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* Estos autores han contribuido por igual
Este artículo describe un protocolo para la extracción de ADN de mosca necrófila fresca y vieja utilizando un kit de extracción de ADN común modificado.
Se seleccionaron un total de cinco muestras de Chrysomya megacephala (tres muestras frescas, una muestra almacenada en alcohol durante 2 años y una muestra almacenada en sellado seco durante 2 años protegida únicamente de la luz) para investigar si un kit de extracción de ADN sanguíneo podía extraer ADN de moscas necrófilas y determinar si el alcohol podía prolongar la conservación del ADN de las moscas necrófilas. En primer lugar, se utilizó el kit de extracción de ADN sanguíneo para extraer ADN de los tejidos del tórax. A continuación, se examinaron la pureza y la concentración del ADN utilizando un lector de microplacas y un fluorómetro. Finalmente, la amplificación por PCR y la electroforesis del ADN extraído se realizaron con cebadores necrófilos específicos de mosca localizados en la secuencia del gen CO I mitocondrial. Los resultados mostraron que la pureza del ADN de todas las muestras fue superior a 2,0. Se observó que la concentración de ADN era del siguiente orden: muestras frescas > muestras viejas conservadas con alcohol > muestras viejas sin tratar. Todas las muestras tenían bandas electroforéticas específicas después de la amplificación por PCR. En conclusión, se puede utilizar un kit de extracción de ADN sanguíneo para extraer ADN de moscas necrófilas con éxito, y la concentración de ADN de las muestras frescas de moscas es mayor que la de las muestras de moscas viejas. Las moscas se pueden almacenar en alcohol durante mucho tiempo.
La inferencia de la hora de la muerte siempre ha sido una de las cuestiones clave y difíciles de resolver en la práctica judicial. En la práctica de la ciencia forense, para un caso criminal, la determinación del intervalo postmortem juega un papel crucial en la deducción del momento del crimen, encerrando al sospechoso y reduciendo el alcance de la investigación. Los métodos tradicionales para inferir la hora de la muerte se basan principalmente en fenómenos postmortem tempranos, que generalmente solo se pueden usar para inferir la hora de la muerte dentro de las 24 horas. Sin embargo, la longevidad de la muerte no puede determinarse por fenómenos post mortem. En la actualidad, se reconoce generalmente en la comunidad de la ciencia forense que la entomología forense tiene el potencial de ser un método eficaz para inferir un tiempo más prolongado de la muerte.
Los insectos necrófagos reciben su nombre por sus larvas que se alimentan de cadáveres. Entre ellas, siempre que haya un cadáver, las moscas necrófilas adultas serán las primeras en llegar al cadáver y poner sus huevos o larvas. Las larvas se alimentan de tejido cadavérico y maduran hasta convertirse en pupas, que se convierten en adultos. Las moscas necrófilas juegan un papel muy importante en la práctica de la ciencia forense debido a su ciclo de vida regular y distribución geográfica, por ejemplo, deduciendo la hora de la muerte y determinando el lugar de la muerte 1,2. Sin embargo, la barrera para el uso de moscas necrófilas en la práctica forense es la identificación de especies. Los métodos morfológicos todavía se utilizan como el método autorizado para la identificación de especies de moscas necrófilas. Sin embargo, la identificación morfológica de las especies requiere un alto grado de integridad de los insectos. Si las moscas estaban en diferentes etapas de desarrollo, o debido a cambios morfológicos causados por elecciones ambientales, todo eso dificulta el examen morfológico. En particular, la morfología de las pupas y conchas de pupa, que se encuentran con mayor frecuencia en la escena del crimen, es apenas reconocible. Esto, junto con la escasez de expertos morfológicos, dificulta enormemente la identificación morfológica de las especies. Por lo tanto, ha surgido la aplicación de métodos de biología molecular para la identificación de especies de moscas, lo que reduce la dificultad de la identificación morfológica y es independiente de la etapa de desarrollo 3,4,5,6,7.
