготовления коронального среза гиппокампа делают перпендикулярный разрез между полушарием головного мозга и мозжечком лезвием бритвы или скальпелем, удаляя таким образом мозжечок. Обонятельная луковица также может быть удалена.
  4. Нанесите цианоакрилатный клей на сухую платформу вибратома.
  5. Подберите мозг щипцами и тщательно высушите его на фильтровальной бумаге.
  6. Приклеиваем полусферу к платформе близко к режущей лопатке ростральным кончиком вверх. Прикрепите платформу к держателю и сразу же заполните ее ледяным холодом 0,1 М ПБ, рН 7,4. Если перпендикулярный разрез сделан правильно, полусфера будет стоять прямо вверх, обеспечивая угол 90°, необходимый для создания симметричного коронкового разреза, содержащего гиппокамп. Убедитесь, что мозг покрыт ПБ.
  7. Расположите лезвие вибратома перед полусферой и опустите его на корональную сторону полушария. Опустите лезвие до 400 мкм дальше в каудальном направлении и начните нарезку. Продолжайте нарезку до тех пор, пока первые два ломтика не будут полностью отделены от блока тканей.
  8. Втяните лезвие и опустите еще на 100 мкм, затем снова нарежьте.
  9. Когда гиппокамп станет видимым (используйте атлас мозга мыши Paxinos and Franklin, 200414),соберите ломтики с помощью небольшой кисти или расширенной пластиковой пипетки Пастера.
  10. Переложите ломтики в 12-скважинную пластину, заполненную холодными 0,1 М ПБ, рН 7,4.
  11. Рассеките гиппокамп в стеклянной чашке Петри, наполненной 0,1 М ПБ, рН 7,4 с помощью лезвия бритвы или скальпеля, и поместите его в стеклянные флаконы с таким же фосфатным буфером.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения ломтики дополнить 0,1 М ПБ 0,05% азида натрия (NaN3).

6. Пробоподготовка мозга к иммуноокрашиву

  1. После ночной фиксации в 4% растворе PFA/PBS в вытяжном капюшоне помещают мозговую ткань в раствор криоконсервации (30% сахарозы в PBS с 0,05% NaN3)и держат при 4 °C в течение 2 дней (до погружения).
  2. Готовят раствор антифриза (15% сахарозы/30% этиленгликоля/0,05% NaN3/PBS).
  3. Установите температуру криостата в шкафу на -19 °C и убедитесь, что температура достигнута, прежде чем продолжить дальше. Во время секционирования убедитесь, что температура шкафа остается в диапазоне от -18 °C до -20 °C.
  4. Используйте ложку или аналогичный предмет и поместите охлажденный мозг (дорсальная поверхность вверх) на жесткую режущую поверхность (например, стеклянную крышку чашки Петри). Для приготовления коронального среза гиппокампа делают перпендикулярный разрез между полушарием головного мозга и мозжечком лезвием бритвы или скальпелем, удаляя таким образом мозжечок.
  5. Выберите предварительно охлажденный диск образца, накройте его средой для замораживания на свободной полке и с помощью щипцов закрепите полусферу к диску ростральным кончиком вверх и подождите, пока образец полностью замерзнет. Вставьте диск образца в головку образца.
  6. Установите лезвие в держатель лезвия внутри криокамеры и вырежьте срезы толщиной 40 мкм.
  7. Переложите ломтики небольшой кистью на 96-скважинную пластину, заполненную холодным антифризным раствором, и аккуратно развернуте срезы (соберите кусочек после каждого раунда нарезки, чтобы они не потерялись в камере для срезов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мозги или срезы могут храниться в растворе антифриза при -20 °C в течение длительного времени.

7. Иммуноокрашивание срезов мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы окрашивания выполнялись в 24-колодезной пластине на платформенном шейкере.

