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Method Article
シリアルブロックフェイススキャン電子顕微鏡(SBEM)は、マウス海馬の樹状脊椎を画像化し、分析するために適用されます。
3次元電子顕微鏡(3D EM)は、ナノスケールの分解能で樹状脊椎の形態学的パラメータを解析する可能性を与えます。また、脊椎の体積やシナプス後密度(PSD)(シナプス後のシナプス部分を表す)、シナプス前末端の存在、PSDの滑らかな内径レチラムまたは非定型形態(例えば、多innervat脊椎)の一部の特徴は、3D EMでのみ観察することができる。シリアルブロック面走査電子顕微鏡(SBEM)を採用することにより、従来のシリアル切り離しを行う場合よりも簡単かつ再現性の高い方法で3D EMデータを取得することが可能です。ここでは、SBEM分析のためにマウス海馬サンプルを調製する方法と、このプロトコルを樹状脊椎の免疫蛍光研究と組み合わせる方法を示す。軽度の固定灌流は、脳の半分に光顕微鏡による免疫蛍光試験を行い、残りの半分はSBEMのために準備された。このアプローチは、研究に使用される動物の数を減らします。
中枢神経系の興奮シナプスのほとんどは樹状脊椎に位置しています - 神経膜の小さな突起。これらの突起は、細胞内シグナル伝達を制御する限定された生化学的コンパートメントを形成する。樹状脊椎およびシナプスの構造的可塑性は、学習および記憶1、2のような重要なプロセスの根源となるシナプス有効性の機能的変化と密接に関連している。電子顕微鏡(EM)は、樹状脊椎にシナプス前入力があるかどうかを判断できる唯一の技術であることに注意することが重要です。EM解像度は、シナプス後の部分(PSD)、シナプス後の部分、樹状脊椎の寸法、軸索の大きさと形状などの超構造的な詳細を研究するためにも必要です。さらに、EMを使用すると、シナプスとその周辺を視覚化することが可能です。
イメージングおよびコンピューティング技術の進歩により、神経回路全体を再構築することが可能です。体積電子顕微鏡法は、例えば、シリアルセクション透過電子顕微鏡(ssTEM)、シリアルブロック面走査電子顕微鏡(SBEM)、および集光イオンビーム走査電子顕微鏡(FIB-SEM)などの神経回路再構成に一般的に用いられている。
我々の研究では、SBEM法は、マウス海馬および組織性脳スライス4,5のサンプルにおける樹状脊椎およびPSDの構造的可塑性を調査するためにうまく採用されている。SBEMは、走査型電子顕微鏡室6、7、8、9の中にミニチュアの超ミクロトームを設置することに基づいています。サンプルブロックの上部が画像化され、その後、サンプルがウルトラミクロトームによって指定された深さで切断され、新しいブロック面が明らかになります。その結果、切断されたスライスが破片として失われている間、ブロック面の画像のみが残されます。SBEMが破壊的な技術と呼ばれる理由は、同じ場所を再びイメージすることはできません。しかし、破壊的なオンブロック法の利点は、データ品質とデータ分析3に大きな影響を与える可能性のある歪み問題やセクション損失に苦しんでいないということです。さらに、SBEMは、比較的大きな視野(>0.5mm×0.5mm)を高解像度3で画像化する可能性を与える。
SBEMを採用するには、画像の取得に使用される反射電子検出器により、サンプルを専用の非常にコントラストの高いプロトコルに従って調製する必要があります。ここでは、1980年代8,11年に開発された還元オスミウムチオカルボヒドラジド(rOTO)染色を用いて、Deerinck10(国立顕微鏡・イメージング研究センター(NCMIR)法)が開発した手順に基づいて、プロトコルに従ってサンプル調製を行う方法を示す。また、軽顕微鏡とSBEMによる免疫蛍光研究に同じ脳を用いることができる軽度の固定灌流を用いて、2段階固定法を導入する。
プロトコルでは、マウスの脳は主に軽度の固定剤で固定され、次いで半分に切断され、一方の半球は後固定され、免疫蛍光(IF)のために準備され、もう1つはEM研究のために(図1)である。
