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크기 및 패턴 유연성을 갖춘 표준 six-well plates의 혈관 투과성을 모델링하기 위한 High-throughput Bioprinting 방법
요약
당사는 VOP(vessels-on-a-plate)라고 하는 3D 바이오프린팅 기술을 사용하여 표준 6웰 플레이트에서 유연한 크기와 원하는 패턴을 가진 혈관 채널의 고처리량 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 플랫폼은 손상된 내피와 관련된 질환에 대한 치료법 개발을 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
초록
혈관 투과성은 관상 동맥의 내피 기능 장애 및 혈액-뇌 장벽의 기능 손상과 같은 손상된 내피와 관련된 질환에 대한 치료법을 개발하는 데 중요한 요소입니다. 기존의 제조 기술은 질병 진행에 상당한 영향을 미치는 인체 혈관 네트워크의 기하학적 변화를 적절하게 복제하지 못합니다. 더욱이, 이러한 기술에는 종종 약리학적 검사에 필요한 고처리량 생산을 방해하는 다단계 제조 절차가 포함됩니다. 이 논문은 표준 6웰 플레이트에서 원하는 패턴과 크기의 여러 혈관 조직을 직접 생성하여 바이오프린팅 기술의 기존 해상도 및 생산성 문제를 극복하기 위한 바이오프린팅 프로토콜을 제시합니다. 하이드로겔 내에 6개의 속이 빈 관류 가능한 채널을 구성하기 위해 단순화된 제조 접근 방식이 확립되었으며, 이후 인간 제대 정맥 내피 세포로 라이닝되어 기능적이고 성숙한 내피를 형성했습니다. 3D 바이오프린팅의 컴퓨터 제어 특성은 높은 재현성을 보장하고 기존 방법보다 더 적은 수동 제작 단계를 필요로 합니다. 이는 혈관 투과성을 모델링하고 약물 발견을 발전시키기 위한 효율적인 고처리량 플랫폼으로서의 VOP의 잠재력을 강조합니다.
서문
인체 전체의 혈관 네트워크는 혈액과 주변 조직 사이의 분자와 세포 교환을 동적으로 조절함으로써 중요한 수송 장벽으로 기능합니다. 이 조절은 조직 부종을 예방하고 선택적 영양소 및 세포 교환을 가능하게 하여 조직 대사와 항상성을 지원하는 데 필수적입니다1. 많은 건강 상태의 요인인 내피 투과성의 변화는 질병의 중증도와 치료 효능 모두에 영향을 미친다2. 혈관 내피는 선택적 장벽으로 작용하여 혈관, 조직 및 장기 간의 전달을 용이하게 합니다. 이 조절은 용질과 소분자의 기본 여과, 혈관 장벽의 의도적 파괴, 프로스타글란딘 및 성장 인자와 같은 분자가 투과성 수준에 미치는 영향과 같은 여러 메커니즘을 포함한다3.
이 조절의 핵심 요소에는 내피 세포 접합부, 백혈구의 이동, 혈액-뇌 장벽의 기능이 포함된다4. 그 복잡성을 감안할 때, 이 과정은 다양한 혈관 유형을 포함하고 고유한 해부학적 경로를 활용하면서 환경에 따라 다릅니다. 혈관 투과성의 생물학적 토대를 이해하는 것은 비정상적인 혈관 투과성과 관련된 상태를 치료하기 ....
프로토콜
1. 바이오프린터용 G-code 생성
- 인쇄 경로를 생성하고 시각화하려면 온라인 G 코드 시뮬레이션 도구(예: NCviewer)를 방문하십시오.
- 인터페이스에서 새 파일 아이콘을 클릭하여 새 G 코드 파일을 만듭니다.
- 희생 채널과 실리콘 챔버에 대한 G 코드 명령을 수동으로 작성하여 인쇄 경로를 생성합니다. 표준 6웰 플레이트의 치수를 형상을 생성하기 위한 참조로 사용합니다.
참고: 여기에 사용된 G 코드는 CNC(Computer Numerical Control) 코드를 기반으로 합니다. 각 명령의 기능은 보충 표 S1에 제공되어 있습니다. 6웰 플레이트 형식은 상용 마이크로플레이트 리더 및 현미경 설정과의 호환성과 내피 성숙을 지원하기 위해 적절한 양의 배지를 수용할 수 있는 능력 때문에 선택되었으며, 이를 통해 빈번한 배지 교체의 필요성을 최소화했습니다. 이 제작 프로토콜은 다른 표준 웰 플레이트와 함께 사용하도록 조정할 수도 있습니다. - G 코드가 완료되면 파일 저장 인터페이스에서 아이콘을 클릭하여 확장자가 .nc인 파일을 다운로드합니다....
대표적 결과
크기와 패턴의 유연성을 특징으로 하는 VOP 플랫폼은 다중 헤드 바이오프린팅 시스템으로 제작되었습니다. 속이 비어 있고 관류가 가능한 채널은 내피화를 용이하게 하기 위해 HUVEC로 파종된 후 투과성 분석으로 평가되었습니다(그림 1A). 이 방법의 멀티스케일 제조 능력을 입증하기 위해 우리는 직선, 분기, 나선의 세 가지 뚜렷한 구성을 인쇄했습니.......
토론
3D 바이오프린팅 기술의 정밀성, 자동화 및 컴퓨터 제어 특성을 활용하여 당사는 상용 마이크로플레이트 리더 및 현미경 이미징 설정과의 호환성을 위해 선택된 표준 6웰 플레이트에서 혈관 채널을 제조하기 위한 간소화된 방법을 확립했습니다. 플레이트의 설계는 다중 크기 채널과 더 큰 채널의 성장을 위한 충분한 양의 미디어를 수용할 수 있는 동시에 필요한 미디어 ?.......
공개
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.
감사의 말
이 연구는 한국연구재단(National Research Foundation of Korea, NRF)의 지원으로 이루어졌으며, 한국 정부(과학기술정보통신부, 과학기술정보통신부)의 지원을 받았다. NRF-2019R1C1C1009606; 번호 2020R1A5A8018367; 그리고 아니오. RS-2024-00423107)을 참조하십시오. 이 연구는 과학기술정보통신부(MSIT)가 후원하는 NRF 보조금의 바이오 및 의료 기술 개발 프로그램(Bio and Medical Technology Development Program)의 지원을 받았다. NRF-2022M3A9E4017151 및 No. NRF-2022M3A9E4082654]입니다. 이 연구는 산업통상자원부(산업통상자원부)가 후원하는 기술혁신프로그램(Technology Innovation Program)[제20015148호]과 연금술사프로젝트(Alchemist Project)[제20012378호]의 지원을 받았다. 이 연구는 또한 한국식품농업농림계획평가원(IPET)의 지원을 받아 농림축산식품부(MAFRA)의 지원을 받아 연구인력 개발을 위한 농업식품융합기술사업(Agriculture and Food Convergence Technologies Program for Research Manp....
자료
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL Serological Pipette | SPL | SPL 91010 | |
| 10 mL syringe | Shinchang Medical | ||
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3D Bioprinter | T&R Biofab | 3DX-Printer | |
| 6-well plate | SPL | 37206 | |
| Biological Safety Cabinets | CHC LAB | PCHC-777A2-04, | |
| Brightfield Inverted Microscopes | Leica | DMi1 | |
| Cell Counting Kit (CCK8) | GlpBio | GK10001 | |
| Cell Counting Kit (CCK8) | GlpBio | GK10001 | |
| Cell Culture Flask 75T | SPL | 70075 | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL | Corning | 354230 | |
| Distilled water | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO, Cell Culture Grade | Sigma aldrich | D2438 | |
| Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a Kit | DOW | DC-184 | |
| DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1.1 KG Kit | DOW | 2924404 | |
| D-PBS - 1x | Welgene | LB001-01 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 (Ready to use) | Promocell | C-22022 | |
| Eppendorf Micro pipette(1000,200,100,20,10) | eppendorf | ||
| Ethyl Alcohol 99.9% | Duksan | D5 | |
| Excel | Microsoft | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma Aldrich | F8630-1G | |
| FITC Dextran 70 kDa | Sigma Aldrich | 46945-100MG-F | |
| Fluorescent beads (1.0 μm, green) | Sigma Aldrich | L1030-1ML | |
| GelMA-powder (Gelatin methacrylate) 50 g | 3D Materials | 20JT29 | |
| Gibco, Recovery Cell Culture Freezing Medium, 50 mL | Gibco | ||
| HUVECs (Human Umbillical Vein Endothelial Cells) | Promocell | ||
| ImageJ software | NIH | ||
| Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Forma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubator | |
| Invitrogen, Live/dead viability/cytotoxicity Kit (for mammalian cells) | Thermo Fisher | L3224 | |
| Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphate powder | Tokoyo Chemical Industry CO. | 85073-19-4 | |
| Marienfeld Superior, Counting chamber cover | Marienfeld Superior | ||
| Marienfeld Superior, Hemocytometer, cell counting chamber | Marienfeld Superior | HSU-0650030 | |
| Microcentrifuge | eppendorf | Centrifuge 5920 R | |
| NCViewer.com | |||
| Nitrogen tank | WORTHINGTON INDUSTRIES | LS750 | |
| Omnicure UV Laser | EXCELITAS | SERIES 1500 | |
| Parafilm M | amcor | PM-996 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | |
| Planetary Mixer | THINKY CORPORATION, japan | ARE-310 | |
| Plasma treatment machine | FEMTO SCIENCE | CUTE-1MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma aldrich | P2443-250G | |
| Pre-made buffer, (P2007-1) 10x PBS | Biosesang | PR4007-100-00 | |
| Reagent storage cabinet | ZIO FILTER TECH | SC2-30F-1306D1-BC | |
| Real time Live cell Imaging Microscope | Carl ZEISS | ||
| Refrigerator | SAMSUNG | RT50K6035SL | |
| ROCKER 2D digital | IKA | 4003000 | |
| Scoop-Spatula | CacheBy | SL-SCO7001-EA | |
| sigma,Trypsin-EDTA solition, 0.25% | Sigma aldrich | T4049-100ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Thermo Fisher scientific | 151-21-3 | |
| Syringe Barrel Tip Cap | FISNAR | 3051806 | |
| Tally counter | Control Company | C23-147-050 | |
| Tapered Nozzle (18 G) | Mushashi | TPND-18G-U | |
| Tapered Nozzle (22 G) | Mushashi | TPND-22G-U | |
| Tapered nozzle 20 G | Musashi | TPND-20G-U | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma Aldrich | T7326-1KU | |
| Timer, 4-channel | ETL | SL.Tim3005 | |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Promocell | C-41120 | |
| UG 24 mL UG ointment jar | Yamayu | No. 3-53 | |
| UG 58 mL UG ointment jar | Yamayu | No. 3-55 | |
| Water Bath | DAIHAN Scientific | WB-11 | |
| Weight machine | Sartorius | bce2241-1skr |
참고문헌
- O'Connor, C., Brady, E., Zheng, Y., Moore, E., Stevens, K. R. Engineering the multiscale complexity of vascular networks. Nat Rev Mater. 7 (9), 702-716 (2022).
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Per....
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