  1. Вымойте ломтики PBS три раза, каждый раз в течение 6 минут.
  2. Инкубировать ломтики в 300 мкл блокирующего раствора (5% обычная ослиная сыворотка (NDS)/0,3% Тритон Х-100) в течение 1 часа с легким встряхиванием на ротаторе.
  3. Инкубировать срезы с первичным антителом против PSD-95, разбавленным 1:500 в 5% NDS/0,3% Triton X-100/PBS (300 мкл на лунку) в течение ночи при 4 °C. Конечная концентрация первичного антитела составляет 2 мкг/мл.
  4. Вымойте ломтики с 0,3% Triton X-100/PBS при комнатной температуре (RT) три раза, каждый раз в течение 6 минут.
  5. Инкубировать ломтики с вторичным антителом, разбавленным 1:500 в 300 мкл 0,3% Тритона Х-100/PBS в течение 90 минут. Конечная концентрация вторичного антитела составляет 4 мкг/мл.
  6. Вымойте ломтики PBS три раза, каждый раз в течение 6 минут.
  7. Установите фрагменты на слайды с помощью монтажного носителя, а затем закройте их затвором.
  8. Исследуйте образцы с помощью конфокального микроскопа (63 × масляного объектива, NA 1,4, размер пикселя 0,13 мкм × 0,13 мкм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного хранения: держите образцы при 4 °C, защищайте их от света.

8. Пробоподготовка SBEM

ВНИМАНИЕ: В связи с опасным характером используемых реагентов все описанные ниже процедуры должны проводиться в лабораторном вытяжном вытяжном вытяжке. Перед использованием этих химических веществ внимательно прочитайте паспорта безопасности материалов, предоставленные производителями, и спросите сотрудника по безопасности о местных правилах для обеспечения безопасного обращения и удаления отходов.