図 1.SBEM を使用した解析のための樹状脊椎の準備のためのワークフローの概略表現。 マウスを屠殺し、軽度の一次固定剤を浸透させた。脳は半分に切断され、1つの半球は免疫蛍光(IF)専用の固定剤(IF)専用の固定剤で後固定され、凍結保護され、凍結スタットを使用してスライスされ、IF研究のために処理され、他の半球はEM固定剤で後付けされ、ビブラートでスライスされ、EM研究のために準備された。SBEM研究のための脳スライスは対照的であり、樹脂に平らに埋め込まれ、次いで海馬のCA1領域をピンに取り付け、SBEMで画像化した(図1)。黄色いボックスで強調表示されたプロトコルの一部は、ビデオで紹介されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
研究は、ネンキ研究所のガイドラインと地方倫理委員会の許可に従って行われました。研究は、1986年11月24日(86/609/EEC)の欧州共同体理事会指令、ポーランドの動物保護法に従って行われ、ワルシャワで最初の地方倫理委員会によって承認されました。すべての努力は、使用される動物の数とその苦しみを最小限に抑えるために行われました。
注意:以下に説明するすべての手順は、実験室のヒュームフードで行う必要があります。使用される試薬の危険な性質のため。手袋、ラボコート、安全メガネ、フェイスマスクなどの個人の安全対策が必要です。
1. 灌流用固定剤の調製 (2%wt/vol パラホルムアルデヒド (PFA) および 0.5% vol/vol グルタルアルデヒド (GA) 0.1 M リン酸バッファー (PB) pH 7.4)
注: 固定ソリューションは、使用日と同じ日に準備し、3 時間以上保存しないでください。時間不足の場合は、前日に0.1M PBで2%PFAを準備し、4°Cで保存し、灌流の直前に新鮮なGAを追加します。
SBEM(2%wt/vol PFAおよび0.1 M PBで2.5%の体積/体積GA、pH 7.4)のためのポストパーフュージョン固定剤の調製
3. IF染色用の過灌流後固定液の調製(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)におけるPFA 4%)
4. 動物の心筋灌流
注: PFA および GA の廃棄物はすべて、現地の規制に従って廃棄するために収集および保管する必要があります。麻酔と灌流は、現地の規則に従う必要があります。記載されたプロトコルでは、成人3ヶ月および20±1ヶ月齢の雌の雌のThy1-GFP(M)マウス(thy1-GFP +/-)12は、グルタマ作動性ニューロンのまばらな分布集団中で緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するが 、他の任意のいずれも使用することができる。動物は、実験生物学研究所の動物館でC57BL / 6Jの背景を持つヘテロ接合ゴットとして飼育されました。
5. 脳は電子顕微鏡の準備をスライスする
6. 免疫染色のための脳サンプル調製
7. 脳スライスの免疫染色
注:すべての染色手順は、プラットフォームシェーカー上の24ウェルプレートで行われました。
8. SBEM サンプル調製
注意:試薬の危険な性質のために使用し、以下に記載のすべての手順は、実験室のヒュームフードで行う必要があります。これらの化学物質を使用する前に、製造業者が提供する材料安全データシートを注意深く読み、安全管理および廃棄物処理を確実に行うため、現地の規則について安全担当者に依頼してください。
9. SBEMイメージング
10.3D再建
注:以下に記載されている手順については、例えばフィジーJ17(ImageJバージョン1.49b)、顕微鏡画像ブラウザ(MIB)18、再構築19などのオープンアクセスソフトウェアを使用しますが、他の様々なソフトウェアを使用することができます。
上述の高コントラスト法を用いて、マウス脳組織の良好な解像度画像が得られる。SBEM技術によって提供される大きな視野は関心領域の精密な選択を促進する。海馬のCA1領域の大きな画像を撮影し、ラジタム(SR)の長さを測定し、画像を中央に正確に設定した(図2B)。次に、画像のスタックを取得し、対象とするオブジェクト、例えば樹状突起?...
