Método de bioimpresión de alto rendimiento para modelar la permeabilidad vascular en placas estándar de seis pocillos con flexibilidad de tamaño y patrón

Resumen

Presentamos un protocolo para la producción de alto rendimiento de canales vasculares con tamaños flexibles y patrones deseados en una placa estándar de seis pocillos utilizando tecnología de bioimpresión 3D, conocida como vasos en una placa (VOP). Esta plataforma tiene el potencial de avanzar en el desarrollo de terapias para los trastornos asociados con el endotelio comprometido.

Resumen

La permeabilidad vascular es un factor clave en el desarrollo de terapias para los trastornos asociados con el endotelio comprometido, como la disfunción endotelial en las arterias coronarias y el deterioro de la función de la barrera hematoencefálica. Las técnicas de fabricación existentes no replican adecuadamente la variación geométrica de las redes vasculares en el cuerpo humano, lo que influye sustancialmente en la progresión de la enfermedad; Además, estas técnicas a menudo implican procedimientos de fabricación de varios pasos que dificultan la producción de alto rendimiento necesaria para las pruebas farmacológicas. Este artículo presenta un protocolo de bioimpresión para crear múltiples tejidos vasculares con los patrones y tamaños deseados directamente en placas estándar de seis pocillos, superando los desafíos existentes de resolución y productividad en la tecnología de bioimpresión. Se estableció un enfoque de fabricación simplificado para construir seis canales huecos y perfusibles dentro de un hidrogel, que posteriormente se recubrieron con células endoteliales de la vena umbilical humana para formar un endotelio funcional y maduro. La naturaleza controlada por ordenador de la bioimpresión 3D garantiza una alta reproducibilidad y requiere menos pasos de fabricación manual que los métodos tradicionales. Esto pone de manifiesto el potencial de VOP como plataforma eficiente y de alto rendimiento para modelar la permeabilidad vascular y avanzar en el descubrimiento de fármacos.

Introducción

La red vascular en todo el cuerpo humano funciona como una barrera de transporte crucial al regular dinámicamente el intercambio de moléculas y células entre la sangre y los tejidos circundantes. Esta regulación es esencial para prevenir el edema tisular y permitir el intercambio selectivo de nutrientes y células, apoyando así el metabolismo y la homeostasis de los tejidos¹. La alteración de la permeabilidad endotelial, un factor en muchas condiciones de salud, afecta tanto a la gravedad de la enfermedad como a la eficacia del tratamiento². El endotelio vascular actúa como una barrera se....

Protocolo

1. Generación de código G para la bioimpresora

1. Para generar y visualizar la ruta de impresión, visite una herramienta de simulación de código G en línea (por ejemplo, NCviewer).
2. Haga clic en el icono Nuevo archivo en la interfaz para crear un nuevo archivo de código G.
3. Genere una ruta de impresión escribiendo manualmente los comandos de código G para el canal de sacrificio y la cámara de silicio. Utilice las dimensiones de una placa estándar de seis pocillos como referencia para crear la geometría.
   NOTA: El código G utilizado aquí se basa en el código de control numéri....

Resultados

La plataforma VOP, con flexibilidad de tamaño y patrón, se fabricó con un sistema de bioimpresión de múltiples cabezales. Los canales, tanto huecos como con capacidad de perfusión, se sembraron con HUVEC para facilitar la endotelización y posteriormente se evaluaron con un ensayo de permeabilidad (Figura 1A). Para demostrar la capacidad de fabricación multiescala de este método, imprimimos tres configuraciones distintas: recta, bifurcada y enrevesad.......