  1. Контрастность образцов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка ломтиков и инкубация при комнатной температуре должны проводиться с легким встряхиванием (например, на платформе шейкере). Использовалась автоклавная дегазированная вода.
    1. Ломтики промыть холодными 0,1 М ПБ, рН 7,4 пять раз, каждый раз по 3 минуты.
    2. Приготовьте смесь 1:1 из 4% водного тетроксида осмия и 3% ферроцианида калия (1:1 об.). Конечный продукт станет коричневым. Погрузите образцы в эту смесь, поместите их на лед, и с этого этапа важно защищать их от света. Высиживают их с легким встряхиванием в течение 1 часа.
    3. Тем временем готовят раствор тиокарбогидразида (ТХ). Смешайте 10 мл двойного дистиллированного H2O (ddH2O) и 0,1 г TCH и поместите в духовку при 60 °C на 1 час. Важно время от времени закручивать раствор (например, каждые 10 минут). Когда он будет готов, охладите его до комнатной температуры.
    4. Ломтики с ddH2O промыть пять раз, каждый раз по 3 минуты.
    5. Фильтруйте раствор ТГ с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм и погружайте образец в отфильтрованный раствор. Срезы почернеют. Инкубировать их в течение 20 минут при комнатной температуре.
    6. Промыть образцы с ddH2O пять раз, каждый раз в течение 3 минут.
    7. Инкубировать образцы 2% водным раствором OsO4 в течение 30 минут при комнатной температуре.
    8. Промыть образцы с ddH2O пять раз, каждый раз в течение 3 минут.
    9. Поместите образцы в отфильтрованный 1% водный уранилацетат и инкубируют их при 4 °C в течение ночи. Используйте шприцевой фильтр 0,22 мкм для фильтрации.
    10. Готовят раствор L-аспарагиновой кислоты, смешивая 0,4 г L-аспарагиновой кислоты и 80 мл ddH2O, регулируют рН до 3,8 для более легкого растворения, а затем засыпивают водой до 100 мл.
    11. На следующий день начните с приготовления аспартата15 свинца Уолтона. Смешайте 0,066 г нитрата свинца с 10 мл раствора L-аспарагиновой кислоты (точка 8,1,10), предварительно нагретой до 60 °C, и отрегулируйте рН до 5,5 (измеренного при 60 °C) с 1 М NaOH. Закройте флакон аспартатом свинца и оставьте при 60 °C на 30 минут на водяной бане. Решение должно быть ясным. Если он становится мутным, его необходимо выбросить и подготовить новый.
    12. Тем временем промывайте образцы дегазированной ddH2O пять раз, каждый раз в течение 3 минут. Затем держите их в духовке при 60 °C в течение 30 минут.
    13. Погрузите образцы в свежеприготовленный раствор аспартата свинца и инкубируете их в духовке, установленной при 60 °C, в течение 20 минут.
    14. Промыть образцы дегазированной ddH2O пять раз, каждый раз по 3 минуты.
  2. Обезвоживание и встраивание смолы
    1. Готовят эпоксидную смолу. Взвесьте ингредиенты (33,3 г компонента A/M, 33,3 г компонента B и 1 г компонента D) и хорошо перемешайте смолу (например, встряхните ее на ротационном шейкере в пробирке 15 мл) в течение не менее 30 минут перед добавлением 16 капель ускорителя DMP 30. Снова перемешайте еще 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Взвесьте ингредиенты под вытяжной капотом. Такое количество компонентов дает примерно 60 мл смолы, чего хватит на 15 флаконов с образцами. Вы можете приготовить меньше или хранить остальную часть смолы в шприце при 4 ° C и использовать ее на следующий день. Не забудьте запечатать кончик шприца.
    2. Готовят флаконы с градуированными разведениями этанола (30%, 50%, 70%, 90%, 100%, 100% этанола в воде и 100% высушенного на молекулярном сите).
    3. Смешайте смолу со 100% этанолом в пропорции 1:1 для получения 50% смолы. Хорошо перемешать.
    4. Обезвоживать образцы в течение 5 минут в каждом разведении этанола, начиная от 30% и заканчивая 100% безводным этанолом, высушенным на молекулярном сите. Помните, что образцы никогда не должны высыхать полностью.
    5. Проникайте образцы сначала в 50% смолу в течение 30 минут, затем в 100% смолу в течение одного часа, а затем снова в 100% смолу на ночь. Выполняйте все инфильтрационные шаги с постоянным медленным встряхиванием.
    6. На следующий день поместите образцы в свежую 100% смолу на один час, а затем вставьте их между листами встраивания фторполимера. Обезжирьте куски встраиваемого листа этанолом и плоско вставьте образцы между двумя его слоями, используя два стеклянных слайда в качестве опоры. Старайтесь избегать пузырьков воздуха в смоле на образце или рядом с ней.
    7. Отверждайте образцы в духовке при 70 °C в течение не менее 48 часов.
  3. Обрезка и монтаж
    1. Отделите встраиваемые листы и вырежьте кусок внедренного образца (примерно 1 мм х 1 мм) лезвием бритвы. Перенесите его в парафильм. Это позволит свести к минимуму опасность потери образца из-за электростатики.
    2. Возьмите алюминиевый штифт, который был обезжирен этанолом. Смешайте проводящий эпоксидный колодец и используйте небольшое его количество, чтобы закрепить образец на штифте. Отверждаем проводящей эпоксидной смолой при 70 °C в течение 10 минут.
    3. Обрежьте каждую сторону блока образца алмазным ножом, а затем отполируйте лицевую часть блока до тех пор, пока ткань не подвергется воздействию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе подтвердите наличие интересующей области, собрав некоторые участки и выполнив окрашивание толуидином синим цветом16 или проверив под электронным микроскопом.
    4. Уменьшите размер выборки настолько, насколько это возможно. Затем измельчите образец до штифта проводящей краской и отверждите его (в течение 24 часов при комнатной температуре или в духовке при 65 °C в течение 40 минут).
    5. Чтобы свести к минимуму артефакты зарядки, напыляйте образцы тонким слоем золота или золота / палладия.

9. SbEM визуализация

  1. Поместите штифт с образцом в камеру серийного блочного сканирующего электронного микроскопа. Выровняте образец по ножу. Закройте камеру и задайте параметры.
  2. Соберите стопку изображений при желаемом увеличении, размере пикселя, толщине среза, ускоренном напряжении (EHT), диафрагме, давлении и т. Д.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры зависят от выборки и цели эксперимента. Примерные начальные настройки изображения включены в таблицу материалов.

10.3D реконструкции

ПРИМЕЧАНИЕ: Для шагов, упомянутых ниже, мы используем программное обеспечение открытого доступа, например, FijiJ17 (ImageJ версии 1.49b), Microscopy Image Browser (MIB)18 и Reconstruct19, но можно использовать различное другое программное обеспечение.

