Extracción de ADN y comparación entre muestras de moscas necrófilas viejas y frescas

Resumen

Este artículo describe un protocolo para la extracción de ADN de mosca necrófila fresca y vieja utilizando un kit de extracción de ADN común modificado.

Resumen

Se seleccionaron un total de cinco muestras de Chrysomya megacephala (tres muestras frescas, una muestra almacenada en alcohol durante 2 años y una muestra almacenada en sellado seco durante 2 años protegida únicamente de la luz) para investigar si un kit de extracción de ADN sanguíneo podía extraer ADN de moscas necrófilas y determinar si el alcohol podía prolongar la conservación del ADN de las moscas necrófilas. En primer lugar, se utilizó el kit de extracción de ADN sanguíneo para extraer ADN de los tejidos del tórax. A continuación, se examinaron la pureza y la concentración del ADN utilizando un lector de microplacas y un fluorómetro. Finalmente, la amplificación por PCR y la electroforesis del ADN extraído se realizaron con cebadores necrófilos específicos de mosca localizados en la secuencia del gen CO I mitocondrial. Los resultados mostraron que la pureza del ADN de todas las muestras fue superior a 2,0. Se observó que la concentración de ADN era del siguiente orden: muestras frescas > muestras viejas conservadas con alcohol > muestras viejas sin tratar. Todas las muestras tenían bandas electroforéticas específicas después de la amplificación por PCR. En conclusión, se puede utilizar un kit de extracción de ADN sanguíneo para extraer ADN de moscas necrófilas con éxito, y la concentración de ADN de las muestras frescas de moscas es mayor que la de las muestras de moscas viejas. Las moscas se pueden almacenar en alcohol durante mucho tiempo.

Introducción

La inferencia de la hora de la muerte siempre ha sido una de las cuestiones clave y difíciles de resolver en la práctica judicial. En la práctica de la ciencia forense, para un caso criminal, la determinación del intervalo postmortem juega un papel crucial en la deducción del momento del crimen, encerrando al sospechoso y reduciendo el alcance de la investigación. Los métodos tradicionales para inferir la hora de la muerte se basan principalmente en fenómenos postmortem tempranos, que generalmente solo se pueden usar para inferir la hora de la muerte dentro de las 24 horas. Sin embargo, la longevidad de la muerte no puede determinarse por fenómenos post mortem. En la actualidad, se reconoce generalmente en la comunidad de la ciencia forense que la entomología forense tiene el potencial de ser un método eficaz para inferir un tiempo más prolongado de la muerte.

Los insectos necrófagos reciben su nombre por sus larvas que se alimentan de cadáveres. Entre ellas, siempre que haya un cadáver, las moscas necrófilas adultas serán las primeras en llegar al cadáver y poner sus huevos o larvas. Las larvas se alimentan de tejido cadavérico y maduran hasta convertirse en pupas, que se convierten en adultos. Las moscas necrófilas juegan un papel muy importante en la práctica de la ciencia forense debido a su ciclo de vida regular y distribución geográfica, por ejemplo, deduciendo la hora de la muerte y determinando el lugar de la muerte ^1,2. Sin embargo, la barrera para el uso de moscas necrófilas en la práctica forense es la identificación de especies. Los métodos morfológicos todavía se utilizan como el método autorizado para la identificación de especies de moscas necrófilas. Sin embargo, la identificación morfológica de las especies requiere un alto grado de integridad de los insectos. Si las moscas estaban en diferentes etapas de desarrollo, o debido a cambios morfológicos causados por elecciones ambientales, todo eso dificulta el examen morfológico. En particular, la morfología de las pupas y conchas de pupa, que se encuentran con mayor frecuencia en la escena del crimen, es apenas reconocible. Esto, junto con la escasez de expertos morfológicos, dificulta enormemente la identificación morfológica de las especies. Por lo tanto, ha surgido la aplicación de métodos de biología molecular para la identificación de especies de moscas, lo que reduce la dificultad de la identificación morfológica y es independiente de la etapa de desarrollo 3,4,5,6,7.