Discusión

Aprovechando la precisión, la automatización y la naturaleza controlada por computadora de la tecnología de bioimpresión 3D, establecimos un método simplificado para fabricar canales vasculares en placas estándar de seis pocillos, que se eligieron por su compatibilidad con lectores de microplacas comerciales y configuraciones de imágenes de microscopio. El diseño de la placa puede acomodar canales de varios tamaños y un volumen suficiente de medios para el crecimiento de canales.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Serological Pipette	SPL	SPL 91010
10 mL syringe	Shinchang Medical
15 mL conical tube	SPL	50015
3D Bioprinter	T&R Biofab	3DX-Printer
6-well plate	SPL	37206
Biological Safety Cabinets	CHC LAB	PCHC-777A2-04,
Brightfield Inverted Microscopes	Leica	DMi1
Cell Counting Kit (CCK8)	GlpBio	GK10001
Cell Counting Kit (CCK8)	GlpBio	GK10001
Cell Culture Flask 75T	SPL	70075
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL	Corning	354230
Distilled water
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO, Cell Culture Grade	Sigma aldrich	D2438
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a Kit	DOW	DC-184
DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1.1 KG Kit	DOW	2924404
D-PBS - 1x	Welgene	LB001-01
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 (Ready to use)	Promocell	C-22022
Eppendorf Micro pipette(1000,200,100,20,10)	eppendorf
Ethyl Alcohol 99.9%	Duksan	D5
Excel	Microsoft
Fibrinogen from bovine plasma	Sigma Aldrich	F8630-1G
FITC Dextran 70 kDa	Sigma Aldrich	46945-100MG-F
Fluorescent beads (1.0 μm, green)	Sigma Aldrich	L1030-1ML
GelMA-powder (Gelatin methacrylate) 50 g	3D Materials	20JT29
Gibco, Recovery Cell Culture Freezing Medium, 50 mL	Gibco
HUVECs (Human Umbillical Vein Endothelial Cells)	Promocell
ImageJ software	NIH
Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Forma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubator
Invitrogen, Live/dead viability/cytotoxicity Kit (for mammalian cells)	Thermo Fisher	L3224
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphate powder	Tokoyo Chemical Industry CO.	85073-19-4
Marienfeld Superior, Counting chamber cover	Marienfeld Superior
Marienfeld Superior, Hemocytometer, cell counting chamber	Marienfeld Superior	HSU-0650030
Microcentrifuge	eppendorf	Centrifuge 5920 R
NCViewer.com
Nitrogen tank	WORTHINGTON INDUSTRIES	LS750
Omnicure UV Laser	EXCELITAS	SERIES 1500
Parafilm M	amcor	PM-996
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010
Planetary Mixer	THINKY CORPORATION, japan	ARE-310
Plasma treatment machine	FEMTO SCIENCE	CUTE-1MPR
Pluronic F-127	Sigma aldrich	P2443-250G
Pre-made buffer, (P2007-1) 10x PBS	Biosesang	PR4007-100-00
Reagent storage cabinet	ZIO FILTER TECH	SC2-30F-1306D1-BC
Real time Live cell Imaging Microscope	Carl ZEISS
Refrigerator	SAMSUNG	RT50K6035SL
ROCKER 2D digital	IKA	4003000
Scoop-Spatula	CacheBy	SL-SCO7001-EA
sigma,Trypsin-EDTA solition, 0.25%	Sigma aldrich	T4049-100ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Thermo Fisher scientific	151-21-3
Syringe Barrel Tip Cap	FISNAR	3051806
Tally counter	Control Company	C23-147-050
Tapered Nozzle (18 G)	Mushashi	TPND-18G-U
Tapered Nozzle (22 G)	Mushashi	TPND-22G-U
Tapered nozzle 20 G	Musashi	TPND-20G-U
Thrombin from bovine plasma	Sigma Aldrich	T7326-1KU
Timer, 4-channel	ETL	SL.Tim3005
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15250061
Trypsin Neutralizing Solution	Promocell	C-41120
UG 24 mL UG ointment jar	Yamayu	No. 3-53
UG 58 mL UG ointment jar	Yamayu	No. 3-55
Water Bath	DAIHAN Scientific	WB-11
Weight machine	Sartorius	bce2241-1skr