DNA-Extraktion und Vergleich zwischen alten und frischen nekrophilen Fliegenproben

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Extraktion frischer und alter nekrophiler Fliegen-DNA unter Verwendung eines modifizierten gängigen DNA-Extraktionskits.

Zusammenfassung

Insgesamt wurden fünf Proben von Chrysomya megacephala-Proben - drei frische Proben, eine Probe, die 2 Jahre lang in Alkohol gelagert wurde, und eine Probe, die 2 Jahre lang in trockener, versiegelter Lagerung nur lichtgeschützt gelagert wurde - ausgewählt, um zu untersuchen, ob ein Blut-DNA-Extraktionskit DNA von nekrophilen Fliegen extrahieren kann und ob Alkohol die Konservierung der DNA von nekrophilen Fliegen verlängern kann. Zunächst wurde das Blut-DNA-Extraktionskit verwendet, um DNA aus ihrem Thoraxgewebe zu extrahieren. Anschließend wurden die Reinheit und Konzentration der DNA mit einem Mikroplatten-Reader und einem Fluorometer untersucht. Schließlich wurden die PCR-Amplifikation und die Elektrophorese der extrahierten DNA mit nekrophilen fliegenspezifischen Primern durchgeführt, die sich in der mitochondrialen CO I-Gensequenz befanden. Die Ergebnisse zeigten, dass die DNA-Reinheit aller Proben größer als 2,0 war. Es wurde festgestellt, dass die DNA-Konzentration in der folgenden Größenordnung liegt: frische Proben > alkoholkonservierte alte Proben > unbehandelte, alte Proben. Alle Proben wiesen nach PCR-Amplifikation spezifische elektrophoretische Banden auf. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein Blut-DNA-Extraktionskit verwendet werden kann, um DNA aus nekrophilen Fliegen erfolgreich zu extrahieren, und die DNA-Konzentration frischer Fliegenproben ist höher als die alter Fliegenproben. Die Fliegen können lange in Alkohol gelagert werden.

Einleitung

Die Schlussfolgerung des Todeszeitpunkts war schon immer eine der zentralen und schwierigsten Fragen, die in der gerichtlichen Praxis zu lösen waren. In der Praxis der Forensik spielt die Bestimmung des postmortalen Intervalls bei einem Kriminalfall eine entscheidende Rolle bei der Ableitung des Tatzeitpunkts, der Eingrenzung des Verdächtigen und der Eingrenzung des Ermittlungsumfangs. Traditionelle Methoden zur Ableitung des Todeszeitpunkts beruhen in erster Linie auf frühen postmortalen Phänomenen, die in der Regel nur zur Ableitung des Todeszeitpunkts innerhalb von 24 Stunden herangezogen werden können. Die lange Zeit des Todes kann jedoch nicht durch postmortale Phänomene bestimmt werden. In der forensischen Gemeinschaft ist inzwischen allgemein anerkannt, dass die forensische Entomologie das Potenzial hat, eine effektive Methode zu sein, um auf eine längere Todeszeit zu schließen.