  1. Конвертируйте файлы цифровых микрографов (dm) в формат TIFF. Сначала импортируйте последовательность изображений (в FijiJ: файл > импорт > последовательность изображений > выберите 8-битный формат),а затем сохраните как TIFF (в FijiJ: файл > Сохранить как > последовательность изображений > выберите Tiff).
  2. Отрегулируйте яркость и контрастность стека изображений (в FijiJ: Image > Adjust > Brightness/Contrast)и, при необходимости, обшуйте его (используйте плагин DenoisEM для FijJ20: Плагины > DenoiseEM > Denoise).
  3. Выравнивание стека (в FijiJ: Плагины > StagReg или MIB: Набор данных > Инструменты выравнивания).
  4. Сегментные дендритные шипы и синапсы (в программном обеспечении MIB или Reconstruct доступны комплексные учебные пособия (см. Таблицу материалов для получения подробной информации).

Результаты

Используя описанный выше метод высокой контрастности, можно получить изображения ткани мозга мыши с хорошим разрешением. Большое поле зрения, обеспечиваемое техникой SBEM, облегчает точный выбор интересуемой области. Большое изображение области CA1 гиппокампа было сделано для измерения...

Обсуждение

Существует множество вариаций первичного метода NCMIR, описанного Диринком в 2010 году10. Основные принципы остаются прежними, но в зависимости от типа изучаемого материала вносятся незначительные изменения. Ранее было описано, что различные смолы могут быть использованы для ?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Визуализация SBEM, визуализация световой микроскопии и электронная микроскопия пробоподготовки были выполнены с использованием оборудования Лаборатории визуализации тканей и функций, которая служит основным оборудованием визуализации в Институте экспериментальной биологии Ненцки.

Для приготовления рисунка 1 использовали изображение мыши (Souris_02) и флакон с https://smart.servier.com/.