2010年10年にディアリンクによって記述された主要なNCMIR法の多くのバリエーションがあります。基本的な原理は変わりませんが、研究する材料の種類によっては、わずかな変更が実施されます。SBEM用の試料を埋め込むために異なる樹脂を使用することができること、例えば植物の場合、スパーは細胞壁22,23を通じてより良い浸潤を...
著者らは開示するものは何もない。
SBEMイメージング、光顕微鏡イメージング、電子顕微鏡サンプル調製は、Nencki実験生物学研究所のイメージングコア施設として機能するイメージング組織機能研究所の機器を使用して行われました。
図1の調製には、マウス(Souris_02)の画像、及び https://smart.servier.com/ からのバイアルを用いた。
この研究は、KRに授与された国立科学センター(ポーランド)グラントオープス(UMO-2018/31/B/NZ4/01603)によって支援されました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Anesthetic: | |||
Ketamine/xylazine mixture (Ketamina/Sedazin) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
Sodium pentobarbital (Morbital) | Biowet Pulawy, Pulawy, Poland | ||
Fixatives: | |||
Glutaraldehyde (GA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | G5882 | Grade I, 25% in H2O, specially purified for use as an electron microscopy fixative |
Hydrochloric acid (HCl) | POCH, Gliwice, Poland | 575283115 | pure p.a. |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 441244 | prilled, 95% |
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P4417-50TAB | tablets |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, ![]() |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3264 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S3139 | |
Perfusion: | |||
Large blunt/blunt curved scissors (~14.5 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14519-14 | |
Micro-spatula (double 2" flat ends, one rounded, one tapered to 1/8") | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 10091-12 | |
Needle tip, 15 GA, blunt (perfusion needle) | KD Medical GmbH Hospital Products, Berlin, Germany | KD-FINE 900413 | 1.80 x 40 mm |
Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 11050-10 | |
Perfusion pump | Lead Fluid | BQ80S | |
Plastic vials | Profilab, Warsaw, Poland | 534.02 | plastic vials with blue cap for tissue storage, 20 ml, 31 x 48 mm |
Straight iris scissors (~9 cm) | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | 14058-11 | |
Brain slices preparation for EM: | |||
12-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 712001 | |
Cyanoacrylic glue | Fenedur, Montevideo, Uruguay | ||
Glass vials | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72632 | 20 ml Scintillation Vial, a pack of 100 |
Pasteur pipette | VWR, Radnor, PA, USA | 612-4545 | LDPE, disposable, 7.5 ml |
Razor blade | Wilkinson Sword, London, UK | Classic double edge safety razor blades | |
Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
Vibratome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica VT1000 S | |
Brain slices preparation for IF: | |||
96-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 701101 | |
Criostat | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica CM 1950 | |
Ethylene glycol | Bioshop, Burlington, Canada | ETH001 | |
Low-profile disposable blade 819 | Leica Biosystems Inc., USA | 14035838925 | |
Scalpel blade | Swann-Morton, Sheffield, UK | No. 20 | |
Sodium azide (NaN3) | POCH, Gliwice, Poland | 792770426 | |
Sucrose | POCH, Gliwice, Poland | 772090110 | |
Tissue freezing medium for cryosectioning, OCT-Compound | Leica Biosystems, Switzerland | 14020108926 | |
Immunostaining: | |||
24-well plate | NEST, Rahway, NJ, USA | 702001 | |
Anti-Post Synaptic Density Protein 95 Antibody | Merck-Millipore, Burlington, MA, USA | MAB1598 | |
Confocal microscope | Zeiss, Göttingen, Germany | Zeiss Spinning Disc microscope (63 × oil objective, NA 1.4, pixel size 0.13 µm × 0.13 µm) | |
Cover slide | Menzel Glaser, Braunschweig, Germany | B-1231 | 24 x 60 mm |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | A31570 | |
Fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | 00-4959-52 | |
Microscope slide | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | AGAA00008 | SuperFrost |
Normal donkey serum (NDS) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
Shaker | JWElectronic, Warsaw, Poland | KL-942 | |
TritonT X-100 Reagent Grade | Bioshop, Burlington, Canada | TRX506 | |
Electron microsocpy sample preparation | |||