El primer paso en la identificación de especies de moscas necrófilas basadas en métodos de biología molecular es la extracción eficiente de ADN, mientras que actualmente no se dispone de kits especializados para la extracción de ADN de insectos. Y cómo usar kits de sangre comunes para la extracción de ADN de moscas necrófilas se vuelve más relevante desde el punto de vista forense. Las moscas necrófilas que se encuentran en las escenas del crimen a menudo están mutiladas o han sufrido descomposición y degradación del ADN. Las muestras de mosca no están disponibles inmediatamente para la extracción de ADN después de la adquisición, o si es posible, es necesario conservar muestras completas debido a los requisitos de preservación de la evidencia. Sobre la base de los requisitos anteriores, en este estudio, aplicamos el kit de ADN sanguíneo basado en la digestión de proteinasa K, y seleccionamos tres muestras frescas de Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) (Figura 1), una muestra vieja de C. megacephala colocada en alcohol durante dos años, y una muestra de C. megacephala colocada en almacenamiento protegido a la luz durante dos años, pesamos cada una de las cinco muestras, eligió el tejido del tórax del insecto para la extracción de ADN. Comparando la calidad y pureza del ADN extraído de las muestras antiguas y nuevas, se realizó la amplificación por PCR y la electroforesis del ADN extraído con cebadores necrófilos específicos de mosca ubicados en la secuencia del gen de CO mitocondrial.

Protocolo

NOTA: Se utilizaron un total de cinco muestras de C. megacephala en este protocolo: tres muestras frescas (Fresh 1, Fresh 2 y Fresh 3), una muestra almacenada en alcohol durante 2 años (Old 1) y una muestra almacenada en almacenamiento sellado en seco durante 2 años protegida de la luz solo (Old 2). Las muestras deben etiquetarse de acuerdo con los requisitos experimentales.

1. Almacenamiento general de muestras y preparaciones

1. Selección y preparación de muestras
   NOTA: Asegúrese de trabajar en la campana extractora cuando aplique acetato de etilo para eliminar moscas necrófagas. Retire el líquido de la superficie de la mosca antes de pesarla.
   1. Muestras frescas: Coloque tres muestras de mosca recolectadas en viales de gas después de matarlas con acetato de etilo. Pesa y nombra las muestras como Fresh 1, Fresh 2 y Fresh 3 y utilízalas inmediatamente en los experimentos.
      NOTA: Las muestras frescas de mosca en este protocolo tenían masas de 56,8 mg, 49,3 mg y 52,1 mg.
   2. Muestra antigua 1: Extraiga las muestras de moscas muertas por acetato de etilo y almacenadas en tubos de centrífuga llenos de alcohol durante 2 años en una contención hermética, protegidas de la luz a temperatura ambiente. Pesar la muestra después de adsorber el líquido de la superficie con papel de filtro; llámalo Viejo 1.
      NOTA: La masa de Old 1 fue de 42,3 mg en este protocolo.
   3. Muestra antigua 2: Extraiga la muestra de mosca muerta por acetato de etilo y almacenada en un tubo de centrífuga durante 2 años en una contención hermética, protegida de la luz a temperatura ambiente. Pesa y llámalo Viejo 2.
2. Preparación antes de la extracción
   1. Agregue una pequeña cantidad de nitrógeno líquido para enfriar un recipiente de acero inoxidable; Espere hasta que todo el nitrógeno líquido se haya evaporado.
   2. Coloque una muestra de mosca en el recipiente; Vierta el nitrógeno líquido lentamente para evitar que el nitrógeno líquido salpique e impacte en la muestra de insecto.
   3. Congele las muestras en nitrógeno líquido. Retire las muestras después de que el nitrógeno líquido se evapore.
   4. Separe el tórax individualmente, colóquelo en un tubo de centrífuga de 2 ml y córtelo en rodajas lo más pequeñas posibles.
      NOTA: Corte la muestra en pedazos pequeños para que pueda cortarse por completo y el ADN se pueda liberar en grandes cantidades.
   5. Repita los pasos anteriores para cada mosca, congele individualmente y luego retírela a un nuevo tubo de centrífuga para evitar la contaminación cruzada del ADN.