Эта работа была поддержана грантом Национального научного центра (Польша) Opus (UMO-2018/31/B/NZ4/01603), присужденным КР.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anesthetic:
Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin)Biowet Pulawy, Pulawy, Poland
Sodium pentobarbital (Morbital)Biowet Pulawy, Pulawy, Poland
Fixatives:
Glutaraldehyde (GA)Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USAG5882Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative
Hydrochloric acid (HCl)POCH, Gliwice, Poland575283115pure p.a.
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA441244prilled, 95%
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USAP4417-50TABtablets
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USAS5881reagent grade, figure-materials-104598%, pellets (anhydrous)
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USAS3264
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USAS3139
Perfusion:
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm)Fine Science Tools, Foster City, CA, USA14519-14
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8")Fine Science Tools, Foster City, CA, USA10091-12
Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle)KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, GermanyKD-FINE 9004131.80 x 40 mm
Pair of fine (Graefe) tweezersFine Science Tools, Foster City, CA, USA11050-10
Perfusion pumpLead FluidBQ80S
Plastic vialsProfilab, Warsaw, Poland534.02plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm
Straight iris scissors (~9 cm)Fine Science Tools, Foster City, CA, USA14058-11
Brain slices preparation for EM:
12-well plateNEST, Rahway, NJ, USA712001
Cyanoacrylic glueFenedur, Montevideo, Uruguay
Glass vialsElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA7263220 ml Scintillation Vial, a pack of 100
Pasteur pipetteVWR, Radnor, PA, USA612-4545LDPE, disposable, 7.5 ml
Razor bladeWilkinson Sword, London, UKClassic double edge safety razor blades
Scalpel bladeSwann-Morton, Sheffield, UKNo. 20
VibratomeLeica Microsystems, Vienna, AustriaLeica VT1000 S
Brain slices preparation for IF:
96-well plateNEST, Rahway, NJ, USA701101
CriostatLeica Microsystems, Vienna, AustriaLeica CM 1950
Ethylene glycolBioshop, Burlington, CanadaETH001
Low-profile disposable blade 819Leica Biosystems Inc., USA14035838925
Scalpel bladeSwann-Morton, Sheffield, UKNo. 20
Sodium azide (NaN3)POCH, Gliwice, Poland792770426
SucrosePOCH, Gliwice, Poland772090110
Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-CompoundLeica Biosystems, Switzerland14020108926
Immunostaining:
24-well plateNEST, Rahway, NJ, USA702001
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 AntibodyMerck-Millipore, Burlington, MA, USAMAB1598
Confocal microscopeZeiss, Göttingen, GermanyZeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm)
Cover slideMenzel Glaser, Braunschweig, GermanyB-123124 x 60 mm
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555Invitrogen, Carlsbad, CA, USAA31570
Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPIInvitrogen, Carlsbad, CA, USA00-4959-52
Microscope slideThermo Scientific, Waltham, MA, USAAGAA00008SuperFrost
Normal donkey serum (NDS)Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA017-000-121
ShakerJWElectronic, Warsaw, PolandKL-942
TritonT X-100 Reagent GradeBioshop, Burlington, CanadaTRX506
Electron microsocpy sample preparation
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydratePOCH, Gliwice, Poland746980113
Aclar 33C FilmElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA50425Fluoropolymer Film embedding sheet
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenolSigma-Aldrich,St. Louis, MI, USAT58203Epoxy embedding medium accelerator
Durcupan ACM single component A, MSigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA44611Durcupan ACM single component A, M epoxy resin
Durcupan ACM single component BSigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA44612Durcupan ACM single component B, hardener 964
Durcupan ACM single component DSigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA44614Durcupan ACM single component D , plasticizer
Ethyl alcohol absolutePOCH, Gliwice, Poland64-17-5Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC
Genlab laboratory ovenWolflabs, York, UKMino/18/SSOven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply
L-Aspartic acidSigma-Aldrich,St. Louis, MI, USAA-9256reagent grade, figure-materials-704498% (HPLC)
Lead (II) nitrateSigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA467790figure-materials-722199.95% trace metals basis
Osmium tetroxideSigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA75632for electron microscopy, 4% in H2O
pH meterElmetron, Zabrze, PolandCP-5-5
RotatorBioSan, Józefów, PolandMulti Bio RS-24rotator Multi Bio RS-24
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USAS5881reagent grade, figure-materials-778698%, pellets (anhydrous)
Sunflower mini shakerGrant bio, Shepreth,UKPD-3D
Syringe filterMillipore, Burlington, MA, USASLGP033NB0,22 µm pore size
ThiocarbohydrazideSigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA88535purum p.a., for electron microscopy, figure-materials-822899.0% (N)
Uranyl acetateServa, Heidelberg, Germany77870Uranyl acetate·2H2O, research grade
Water bathWSL, Swietochlowice, PolandLWT
Specimen mounting for SBEM
96-well culture plateVWR, Radnor, PA, USA734-278296-well plates, round bottom, non treated
AM Gatan 3View stub handling tweezersMicro to Nano, Haarlem, Netherlands
Netherlands		50-001521
BinocularOPTA-TECH, Warsaw, PolandX2000
Conductive glueChemtronics, Georgia, USACW2400conductive eopxy
Gatan 3View sample pin stubsMicro to Nano, Haarlem, Netherlands
Netherlands		10-006003
ParafilmSigma-Aldrich,St. Louis, MI, USAP7793roll size 20 in. × 50 ft
Pelco conductive silver paintTed Pella, Redding, CA, USA16062-15PELCO® Conductive Silver Paint, 15g
Razor blades double edgeElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA72000Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box.
Scanning Electron MicroscopeZeiss, Oberkochen, GermanySigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm
trim 90° diamond knifeDiatome Ltd., Nidau, SwitzerlandDTB90
UltramicrotomeLeica Microsystems, Vienna, AustriaLeica ultracutR
Softwarewebpagetutorials
FijiJhttps://fiji.sc/
Microscopy Image Browserhttp://mib.helsinki.fi/http://mib.helsinki.fi/tutorials.html
Reconstructhttps://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0)
Animals
MiceAdult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology.