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | POCH, Gliwice, Poland | 746980113 | |
Aclar 33C Film | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 50425 | Fluoropolymer Film embedding sheet |
DMP-30, 2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | T58203 | Epoxy embedding medium accelerator |
Durcupan ACM single component A, M | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44611 | Durcupan ACM single component A, M epoxy resin |
Durcupan ACM single component B | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44612 | Durcupan ACM single component B, hardener 964 |
Durcupan ACM single component D | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 44614 | Durcupan ACM single component D , plasticizer |
Ethyl alcohol absolute | POCH, Gliwice, Poland | 64-17-5 | Ethyl alcohol absolute 99.8 % pure P.A.-BASIC |
Genlab laboratory oven | Wolflabs, York, UK | Mino/18/SS | Oven Genlab MINO/18/SS 18l volume, no fan circulation, no digital display, standard temperature gradient, standard recovery rate, no timer, 250°C maximum temperature, 240V electrical supply |
L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | A-9256 | reagent grade, ![]() |
Lead (II) nitrate | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 467790 | ![]() |
Osmium tetroxide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 75632 | for electron microscopy, 4% in H2O |
pH meter | Elmetron, Zabrze, Poland | CP-5-5 | |
Rotator | BioSan, Józefów, Poland | Multi Bio RS-24 | rotator Multi Bio RS-24 |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | S5881 | reagent grade, ![]() |
Sunflower mini shaker | Grant bio, Shepreth,UK | PD-3D | |
Syringe filter | Millipore, Burlington, MA, USA | SLGP033NB | 0,22 µm pore size |
Thiocarbohydrazide | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | 88535 | purum p.a., for electron microscopy, ![]() |
Uranyl acetate | Serva, Heidelberg, Germany | 77870 | Uranyl acetate·2H2O, research grade |
Water bath | WSL, Swietochlowice, Poland | LWT | |
Specimen mounting for SBEM | |||
96-well culture plate | VWR, Radnor, PA, USA | 734-2782 | 96-well plates, round bottom, non treated |
AM Gatan 3View stub handling tweezers | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands | 50-001521 | |
Binocular | OPTA-TECH, Warsaw, Poland | X2000 | |
Conductive glue | Chemtronics, Georgia, USA | CW2400 | conductive eopxy |
Gatan 3View sample pin stubs | Micro to Nano, Haarlem, Netherlands Netherlands | 10-006003 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich,St. Louis, MI, USA | P7793 | roll size 20 in. × 50 ft |
Pelco conductive silver paint | Ted Pella, Redding, CA, USA | 16062-15 | PELCO® Conductive Silver Paint, 15g |
Razor blades double edge | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 72000 | Stainless Steel "PTFE" coated. PERSONNA brand .004" thick, wrapped individually, 250 blades in a box. |
Scanning Electron Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | Sigma VP with Gatan 3View2 chamber, acceleration voltage 2.5 kV, variable pressure 5 Pa, aperture 20 µm, dwell time 6 µs, slice thickness 60 nm, magnification 15 000 x, image resolution 2048 x 2048 pixels, pixel size 7.3 nm | |
trim 90° diamond knife | Diatome Ltd., Nidau, Switzerland | DTB90 | |
Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria | Leica ultracutR | |
Software | webpage | tutorials | |
FijiJ | https://fiji.sc/ | ||
Microscopy Image Browser | http://mib.helsinki.fi/ | http://mib.helsinki.fi/tutorials.html | |
Reconstruct | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0 | https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) | |
Animals | |||
Mice | Adult 3-month old and 20±1 month old female Thy1-GFP(M) mice (Thy1-GFP +/-) (Feng et al.,2000) which express GFP in a sparsely distributed population of glutamatergic neurons. Animals were bred as heterozygotes with the C57BL/6J background in the Animal House of the Nencki Institute of Experimental Biology. |
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