El primer paso en la identificación de especies de moscas necrófilas basadas en métodos de biología molecular es la extracción eficiente de ADN, mientras que actualmente no se dispone de kits especializados para la extracción de ADN de insectos. Y cómo usar kits de sangre comunes para la extracción de ADN de moscas necrófilas se vuelve más relevante desde el punto de vista forense. Las moscas necrófilas que se encuentran en las escenas del crimen a menudo están mutiladas o han sufrido descomposición y degradación del ADN. Las muestras de mosca no están disponibles inmediatamente para la extracción de ADN después de la adquisición, o si es posible, es necesario conservar muestras completas debido a los requisitos de preservación de la evidencia. Sobre la base de los requisitos anteriores, en este estudio, aplicamos el kit de ADN sanguíneo basado en la digestión de proteinasa K, y seleccionamos tres muestras frescas de Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) (Figura 1), una muestra vieja de C. megacephala colocada en alcohol durante dos años, y una muestra de C. megacephala colocada en almacenamiento protegido a la luz durante dos años, pesamos cada una de las cinco muestras, eligió el tejido del tórax del insecto para la extracción de ADN. Comparando la calidad y pureza del ADN extraído de las muestras antiguas y nuevas, se realizó la amplificación por PCR y la electroforesis del ADN extraído con cebadores necrófilos específicos de mosca ubicados en la secuencia del gen de CO mitocondrial.
NOTA: Se utilizaron un total de cinco muestras de C. megacephala en este protocolo: tres muestras frescas (Fresh 1, Fresh 2 y Fresh 3), una muestra almacenada en alcohol durante 2 años (Old 1) y una muestra almacenada en almacenamiento sellado en seco durante 2 años protegida de la luz solo (Old 2). Las muestras deben etiquetarse de acuerdo con los requisitos experimentales.
1. Almacenamiento general de muestras y preparaciones
2. Extracción de ADN
NOTA: Todas las etapas de centrifugación deben realizarse a temperatura ambiente (15-25 °C) en una microcentrífuga. Todos los pasos deben realizarse en estricto cumplimiento de los principios de asepsia y para evitar la contaminación cruzada.
3. Detección de la concentración de ADN
4. PCR y detección electroforética
NOTA: Se tomó la secuencia del gen de CO mitocondrial con una longitud de 278 pb para la amplificación por PCR con cebador directo C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG, y cebador inverso C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC8, y luego se realizó electroforesis en gel de agarosa al 2% para verificar el efecto de amplificación y la longitud de los productos de amplificación.
Utilizamos un lector de microplacas para medir los valores de OD260 y OD280 de la solución de ADN extraída y luego obtuvimos los valores de OD260/OD280 para evaluar la pureza del ADN. El OD260/OD280 de todas las muestras frescas y la muestra antigua 1 fue mayor que 2. El OD260/OD280 de la antigua muestra 2 tuvo un valor máximo de 2,187 aunque el promedio fue de 1,753, y sus tres mediciones fluctuaron mucho debido a los pequeños valores (≤0,01) tanto de su OD280 como de su OD280 (Tabla 1). A partir ...
La extracción de ADN es el eslabón más crítico en la identificación molecular de moscas necrófilas, y su método de extracción y la calidad del ADN extraído afectan directamente a la detección posterior. En este experimento, extrajimos con éxito ADN de moscas necrófilas mediante el uso de un kit de sangre común, sin la necesidad de comprar un kit especial de extracción de ADN de insectos, lo que hace que la extracción de ADN de insectos sea más fácil de lograr.
La superficie de...
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82060341,81560304) y del Proyecto de Investigación Científica de la Plataforma de Innovación Académica de la provincia de Hainan (YSPTZX202134).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Buffer AE | Qiagen | 172026832 | DNA elution buffer |
Buffer AL | Qiagen | 172028374 | lysis buffer |
Buffer ATL | Qiagen | 172028162 | tissue lysis buffer |
Buffer AW1 | Qiagen | 172028760 | protein removal buffer |
Buffer AW2 | Qiagen | 57203108 | desalination buffer |
C1-J-2495 | Taihe Biotechnology | TW21109216 | forword primer |
C1-N-2800 | Taihe Biotechnology | TW21109217 | reverse primer |
D2000 DNA ladder | Real-Times(Beijing) Biotechnology | RTM415 | Measure the position of electrophoretic bands |
DNeasy Mini spin column | Qiagen | 166050343 | DNA adsorption column |
Dry Bath Incubator | Miulab | DKT200-2D | used for heating |
MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | oscillatory action |
Proteinase K | Qiagen | 172026218 | Inactivation of intracellular nucleases and other proteins |
Qubit 3.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | 2321611188 | |
Speed Micro-Centrifuge | Scilogex | 9013001121 | centrifuge |
Standard#1 | Thermo Fisher Scientific | 2342797 | |
Standard#2 | Thermo Fisher Scientific | 2342797 | |
Tanon 3500R Gel Imager | Tanon | 16T5553R-455 | gel imaging |
Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinary PCR |
Working Solution | Thermo Fisher Scientific | 2342797 |
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