DNA抽出と古い屍好性ハエサンプルと新鮮なハエサンプルの比較

要約

この記事では、改変された一般的なDNA抽出キットを使用した、新鮮で古い屍好性ハエDNA抽出のプロトコルについて説明します。

要約

Chrysomya megacephalaのサンプルの合計5つのサンプル(新鮮なサンプル3つ、アルコールで2年間保存されたサンプル、および光のみから保護された乾燥密閉されたストレージで2年間保存されたサンプル)が選択されました。まず、血液DNA抽出キットを使用して、胸部組織からDNAを抽出しました。次に、DNAの純度と濃度をマイクロプレートリーダーと蛍光光度計を用いて調べました。最後に、抽出されたDNAのPCR増幅および電気泳動を、ミトコンドリアのCO I遺伝子配列に位置する屍好性のハエ特異的プライマーを用いて行った。その結果、すべてのサンプルのDNA純度が2.0より大きいことが示されました。DNA濃度は、新しいサンプル>アルコール保存された古いサンプル、>未処理の古いサンプルの順であることが観察されました。すべてのサンプルは、PCR増幅後に特定の電気泳動バンドを持っていました。結論として、血液DNA抽出キットを使用して屍親死性のハエからDNAを成功裏に抽出でき、新鮮なハエサンプルのDNA濃度は古いハエサンプルのDNA濃度よりも高くなります。ハエはアルコールに長期間保存できます。

概要

死亡時刻の推定は、常に司法実務において解決すべき重要かつ困難な問題の1つでした。法医学の実践では、刑事事件の場合、死後の間隔を決定することは、犯罪の時間を推測し、容疑者を固定し、捜査の範囲を狭める上で重要な役割を果たします。死亡時刻を推定する従来の方法は、主に死後早期の現象に基づいており、一般的には24時間以内の死亡時刻を推測するためにのみ使用できます。しかし、死の長い時間は死後の現象によって決定することはできません。現在、法医学界では、法医学昆虫学が死亡のより長い時間を推測する効果的な方法になる可能性があることが一般的に認識されています。

屍食性昆虫は、死体を食べる幼虫にちなんで名付けられました。その中で、死体が存在するときはいつでも、成虫の屍屍ハエが最初に死体に到達し、卵や幼虫を産みます。幼虫は死体組織を食べて成熟し、蛹になり、蛹は成虫に巣立ちます。屍親死性のハエは、その定期的なライフサイクルと地理的分布、たとえば死亡時刻を差し引いて死亡場所を決定するため、法医学の実践において大きな役割を果たします^1,2。しかし、法医学の実践における屍姦ハエの使用に対する障壁は、種の識別です。形態学的方法は、屍姦ハエの種同定のための権威ある方法として今でも使用されています。しかし、形態学的種の同定には、高度な昆虫の完全性が必要です。ハエが異なる発達段階にあったり、環境の選....

プロトコル

注:このプロトコルでは、 C. megacephala サンプルの合計5つのサンプルを使用しました-3つの新鮮なサンプル(フレッシュ1、フレッシュ2、フレッシュ3)、1つのサンプルをアルコールに2年間保存(古い1)、および1つのサンプルを光からのみ保護された2年間の乾燥密封保存(古い2)で保存しました。サンプルは、実験要件に従ってラベル付けする必要があります。

1. 一般的なサンプルの保管と調製

1. サンプルの選択と調製
   注:酢酸エチルを適用してネクロファガスフライを実行するときは、必ずヒュームフードで作業してください。計量する前に、フライの表面から液体を取り除きます。
   1. 新鮮なサンプル:採取した3つのハエのサンプルを酢酸エチルで殺した後、ガスバイアルに入れます。サンプルの重量を量り、Fresh 1、Fresh 2、Fresh 3 と名前を付けて、すぐに実験に使用します。
      注:このプロトコルの新鮮なハエサンプルの質量は、56.8 mg、49.3 mg、および52.1 mgでした。
   2. 古いサンプル1:酢酸エチルによって死滅したハエのサンプルを取り出し、アルコールを充填した遠心分離管に2年間保管し、室温で光から保護された密閉容器で保管します。表面の液体を濾紙で吸着した後、サンプルを計量します。それを古い1と呼んでください。
      注:このプロトコルでは、Old 1の質量....

ディスカッション

DNA抽出は、屠姦バエの分子同定における最も重要なリンクであり、その抽出方法と抽出されたDNAの品質は、その後の検出に直接影響します。この実験では、昆虫のDNA抽出キットを特別な購入することなく、一般的な血液キットを使用して屍妄のハエからDNAを抽出することに成功しました。

ハエの表面はキチン質が豊富で、特に幼虫と蛹の段階では表皮のキチンが60〜70%に.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer AE	Qiagen	172026832	DNA elution buffer
Buffer AL	Qiagen	172028374	lysis buffer
Buffer ATL	Qiagen	172028162	tissue lysis buffer
Buffer AW1	Qiagen	172028760	protein removal buffer
Buffer AW2	Qiagen	57203108	desalination buffer
C1-J-2495	Taihe Biotechnology	TW21109216	forword primer
C1-N-2800	Taihe Biotechnology	TW21109217	reverse primer
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
DNeasy Mini spin column	Qiagen	166050343	DNA adsorption column
Dry Bath Incubator	Miulab	DKT200-2D	used for heating
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	Qiagen	172026218	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Qubit 3.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	2321611188
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Standard#1	Thermo Fisher Scientific	2342797
Standard#2	Thermo Fisher Scientific	2342797
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Working Solution	Thermo Fisher Scientific	2342797