Ссылки

  1. Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 383-388 (2012).
  2. Borczyk, M., Radwanska, K., Giese, K. P. The importance of ultrastructural analysis of memory. Brain Research Bulletin. 173, 28-36 (2021).
  3. Wanner, A. A., Kirschmann, M. A., Genoud, C. Challenges of microtome-based serial block-face scanning electron microscopy in neuroscience: challenges of SBEM in neuroscience. Journal of Microscopy. 259 (2), 137-142 (2015).
  4. Śliwińska, M. A., et al. Long-term Memory Upscales Volume of Postsynaptic Densities in the Process that Requires Autophosphorylation of αCaMKII. Cerebral Cortex. 30 (4), 2573-2585 (2020).
  5. Borczyk, M., Śliwińska, M. A., Caly, A., Bernas, T., Radwanska, K. Neuronal plasticity affects correlation between the size of dendritic spine and its postsynaptic density. Scientific Reports. 9 (1), 1693 (2019).
  6. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM - a technical note. Scanning Electron Microscopy. , 73-76 (1981).
  7. Denk, W., Horstmann, H. Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy to Reconstruct Three-Dimensional Tissue Nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  8. Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue and Cell. 57, 111-122 (2019).
  9. Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure: Volume scanning electron microscopy. Biology of the Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
  10. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. . NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , 6-8 (2010).
  11. Willingham, M. C., Rutherford, A. V. The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 455-460 (1984).
  12. Feng, G., et al. Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  13. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  14. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2004).
  15. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  16. Mercer, E. H. a scheme for section staining in electron microscopy. Journal of the Royal Microscopical Society. 81 (3-4), 179-186 (1963).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  18. Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy Image Browser: A Platform for Segmentation and Analysis of Multidimensional Datasets. PLOS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
  19. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218 (1), 52-61 (2005).
  20. Roels, J., et al. An interactive ImageJ plugin for semi-automated image denoising in electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 771 (2020).
  21. Radwanska, K., et al. Mechanism for long-term memory formation when synaptic strengthening is impaired. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18471-18475 (2011).
  22. Kittelmann, M., Hawes, C., Hughes, L. Serial block face scanning electron microscopy and the reconstruction of plant cell membrane systems: SBFSEM Methods for Plant Cells. Journal of Microscopy. 263 (2), 200-211 (2016).
  23. Fendrych, M., et al. Programmed Cell Death Controlled by ANAC033/SOMBRERO Determines Root Cap Organ Size in Arabidopsis. Current Biology. 24 (9), 931-940 (2014).
  24. Russell, M. R. G., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
  25. Płachno, B. J., Świątek, P., Jobson, R. W., Małota, K., Brutkowski, W. Serial block face SEM visualization of unusual plant nuclear tubular extensions in a carnivorous plant (Utricularia, Lentibulariaceae). Annals of Botany. 120 (5), 673-680 (2017).
  26. Genoud, C., Titze, B., Graff-Meyer, A., Friedrich, R. W. Fast Homogeneous En Bloc Staining of Large Tissue Samples for Volume Electron Microscopy. Frontiers in Neuroanatomy. 12, (2018).
  27. Puhka, M., Joensuu, M., Vihinen, H., Belevich, I., Jokitalo, E. Progressive sheet-to-tubule transformation is a general mechanism for endoplasmic reticulum partitioning in dividing mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 23 (13), 2424-2432 (2012).
  28. Gluenz, E., Wheeler, R. J., Hughes, L., Vaughan, S. Scanning and three-dimensional electron microscopy methods for the study of Trypanosoma brucei and Leishmania mexicana flagella. Methods in Cell Biology. 127, 509-542 (2015).
  29. Starborg, T., et al. Using transmission electron microscopy and 3View to determine collagen fibril size and three-dimensional organization. Nature Protocols. 8 (7), 1433-1448 (2013).
  30. Hughes, L., Borrett, S., Towers, K., Starborg, T., Vaughan, S. Patterns of organelle ontogeny through a cell cycle revealed by whole-cell reconstructions using 3D electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (3), 637-647 (2017).
  31. Bojko, A., et al. Improved Autophagic Flux in Escapers from Doxorubicin-Induced Senescence/Polyploidy of Breast Cancer Cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), 6084 (2020).
  32. Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature Protocols. 4 (8), 1145-1156 (2009).
  33. Glauert, A. M., Lewis, P. R. . Biological specimen preparation for transmission electron microscopy. , (2014).
  34. Genoud, C. Altered Synapse Formation in the Adult Somatosensory Cortex of Brain-Derived Neurotrophic Factor Heterozygote Mice. Journal of Neuroscience. 24 (10), 2394-2400 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

176

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены