Método de bioimpressão de alto rendimento para modelagem da permeabilidade vascular em placas padrão de seis poços com flexibilidade de tamanho e padrão

Resumo

Apresentamos um protocolo para produção de alto rendimento de canais vasculares com tamanhos flexíveis e padrões desejados em uma placa padrão de seis poços usando a tecnologia de bioimpressão 3D, conhecida como vasos em uma placa (VOP). Esta plataforma tem o potencial de avançar no desenvolvimento de terapêuticas para os distúrbios associados ao endotélio comprometido.

Resumo

A permeabilidade vascular é um fator chave no desenvolvimento de terapias para distúrbios associados ao endotélio comprometido, como disfunção endotelial nas artérias coronárias e função prejudicada da barreira hematoencefálica. As técnicas de fabricação existentes não replicam adequadamente a variação geométrica nas redes vasculares do corpo humano, o que influencia substancialmente a progressão da doença; Além disso, essas técnicas geralmente envolvem procedimentos de fabricação em várias etapas que dificultam a produção de alto rendimento necessária para testes farmacológicos. Este artigo apresenta um protocolo de bioimpressão para a criação de múltiplos tecidos vasculares com padrões e tamanhos desejados diretamente em placas padrão de seis poços, superando os desafios existentes de resolução e produtividade na tecnologia de bioimpressão. Uma abordagem de fabricação simplificada foi estabelecida para construir seis canais ocos e perfusíveis dentro de um hidrogel, que foram posteriormente revestidos com células endoteliais da veia umbilical humana para formar um endotélio funcional e maduro. A natureza controlada por computador da bioimpressão 3D garante alta reprodutibilidade e requer menos etapas de fabricação manual do que os métodos tradicionais. Isso destaca o potencial do VOP como uma plataforma eficiente de alto rendimento para modelar a permeabilidade vascular e avançar na descoberta de medicamentos.

Introdução

A rede vascular em todo o corpo humano funciona como uma barreira de transporte crucial, regulando dinamicamente a troca de moléculas e células entre o sangue e os tecidos circundantes. Essa regulação é essencial para prevenir o edema tecidual e permitir a troca seletiva de nutrientes e células, apoiando assim o metabolismo e a homeostase tecidual¹. A permeabilidade endotelial alterada, um fator em muitas condições de saúde, afeta tanto a gravidade da doença quanto a eficácia do tratamento². O endotélio vascular atua como uma barreira seletiva, facilitando a transferência entre vasos, te....

Protocolo

1. Geração de código G para a bioimpressora

1. Para gerar e visualizar o caminho de impressão, visite uma ferramenta de simulação de código G online (por exemplo, NCviewer).
2. Clique no ícone Novo arquivo na interface para criar um novo arquivo de código G.
3. Gere um caminho de impressão escrevendo manualmente os comandos do código G para o canal de sacrifício e a câmara de silício. Use as dimensões de uma placa padrão de seis poços como referência para criar a geometria.
   NOTA: O código G usado aqui é baseado no código de Controle Numérico Computadorizado (CNC). As funções de....

Discussão

Aproveitando a precisão, automação e natureza controlada por computador da tecnologia de bioimpressão 3D, estabelecemos um método simplificado para fabricar canais vasculares em placas padrão de seis poços, que foram escolhidas por sua compatibilidade com leitores comerciais de microplacas e configurações de imagens microscópicas. O design da placa pode acomodar canais de vários tamanhos e um volume suficiente de mídia para o crescimento de canais maiores, diminuindo a frequ?.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Serological Pipette	SPL	SPL 91010
10 mL syringe	Shinchang Medical
15 mL conical tube	SPL	50015
3D Bioprinter	T&R Biofab	3DX-Printer
6-well plate	SPL	37206
Biological Safety Cabinets	CHC LAB	PCHC-777A2-04,
Brightfield Inverted Microscopes	Leica	DMi1
Cell Counting Kit (CCK8)	GlpBio	GK10001
Cell Counting Kit (CCK8)	GlpBio	GK10001
Cell Culture Flask 75T	SPL	70075
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL	Corning	354230
Distilled water
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO, Cell Culture Grade	Sigma aldrich	D2438
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a Kit	DOW	DC-184
DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1.1 KG Kit	DOW	2924404
D-PBS - 1x	Welgene	LB001-01
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 (Ready to use)	Promocell	C-22022
Eppendorf Micro pipette(1000,200,100,20,10)	eppendorf
Ethyl Alcohol 99.9%	Duksan	D5
Excel	Microsoft
Fibrinogen from bovine plasma	Sigma Aldrich	F8630-1G
FITC Dextran 70 kDa	Sigma Aldrich	46945-100MG-F
Fluorescent beads (1.0 μm, green)	Sigma Aldrich	L1030-1ML
GelMA-powder (Gelatin methacrylate) 50 g	3D Materials	20JT29
Gibco, Recovery Cell Culture Freezing Medium, 50 mL	Gibco
HUVECs (Human Umbillical Vein Endothelial Cells)	Promocell
ImageJ software	NIH
Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Forma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubator
Invitrogen, Live/dead viability/cytotoxicity Kit (for mammalian cells)	Thermo Fisher	L3224
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphate powder	Tokoyo Chemical Industry CO.	85073-19-4
Marienfeld Superior, Counting chamber cover	Marienfeld Superior
Marienfeld Superior, Hemocytometer, cell counting chamber	Marienfeld Superior	HSU-0650030
Microcentrifuge	eppendorf	Centrifuge 5920 R
NCViewer.com
Nitrogen tank	WORTHINGTON INDUSTRIES	LS750
Omnicure UV Laser	EXCELITAS	SERIES 1500
Parafilm M	amcor	PM-996
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010
Planetary Mixer	THINKY CORPORATION, japan	ARE-310
Plasma treatment machine	FEMTO SCIENCE	CUTE-1MPR
Pluronic F-127	Sigma aldrich	P2443-250G
Pre-made buffer, (P2007-1) 10x PBS	Biosesang	PR4007-100-00
Reagent storage cabinet	ZIO FILTER TECH	SC2-30F-1306D1-BC
Real time Live cell Imaging Microscope	Carl ZEISS
Refrigerator	SAMSUNG	RT50K6035SL
ROCKER 2D digital	IKA	4003000
Scoop-Spatula	CacheBy	SL-SCO7001-EA
sigma,Trypsin-EDTA solition, 0.25%	Sigma aldrich	T4049-100ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Thermo Fisher scientific	151-21-3
Syringe Barrel Tip Cap	FISNAR	3051806
Tally counter	Control Company	C23-147-050
Tapered Nozzle (18 G)	Mushashi	TPND-18G-U
Tapered Nozzle (22 G)	Mushashi	TPND-22G-U
Tapered nozzle 20 G	Musashi	TPND-20G-U
Thrombin from bovine plasma	Sigma Aldrich	T7326-1KU
Timer, 4-channel	ETL	SL.Tim3005
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15250061
Trypsin Neutralizing Solution	Promocell	C-41120
UG 24 mL UG ointment jar	Yamayu	No. 3-53
UG 58 mL UG ointment jar	Yamayu	No. 3-55
Water Bath	DAIHAN Scientific	WB-11
Weight machine	Sartorius	bce2241-1skr