Boyut ve Desen Esnekliği ile Standart Altı Kuyulu Plakalarda Vasküler Geçirgenliğin Modellenmesi için Yüksek Verimli Biyobaskı Yöntemi

Özet

Plaka üzerinde damar (VOP) olarak adlandırılan 3D biyobaskı teknolojisini kullanarak standart altı oyuklu bir plaka üzerinde esnek boyutlara ve istenen desenlere sahip vasküler kanalların yüksek verimli üretimi için bir protokol sunuyoruz. Bu platform, riskli endotel ile ilişkili bozukluklar için terapötiklerin geliştirilmesini ilerletme potansiyeline sahiptir.

Özet

Vasküler geçirgenlik, koroner arterlerdeki endotel disfonksiyonu ve kan-beyin bariyerinin bozulmuş fonksiyonu gibi bozulmuş endotel ile ilişkili bozukluklar için tedavilerin geliştirilmesinde anahtar bir faktördür. Mevcut üretim teknikleri, insan vücudundaki vasküler ağlardaki geometrik varyasyonu yeterince kopyalamamaktadır ve bu da hastalığın ilerlemesini önemli ölçüde etkilemektedir; Ayrıca, bu teknikler genellikle farmakolojik testler için gerekli olan yüksek verimli üretimi engelleyen çok adımlı üretim prosedürlerini içerir. Bu makale, biyo-baskı teknolojisindeki mevcut çözünürlük ve üretkenlik zorluklarının üstesinden gelerek, doğrudan standart altı oyuklu plakalar üzerinde istenen desen ve boyutlara sahip çoklu vasküler dokular oluşturmak için bir biyo-baskı protokolü sunmaktadır. Bir hidrojel içinde altı içi boş, perfüze edilebilir kanal oluşturmak için basitleştirilmiş bir üretim yaklaşımı oluşturuldu ve bunlar daha sonra fonksiyonel ve olgun bir endotel oluşturmak için insan göbek veni endotel hücreleri ile kaplandı. 3D biyobaskının bilgisayar kontrollü doğası, yüksek tekrarlanabilirlik sağlar ve geleneksel yöntemlere göre daha az manuel üretim adımı gerektirir. Bu, VOP'un vasküler geçirgenliği modellemek ve ilaç keşfini ilerletmek için verimli, yüksek verimli bir platform olarak potansiyelini vurgulamaktadır.

Giriş

İnsan vücudundaki vasküler ağ, kan ve çevre dokular arasındaki molekül ve hücre alışverişini dinamik olarak düzenleyerek çok önemli bir taşıma bariyeri olarak işlev görür. Bu düzenleme, doku ödemini önlemek ve seçici besin ve hücre alışverişini sağlamak, böylece doku metabolizmasını ve homeostazı desteklemek için gereklidir¹. Birçok sağlık durumunda bir faktör olan değişmiş endotel geçirgenliği, hem hastalık şiddetini hem de tedavi etkinliğini etkiler². Vasküler endotel, damarlar, dokular ve organlar arasındaki transferi kolaylaştıran seçici bir bariyer görevi görür. Bu düzenleme, çözüne....

Protokol

1. Biyoyazıcı için G kodunun oluşturulması

1. Yazdırma yolunu oluşturmak ve görselleştirmek için çevrimiçi bir G kodu simülasyon aracını (ör. NCviewer) ziyaret edin.
2. Tıkla Yeni dosya Yeni bir G kodu dosyası oluşturmak için arayüzdeki simge.
3. Kurban kanalı ve silikon odası için G kodu komutlarını manuel olarak yazarak bir yazdırma yolu oluşturun. Geometriyi oluşturmak için referans olarak standart altı kuyulu bir plakanın boyutlarını kullanın.
   NOT: Burada kullanılan G kodu, Bilgisayarlı Sayısal Kontrol (CNC) kodunu temel alır. Her komutun işlevleri Ek Tablo S1'de

