Metodo di bioprinting ad alta produttività per la modellazione della permeabilità vascolare in piastre standard a sei pozzetti con flessibilità di dimensioni e modelli

Riepilogo

Presentiamo un protocollo per la produzione ad alta produttività di canali vascolari con dimensioni flessibili e modelli desiderati su una piastra standard a sei pozzetti utilizzando la tecnologia di bioprinting 3D, denominata vessels-on-a-plate (VOP). Questa piattaforma ha il potenziale per far progredire lo sviluppo di terapie per i disturbi associati all'endotelio compromesso.

Abstract

La permeabilità vascolare è un fattore chiave nello sviluppo di terapie per i disturbi associati alla compromissione dell'endotelio, come la disfunzione endoteliale nelle arterie coronarie e la compromissione della funzione della barriera emato-encefalica. Le tecniche di fabbricazione esistenti non replicano adeguatamente la variazione geometrica delle reti vascolari nel corpo umano, che influenza sostanzialmente la progressione della malattia; Inoltre, queste tecniche spesso comportano procedure di fabbricazione in più fasi che ostacolano la produzione ad alto rendimento necessaria per i test farmacologici. Questo articolo presenta un protocollo di bioprinting per la creazione di più tessuti vascolari con i modelli e le dimensioni desiderate direttamente su piastre standard a sei pozzetti, superando le sfide esistenti in termini di risoluzione e produttività nella tecnologia di bioprinting. È stato stabilito un approccio di fabbricazione semplificato per costruire sei canali cavi e perfusibili all'interno di un idrogel, che sono stati successivamente rivestiti con cellule endoteliali della vena ombelicale umana per formare un endotelio funzionale e maturo. La natura controllata dal computer della biostampa 3D garantisce un'elevata riproducibilità e richiede meno passaggi di fabbricazione manuale rispetto ai metodi tradizionali. Ciò evidenzia il potenziale di VOP come piattaforma efficiente ad alto rendimento per la modellazione della permeabilità vascolare e l'avanzamento della scoperta di farmaci.

Introduzione

La rete vascolare in tutto il corpo umano funziona come una barriera di trasporto cruciale regolando dinamicamente lo scambio di molecole e cellule tra il sangue e i tessuti circostanti. Questa regolazione è essenziale per prevenire l'edema tissutale e consentire lo scambio selettivo di nutrienti e cellule, supportando così il metabolismo tissutale e l'omeostasi¹. L'alterata permeabilità endoteliale, un fattore in molte condizioni di salute, influisce sia sulla gravità della malattia che sull'efficacia del trattamento². L'endotelio vascolare funge da barriera selettiva, facilitando il tr....

Protocollo

1. Generazione del G-code per il bioprinter

1. Per generare e visualizzare il percorso di stampa, visitare uno strumento di simulazione G-code online (ad esempio, NCviewer).
2. Fare clic sull'icona Nuovo file sull'interfaccia per creare un nuovo file G-code.
3. Genera un percorso di stampa scrivendo manualmente i comandi G-code per il canale sacrificale e la camera di silicio. Utilizzate le quote di una piastra standard a sei pozzetti come riferimento per la creazione della geometria.
   NOTA: Il codice G utilizzato qui si basa sul codice CNC (Computer Numerical Control). Le funzi....

Discussione

Sfruttando la precisione, l'automazione e la natura controllata da computer della tecnologia di bioprinting 3D, abbiamo stabilito un metodo semplificato per la fabbricazione di canali vascolari in piastre standard a sei pozzetti, che sono state scelte per la loro compatibilità con i lettori di micropiastre commerciali e le configurazioni di imaging per microscopi. Il design della piastra può ospitare canali di più dimensioni e un volume sufficiente di fluidi per la crescita di canali .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Serological Pipette	SPL	SPL 91010
10 mL syringe	Shinchang Medical
15 mL conical tube	SPL	50015
3D Bioprinter	T&R Biofab	3DX-Printer
6-well plate	SPL	37206
Biological Safety Cabinets	CHC LAB	PCHC-777A2-04,
Brightfield Inverted Microscopes	Leica	DMi1
Cell Counting Kit (CCK8)	GlpBio	GK10001
Cell Counting Kit (CCK8)	GlpBio	GK10001
Cell Culture Flask 75T	SPL	70075
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL	Corning	354230
Distilled water
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO, Cell Culture Grade	Sigma aldrich	D2438
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a Kit	DOW	DC-184
DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1.1 KG Kit	DOW	2924404
D-PBS - 1x	Welgene	LB001-01
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 (Ready to use)	Promocell	C-22022
Eppendorf Micro pipette(1000,200,100,20,10)	eppendorf
Ethyl Alcohol 99.9%	Duksan	D5
Excel	Microsoft
Fibrinogen from bovine plasma	Sigma Aldrich	F8630-1G
FITC Dextran 70 kDa	Sigma Aldrich	46945-100MG-F
Fluorescent beads (1.0 μm, green)	Sigma Aldrich	L1030-1ML
GelMA-powder (Gelatin methacrylate) 50 g	3D Materials	20JT29
Gibco, Recovery Cell Culture Freezing Medium, 50 mL	Gibco
HUVECs (Human Umbillical Vein Endothelial Cells)	Promocell
ImageJ software	NIH
Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Forma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubator
Invitrogen, Live/dead viability/cytotoxicity Kit (for mammalian cells)	Thermo Fisher	L3224
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphate powder	Tokoyo Chemical Industry CO.	85073-19-4
Marienfeld Superior, Counting chamber cover	Marienfeld Superior
Marienfeld Superior, Hemocytometer, cell counting chamber	Marienfeld Superior	HSU-0650030
Microcentrifuge	eppendorf	Centrifuge 5920 R
NCViewer.com
Nitrogen tank	WORTHINGTON INDUSTRIES	LS750
Omnicure UV Laser	EXCELITAS	SERIES 1500
Parafilm M	amcor	PM-996
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010
Planetary Mixer	THINKY CORPORATION, japan	ARE-310
Plasma treatment machine	FEMTO SCIENCE	CUTE-1MPR
Pluronic F-127	Sigma aldrich	P2443-250G
Pre-made buffer, (P2007-1) 10x PBS	Biosesang	PR4007-100-00
Reagent storage cabinet	ZIO FILTER TECH	SC2-30F-1306D1-BC
Real time Live cell Imaging Microscope	Carl ZEISS
Refrigerator	SAMSUNG	RT50K6035SL
ROCKER 2D digital	IKA	4003000
Scoop-Spatula	CacheBy	SL-SCO7001-EA
sigma,Trypsin-EDTA solition, 0.25%	Sigma aldrich	T4049-100ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Thermo Fisher scientific	151-21-3
Syringe Barrel Tip Cap	FISNAR	3051806
Tally counter	Control Company	C23-147-050
Tapered Nozzle (18 G)	Mushashi	TPND-18G-U
Tapered Nozzle (22 G)	Mushashi	TPND-22G-U
Tapered nozzle 20 G	Musashi	TPND-20G-U
Thrombin from bovine plasma	Sigma Aldrich	T7326-1KU
Timer, 4-channel	ETL	SL.Tim3005
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15250061
Trypsin Neutralizing Solution	Promocell	C-41120
UG 24 mL UG ointment jar	Yamayu	No. 3-53
UG 58 mL UG ointment jar	Yamayu	No. 3-55
Water Bath	DAIHAN Scientific	WB-11
Weight machine	Sartorius	bce2241-1skr