Nekrophage Insekten sind nach ihren Larven benannt, die sich von Leichen ernähren. Wenn eine Leiche vorhanden ist, sind die erwachsenen nekrophilen Fliegen die ersten, die den Leichnam erreichen und ihre Eier oder Larven ablegen. Die Larven ernähren sich von Leichengewebe und reifen zu Puppen heran, die zu erwachsenen Tieren flügge werden. Nekrophile Fliegen spielen in der Praxis der Forensik eine große Rolle, da sie regelmäßig leben und geographisch verteilt sind, z. B. bei der Ableitung des Todeszeitpunkts und der Bestimmung des Todesortes ^1,2. Das Hindernis für den Einsatz nekrophiler Fliegen in der forensischen Praxis ist jedoch die Artbestimmung. Morphologische Methoden werden nach wie vor als maßgebliche Methode zur Artbestimmung von nekrophilen Fliegen verwendet. Die morphologische Artbestimmung erfordert jedoch ein hohes Maß an Integrität der Insekten. Wenn sich die Fliegen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien befanden oder aufgrund morphologischer Veränderungen, die durch Umweltentscheidungen verursacht wurden, erschwert dies alle die morphologische Untersuchung. Insbesondere die Morphologie der Puppen und Puppenpanzer, die am häufigsten am Tatort zu finden sind, ist kaum noch zu erkennen. Dies, zusammen mit dem Mangel an morphologischen Experten, erschwert die morphologische Identifizierung von Arten enorm. Daher hat sich die Anwendung molekularbiologischer Methoden zur Artbestimmung von Fliegen herausgebildet, die die Schwierigkeit der morphologischen Identifizierung reduziert und unabhängig vom Entwicklungsstadium^ist 3,4,5,6,7.

Der erste Schritt bei der Artenbestimmung nekrophiler Fliegen auf der Grundlage molekularbiologischer Methoden ist die effiziente Extraktion von DNA, während spezielle Kits für die Extraktion von Insekten-DNA derzeit nicht allgemein verfügbar sind. Und die Verwendung gängiger Blutkits für die DNA-Extraktion von nekrophilen Fliegen wird forensisch immer relevanter. Nekrophile Fliegen, die an Tatorten gefunden werden, sind oft verstümmelt oder haben Verwesung und DNA-Abbau erfahren. Fliegenproben stehen nach der Entnahme nicht sofort für die DNA-Extraktion zur Verfügung, oder wenn möglich, müssen vollständige Proben aufgrund von Anforderungen an die Beweissicherung aufbewahrt werden. Basierend auf den oben genannten Anforderungen haben wir in dieser Studie das Blut-DNA-Kit auf der Grundlage des Proteinase-K-Verdschlusses angewendet und drei frische Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) Proben ausgewählt (Abbildung 1), eine alte C. megacephala Probe, die zwei Jahre lang in Alkohol gelagert wurde, und eine C. megacephala Probe, die zwei Jahre lang lichtgeschützt gelagert wurde, wogen jede der fünf Proben, wählte das Thoraxgewebe von Insekten für die DNA-Extraktion aus. Beim Vergleich der Qualität und Reinheit der DNA, die aus der alten und der neuen Probe extrahiert wurde, wurden PCR-Amplifikation und Elektrophorese der extrahierten DNA mit nekrophilen fliegenspezifischen Primern durchgeführt, die sich in der mitochondrialen CO-Gensequenz befinden.

Protokoll

HINWEIS: In diesem Protokoll wurden insgesamt fünf Proben von C. megacephala verwendet - drei frische Proben (Fresh 1, Fresh 2 und Fresh 3), eine Probe, die 2 Jahre lang in Alkohol gelagert wurde (Old 1) und eine Probe, die 2 Jahre lang in einer trockenen, versiegelten Lagerung gelagert wurde, die nur vor Licht geschützt war (Old 2). Die Proben müssen entsprechend den experimentellen Anforderungen gekennzeichnet werden.