2. Extracción de ADN

NOTA: Todas las etapas de centrifugación deben realizarse a temperatura ambiente (15-25 °C) en una microcentrífuga. Todos los pasos deben realizarse en estricto cumplimiento de los principios de asepsia y para evitar la contaminación cruzada.

1. Lisis de tejidos
   1. Añada 180 μl de tampón de lisis tisular a un tubo de centrífuga de 2 ml que contenga una muestra recortada.
   2. Añadir 20 μL de proteinasa K. Mezclar bien mediante vórtice a 3 000 rpm durante 10 s e incubar a 56 °C hasta que los tejidos del insecto estén completamente lisados.
      NOTA: Agregue más proteinasa K si el tejido no se digiere completamente. La lisis generalmente se completa en 1-3 h, también puede extender el tiempo de lisis durante la noche.
2. Precipitación de ADN
   1. Vórtice a 3.000 rpm durante 15 s. Añada 200 μL de tampón de lisis a la muestra y mezcle bien mediante vórtice a 3.000 rpm durante 15 s.
   2. Añadir 200 μL de etanol (96-100%) y mezclar de nuevo a fondo mediante vórtice a 3.000 rpm durante 15 s.
      NOTA: El tampón de lisis y el etanol se pueden agregar previamente en un solo paso para ahorrar tiempo. Se puede formar un precipitado blanco con la adición de tampón de lisis y etanol.
3. Pipetear la mezcla en la columna de adsorción de ADN colocada en un tubo de recolección de 2 mL. Centrifugar a 6.000 × g durante 1 min. Deseche el flujo y el tubo de recolección.
4. Coloque la columna de adsorción de ADN del paso anterior en un nuevo tubo de recolección de 2 ml, agregue 500 μL de tampón de eliminación de proteínas y centrifugue a 6,000 × g durante 1 min. Deseche el flujo y el tubo de recolección.
5. Transfiera la columna de adsorción de ADN a un nuevo tubo de recolección de 2 mL, agregue 500 μL de tampón de desalinización y centrifugue a 20,000 × g durante 3 min para secar la membrana de la columna de adsorción de ADN. Deseche el flujo y el tubo de recolección.
   NOTA: Este paso de centrifugación asegura la eliminación de cualquier etanol residual antes de la siguiente elución. Si hay algún remanente de etanol, centrifugar nuevamente a 20,000 × g durante 1 min.
6. Coloque la columna de adsorción de ADN en un tubo de microcentrífuga limpio de 2 mL, pipetee directamente 100 μL de tampón de elución de ADN sobre la membrana de la columna, incube a temperatura ambiente durante 1 minuto y luego centrifugue a 6.000 × g durante 1 min para eluir.
   NOTA: La elución con 100 μL (en lugar de 200 μL) aumenta la concentración final de ADN en el eluido, pero también disminuye el rendimiento total de ADN. Para maximizar el rendimiento de ADN, repita la elución una vez como se describe en el paso 2.8.
7. Almacene las muestras de ADN a 4 °C (hasta 1 semana) o -80 °C para su almacenamiento a largo plazo.