Tartışmalar

3D biyo-baskı teknolojisinin hassasiyeti, otomasyonu ve bilgisayar kontrollü doğasından yararlanarak, ticari mikroplaka okuyucuları ve mikroskop görüntüleme kurulumları ile uyumlulukları nedeniyle seçilen standart altı oyuklu plakalarda vasküler kanallar üretmek için aerodinamik bir yöntem oluşturduk. Plakanın tasarımı, gerekli medya değiştirme sıklığını azaltırken daha büyük kanalların büyümesi için çok boyutlu kanalları ve yeterli miktarda medyayı b.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Serological Pipette	SPL	SPL 91010
10 mL syringe	Shinchang Medical
15 mL conical tube	SPL	50015
3D Bioprinter	T&R Biofab	3DX-Printer
6-well plate	SPL	37206
Biological Safety Cabinets	CHC LAB	PCHC-777A2-04,
Brightfield Inverted Microscopes	Leica	DMi1
Cell Counting Kit (CCK8)	GlpBio	GK10001
Cell Counting Kit (CCK8)	GlpBio	GK10001
Cell Culture Flask 75T	SPL	70075
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL	Corning	354230
Distilled water
DMEM/F12	Gibco	11320033
DMSO, Cell Culture Grade	Sigma aldrich	D2438
Dow-Corning, PDMS-Sylgard 184a Kit	DOW	DC-184
DOWSIL SE 1700 Clear W/C 1.1 KG Kit	DOW	2924404
D-PBS - 1x	Welgene	LB001-01
Endothelial Cell Growth Medium MV 2 (Ready to use)	Promocell	C-22022
Eppendorf Micro pipette(1000,200,100,20,10)	eppendorf
Ethyl Alcohol 99.9%	Duksan	D5
Excel	Microsoft
Fibrinogen from bovine plasma	Sigma Aldrich	F8630-1G
FITC Dextran 70 kDa	Sigma Aldrich	46945-100MG-F
Fluorescent beads (1.0 μm, green)	Sigma Aldrich	L1030-1ML
GelMA-powder (Gelatin methacrylate) 50 g	3D Materials	20JT29
Gibco, Recovery Cell Culture Freezing Medium, 50 mL	Gibco
HUVECs (Human Umbillical Vein Endothelial Cells)	Promocell
ImageJ software	NIH
Incubator	Thermo SCIENTIFIC	Forma STERI-CYCLE i160 CO2 Incubator
Invitrogen, Live/dead viability/cytotoxicity Kit (for mammalian cells)	Thermo Fisher	L3224
Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphate powder	Tokoyo Chemical Industry CO.	85073-19-4
Marienfeld Superior, Counting chamber cover	Marienfeld Superior
Marienfeld Superior, Hemocytometer, cell counting chamber	Marienfeld Superior	HSU-0650030
Microcentrifuge	eppendorf	Centrifuge 5920 R
NCViewer.com
Nitrogen tank	WORTHINGTON INDUSTRIES	LS750
Omnicure UV Laser	EXCELITAS	SERIES 1500
Parafilm M	amcor	PM-996
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	GenDEPOT	CA005-010
Planetary Mixer	THINKY CORPORATION, japan	ARE-310
Plasma treatment machine	FEMTO SCIENCE	CUTE-1MPR
Pluronic F-127	Sigma aldrich	P2443-250G
Pre-made buffer, (P2007-1) 10x PBS	Biosesang	PR4007-100-00
Reagent storage cabinet	ZIO FILTER TECH	SC2-30F-1306D1-BC
Real time Live cell Imaging Microscope	Carl ZEISS
Refrigerator	SAMSUNG	RT50K6035SL
ROCKER 2D digital	IKA	4003000
Scoop-Spatula	CacheBy	SL-SCO7001-EA
sigma,Trypsin-EDTA solition, 0.25%	Sigma aldrich	T4049-100ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Thermo Fisher scientific	151-21-3
Syringe Barrel Tip Cap	FISNAR	3051806
Tally counter	Control Company	C23-147-050
Tapered Nozzle (18 G)	Mushashi	TPND-18G-U
Tapered Nozzle (22 G)	Mushashi	TPND-22G-U
Tapered nozzle 20 G	Musashi	TPND-20G-U
Thrombin from bovine plasma	Sigma Aldrich	T7326-1KU
Timer, 4-channel	ETL	SL.Tim3005
Trypan Blue Solution 0.4%	Gibco	15250061
Trypsin Neutralizing Solution	Promocell	C-41120
UG 24 mL UG ointment jar	Yamayu	No. 3-53
UG 58 mL UG ointment jar	Yamayu	No. 3-55
Water Bath	DAIHAN Scientific	WB-11
Weight machine	Sartorius	bce2241-1skr