1. Allgemeine Probenlagerung und -vorbereitung

1. Probenauswahl und -vorbereitung
   HINWEIS: Achten Sie darauf, im Abzug zu arbeiten, wenn Sie Ethylacetat auftragen, um nekrophage Fliegen zu exekutieren. Entfernen Sie die Flüssigkeit von der Oberfläche der Fliege, bevor Sie sie wiegen.
   1. Frische Proben: Legen Sie drei gesammelte Fliegenproben in Gasfläschchen, nachdem Sie sie mit Ethylacetat getötet haben. Wiegen und benennen Sie die Proben als Fresh 1, Fresh 2 und Fresh 3 und verwenden Sie sie sofort in Experimenten.
      HINWEIS: Die frischen Fliegenproben in diesem Protokoll wiesen Massen von 56,8 mg, 49,3 mg und 52,1 mg auf.
   2. Alte Probe 1: Fliegenproben, die durch Ethylacetat abgetötet und in mit Alkohol gefüllten Zentrifugenröhrchen 2 Jahre lang in luftdichtem Behälter und lichtgeschützt bei Raumtemperatur gelagert wurden, entnehmen. Wiegen Sie die Probe, nachdem Sie die Oberflächenflüssigkeit mit Filterpapier adsorbiert haben. nennen wir es Old 1.
      HINWEIS: Die Masse von Old 1 betrug in diesem Protokoll 42,3 mg.
   3. Alte Probe 2: Die durch Ethylacetat abgetötete Fliegenprobe herausnehmen und in einem Zentrifugenröhrchen 2 Jahre lang luftdicht verschlossen und lichtgeschützt bei Raumtemperatur lagern. Wiegen Sie und nennen Sie es Alt 2.
2. Vorbereitung vor der Extraktion
   1. Fügen Sie eine kleine Menge flüssigen Stickstoff hinzu, um einen Edelstahlbehälter zu kühlen. Warten Sie, bis der gesamte flüssige Stickstoff verdampft ist.
   2. Geben Sie eine Fliegenprobe in den Behälter; Gießen Sie den flüssigen Stickstoff langsam ein, um zu verhindern, dass der flüssige Stickstoff spritzt und die Insektenprobe beeinträchtigt.
   3. Frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein. Entnehmen Sie Proben, nachdem der flüssige Stickstoff verdampft ist.
   4. Den Thorax einzeln abtrennen, in ein 2 mL Zentrifugenröhrchen geben und in möglichst kleine Scheiben schneiden.
      HINWEIS: Schneiden Sie die Probe in kleine Stücke, damit sie vollständig gespalten werden kann und die DNA in großen Mengen freigesetzt werden kann.
   5. Wiederholen Sie die obigen Schritte für jede Fliege, frieren Sie sie einzeln ein und nehmen Sie sie dann in ein neues Zentrifugenröhrchen, um eine DNA-Kreuzkontamination zu verhindern.

2. DNA-Extraktion

HINWEIS: Alle Zentrifugationsschritte müssen bei Raumtemperatur (15-25 °C) in einer Mikrozentrifuge durchgeführt werden. Alle Schritte müssen unter strikter Einhaltung der Grundsätze der Asepsis und zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen durchgeführt werden.