3. Detección de la concentración de ADN

1. Determine los valores de OD 260 y OD 280 para comparar la pureza del ADN y la concentración de ácido nucleico mediante un lector de microplacas. Repita tres veces en cada muestra.
2. Determine la concentración del ADN extraído mediante un fluorómetro utilizando su kit complementario, con tres repeticiones para cada muestra.
   1. Tome 190 μL de solución de trabajo en dos tubos de centrífuga de 0,5 mL, tome 10 μL de cada uno de los Estándar # 1 y 10 μL de la Norma # 2, agréguelos a las soluciones de trabajo y manténgalos alejados de la luz durante no menos de 15 minutos.
      NOTA: El Estándar #1 y el Estándar #2 están calibrados con precisión para una cierta concentración de ADN. Las soluciones estándar deben configurarse con precisión para garantizar la formación de una curva estándar precisa. El estándar #1 es una muestra de ADN bicatenario (dsDNA) de 0,2 ng/μL; el estándar #2 es de 2.000 ng/μL. La solución de trabajo es un tinte que se une específicamente al dsDNA.
   2. Tome 2 μL de ADN de prueba y mézclelo con 198 μL de solución de trabajo en un tubo de centrífuga de 0,5 mL, y manténgalo alejado de la luz durante no menos de 15 minutos.
      NOTA: Si la concentración de ADN es baja, agregue 5 μL de ADN de prueba con 195 μL de solución de trabajo.
   3. Después de 15 minutos, encienda el instrumento y seleccione Medición de concentración de dsDNA | Largo alcance. Primero, pruebe el Estándar # 1 y luego, el Estándar # 2 para obtener la curva estándar.
      NOTA: La solución estándar debe utilizarse el mismo día después de su configuración; Dejarlo durante demasiado tiempo dará como resultado un gran error en la curva estándar.
   4. Coloque las muestras que se van a analizar en los pocillos de ensayo una por una, ajuste el volumen de aumento de ADN a 2 μL, repita la medición tres veces, tome el valor promedio y registre.

4. PCR y detección electroforética

NOTA: Se tomó la secuencia del gen de CO mitocondrial con una longitud de 278 pb para la amplificación por PCR con cebador directo C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG, y cebador inverso C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC⁸, y luego se realizó electroforesis en gel de agarosa al 2% para verificar el efecto de amplificación y la longitud de los productos de amplificación.

1. Configure 20 μL del sistema de amplificación de PCR agregando 10 μL de mezcla 2x Taq, 1 μL de cada cebador, 5 μL de ddH₂O y 3 μL de ADN moltest; Mezclar bien durante 10 s en una centrífuga.
2. Utilice los siguientes parámetros de ciclo de PCR: predesnaturalización a 95 °C durante 10 min; desnaturalización 95 °C durante 30 s, recocido 48 °C durante 30 s, extensión 72 °C durante 45 s durante un total de 40 ciclos; y extensión final 72 °C durante 10 min.
3. Someter los productos después de la PCR a una electroforesis en gel de agarosa al 2% y, después de la electroforesis, colocarlos en un sistema de imágenes en gel para su fotoanálisis.

Resultados

Utilizamos un lector de microplacas para medir los valores de OD260 y OD280 de la solución de ADN extraída y luego obtuvimos los valores de OD260/OD280 para evaluar la pureza del ADN. El OD260/OD280 de todas las muestras frescas y la muestra antigua 1 fue mayor que 2. El OD260/OD280 de la antigua muestra 2 tuvo un valor máximo de 2,187 aunque el promedio fue de 1,753, y sus tres mediciones fluctuaron mucho debido a los pequeños valores (≤0,01) tanto de su OD280 como de su OD280 (Tabla 1). A partir ...

Discusión

La extracción de ADN es el eslabón más crítico en la identificación molecular de moscas necrófilas, y su método de extracción y la calidad del ADN extraído afectan directamente a la detección posterior. En este experimento, extrajimos con éxito ADN de moscas necrófilas mediante el uso de un kit de sangre común, sin la necesidad de comprar un kit especial de extracción de ADN de insectos, lo que hace que la extracción de ADN de insectos sea más fácil de lograr.

La superficie de...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer AE	Qiagen	172026832	DNA elution buffer
Buffer AL	Qiagen	172028374	lysis buffer
Buffer ATL	Qiagen	172028162	tissue lysis buffer
Buffer AW1	Qiagen	172028760	protein removal buffer
Buffer AW2	Qiagen	57203108	desalination buffer
C1-J-2495	Taihe Biotechnology	TW21109216	forword primer
C1-N-2800	Taihe Biotechnology	TW21109217	reverse primer
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
DNeasy Mini spin column	Qiagen	166050343	DNA adsorption column
Dry Bath Incubator	Miulab	DKT200-2D	used for heating
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	Qiagen	172026218	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Qubit 3.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	2321611188
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Standard#1	Thermo Fisher Scientific	2342797
Standard#2	Thermo Fisher Scientific	2342797
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Working Solution	Thermo Fisher Scientific	2342797