1. Lyse von Gewebe
   1. Geben Sie 180 μl Gewebelysepuffer in ein 2-ml-Zentrifugenröhrchen, das eine abgeschnittene Probe enthält.
   2. 20 μl Proteinase K zugeben. Durch Vortexen bei 3 000 U/min für 10 s gründlich mischen und bei 56 ΰC inkubieren, bis das Insektengewebe vollständig lysiert ist.
      HINWEIS: Fügen Sie mehr Proteinase K hinzu, wenn das Gewebe nicht vollständig verdaut wird. Die Lyse ist in der Regel in 1-3 Stunden abgeschlossen und kann die Lysezeit auch über Nacht verlängern.
2. DNA-Präzipitation
   1. Vortex bei 3.000 U/min für 15 s. Geben Sie 200 μl Lysepuffer in die Probe und mischen Sie sie gründlich, indem Sie sie 15 s lang bei 3.000 U/min vortexen.
   2. 200 μl Ethanol (96-100%) zugeben und erneut gründlich mischen, indem Sie bei 3.000 U/min 15 s lang vortexen.
      HINWEIS: Lysepuffer und Ethanol können in einem Schritt vorhinzugefügt werden, um Zeit zu sparen. Unter Zugabe von Lysepuffer und Ethanol kann sich ein weißer Niederschlag bilden.
3. Pipettieren Sie die Mischung in die DNA-Adsorptionssäule, die in ein 2-ml-Sammelröhrchen gegeben wird. Bei 6.000 × g 1 min zentrifugieren. Durchfluss- und Auffangröhrchen entsorgen.
4. Legen Sie die DNA-Adsorptionssäule aus dem vorherigen Schritt in ein neues 2-ml-Entnahmeröhrchen, fügen Sie 500 μl Proteinentfernungspuffer hinzu und zentrifugieren Sie 1 Minute lang bei 6.000 × g . Durchfluss- und Auffangröhrchen entsorgen.
5. Übertragen Sie die DNA-Adsorptionssäule in ein neues 2-ml-Entnahmeröhrchen, fügen Sie 500 μl Entsalzungspuffer hinzu und zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 20.000 × g , um die Membran der DNA-Adsorptionssäule zu trocknen. Durchfluss- und Auffangröhrchen entsorgen.
   HINWEIS: Dieser Zentrifugationsschritt stellt sicher, dass vor der folgenden Elution jegliches Restethanol entfernt wird. Bei einer Verschleppung von Ethanol erneut bei 20.000 × g für 1 min zentrifugieren.
6. Legen Sie die DNA-Adsorptionssäule in ein sauberes 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, pipettieren Sie direkt 100 μl DNA-Elutionspuffer auf die Säulenmembran, inkubieren Sie 1 Minute lang bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie sie dann 1 Minute lang bei 6.000 × g zur Eluierung.
   HINWEIS: Die Elution mit 100 μl (statt 200 μl) erhöht die endgültige DNA-Konzentration im Eluat, verringert aber auch die Gesamtausbeute der DNA. Um die DNA-Ausbeute zu maximieren, wiederholen Sie die Elution einmal, wie in Schritt 2.8 beschrieben.
7. Lagern Sie die DNA-Proben bei 4 °C (bis zu 1 Woche) bzw. -80 °C für die Langzeitlagerung.

3. Nachweis der DNA-Konzentration

1. Bestimmen Sie die Werte von OD 260 und OD 280, um die DNA-Reinheit und die Nukleinsäurekonzentration mit dem Mikroplatten-Reader zu vergleichen. Wiederholen Sie dies dreimal für jede Probe.
2. Bestimmen Sie die Konzentration der extrahierten DNA mit einem Fluorometer mit dem Begleitkit mit drei Replikaten für jede Probe.
   1. Nehmen Sie 190 μl Arbeitslösung in zwei 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen, nehmen Sie jeweils 10 μl von Standard #1 und Standard #2, fügen Sie sie zu den Arbeitslösungen hinzu und halten Sie sie mindestens 15 Minuten lang lichtgeschützt.
      HINWEIS: Standard #1 und Standard #2 sind genau für eine bestimmte DNA-Konzentration kalibriert. Standardlösungen sollten genau konfiguriert werden, um die Bildung einer genauen Standardkurve zu gewährleisten. Standard #1 ist eine 0,2 ng/μl doppelsträngige DNA (dsDNA)-Probe; Standard #2 ist 2.000 ng/μL. Die Arbeitslösung ist ein Farbstoff, der spezifisch an dsDNA bindet.
   2. Nehmen Sie 2 μl Test-DNA und mischen Sie sie mit 198 μl Arbeitslösung in einem 0,5-ml-Zentrifugenröhrchen und halten Sie sie mindestens 15 Minuten lang von Licht fern.
      HINWEIS: Wenn die DNA-Konzentration niedrig ist, fügen Sie 5 μl Test-DNA mit 195 μl Arbeitslösung hinzu.
   3. Schalten Sie das Gerät nach 15 Minuten ein und wählen Sie dsDNA-Konzentrationsmessung | Große Reichweite. Testen Sie zuerst Standard #1 und dann Standard #2, um die Standardkurve zu erhalten.
      HINWEIS: Die Standardlösung muss am selben Tag nach der Konfiguration verwendet werden. Wenn Sie es zu lange belassen, führt dies zu einem großen Fehler in der Standardkurve.
   4. Legen Sie die zu testenden Proben nacheinander in die Assay-Wells, stellen Sie das DNA-Spike-Volumen auf 2 μl ein, wiederholen Sie die Messung dreimal, nehmen Sie den Durchschnittswert und zeichnen Sie auf.

4. PCR und elektrophoretischer Nachweis

HINWEIS: Die mitochondriale CO-Gensequenz mit einer Länge von 278 bp wurde für die PCR-Amplifikation mit dem Forward-Primer C1-J-2495: CAGCTACTTTATGAGCTTTAGG und dem Reverse-Primer C1-N-2800: CATTTCAAGCTGTGTAAGCATC⁸ entnommen, und dann wurde eine 2%ige Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt, um den Amplifikationseffekt und die Länge der Amplifikationsprodukte zu überprüfen.

1. Richten Sie 20 μl des PCR-Amplifikationssystems ein, indem Sie 10 μl 2x Taq-Mix, 1 μl jedes Primers, 5 μl ddH₂O und 3 μl Template-DNA hinzufügen; 10 s in einer Zentrifuge gut mischen.
2. Verwenden Sie die folgenden PCR-Zyklusparameter: Prädenaturierung 95 °C für 10 min; Denaturierung 95 °C für 30 s, Glühen 48 °C für 30 s, Ausdehnung 72 °C für 45 s für insgesamt 40 Zyklen; und Endausdehnung 72 °C für 10 min.
3. Setzen Sie die Produkte nach der PCR einer 2%igen Agarose-Gelelektrophorese aus und legen Sie sie nach der Elektrophorese zur Photoanalyse auf ein Gel-Imaging-System.

Ergebnisse

Wir verwendeten ein Mikroplatten-Reader, um die Werte von OD260 und OD280 der extrahierten DNA-Lösung zu messen, und erhielten dann die OD260/OD280-Werte, um die Reinheit der DNA zu bewerten. Der OD260/OD280 aller frischen Proben und der alten Probe 1 war größer als 2. Der OD260/OD280 der alten Stichprobe 2 hatte einen Maximalwert von 2,187, obwohl der Durchschnitt bei 1,753 lag, und seine drei Messungen schwankten stark aufgrund der geringen (≤0,01) Werte sowohl des OD280 als auch des OD280 (Tabelle 1

Diskussion

Die DNA-Extraktion ist das wichtigste Glied bei der molekularen Identifizierung nekrophiler Fliegen, und die Extraktionsmethode und die Qualität der extrahierten DNA wirken sich direkt auf den späteren Nachweis aus. In diesem Experiment haben wir erfolgreich DNA von nekrophilen Fliegen extrahiert, indem wir ein gängiges Blutkit verwendet haben, ohne dass ein spezielles Insekten-DNA-Extraktionskit gekauft werden musste, was die Extraktion von Insekten-DNA erleichtert.

Die Oberfläche der Fli...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer AE	Qiagen	172026832	DNA elution buffer
Buffer AL	Qiagen	172028374	lysis buffer
Buffer ATL	Qiagen	172028162	tissue lysis buffer
Buffer AW1	Qiagen	172028760	protein removal buffer
Buffer AW2	Qiagen	57203108	desalination buffer
C1-J-2495	Taihe Biotechnology	TW21109216	forword primer
C1-N-2800	Taihe Biotechnology	TW21109217	reverse primer
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
DNeasy Mini spin column	Qiagen	166050343	DNA adsorption column
Dry Bath Incubator	Miulab	DKT200-2D	used for heating
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	Qiagen	172026218	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Qubit 3.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	2321611188
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Standard#1	Thermo Fisher Scientific	2342797
Standard#2	Thermo Fisher Scientific	2342797
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Working Solution	Thermo Fisher Scientific	2342797