A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול למיצוי DNA של זבוב נקרופילי טרי וישן באמצעות ערכת מיצוי DNA משותפת שונה.

Abstract

בסך הכל נבחרו חמש דגימות של Chrysomya megacephala - שלוש דגימות טריות, דגימה אחת שאוחסנה באלכוהול במשך שנתיים, ודגימה אחת שאוחסנה באחסון אטום יבש במשך שנתיים המוגנת מפני אור בלבד - כדי לחקור אם ערכת מיצוי DNA בדם יכולה להפיק DNA מזבובים נקרופיליים ולקבוע אם אלכוהול יכול להאריך את שימור הדנ"א של זבובים נקרופיליים. ראשית, ערכת מיצוי הדנ"א בדם שימשה להפקת דנ"א מרקמות בית החזה שלהם. לאחר מכן, טוהר הדנ"א וריכוזו נבדקו באמצעות קורא מיקרו-צלחות ופלואורומטר. לבסוף, הגברה PCR ואלקטרופורזה של הדנ"א שחולץ נעשו עם פריימרים ספציפיים לזבוב נקרופילי הממוקם ברצף הגן CO I המיטוכונדריאלי. התוצאות הראו כי טוהר הדנ"א של כל הדגימות היה גדול מ-2.0. ריכוז הדנ"א נצפה בסדר הבא: דגימות טריות > דגימות ישנות שהשתמרו באלכוהול > דגימות ישנות שלא טופלו. לכל הדגימות היו רצועות אלקטרופורטיות ספציפיות לאחר הגברה של PCR. לסיכום, ניתן להשתמש בערכת מיצוי DNA בדם כדי לחלץ דנ"א מזבובים נקרופיליים בהצלחה, וריכוז הדנ"א של דגימות זבובים טריים גדול מזה של דגימות זבובים ישנים. הזבובים יכולים להיות מאוחסנים באלכוהול במשך זמן רב.

Introduction

היקש זמן המוות היה מאז ומתמיד אחד הנושאים המרכזיים והקשים לפתרון בפרקטיקה השיפוטית. בפרקטיקה של מדע פורנזי, עבור תיק פלילי, קביעת מרווח לאחר המוות משחקת תפקיד מכריע בהסקת זמן הפשע, נעילת החשוד וצמצום היקף החקירה. שיטות מסורתיות להסיק את זמן המוות מבוססות בעיקר על תופעות מוקדמות לאחר המוות, אשר בדרך כלל ניתן להשתמש בהן רק כדי להסיק את זמן המוות בתוך 24 שעות. עם זאת, זמן המוות הארוך אינו יכול להיקבע על ידי תופעות שלאחר המוות. כיום מקובל בקהילת המדע הפורנזי כי לאנטומולוגיה משפטית יש פוטנציאל להיות שיטה יעילה להסיק זמן מוות ארוך יותר.

חרקים נקרופגיים נקראים על שם הזחלים שלהם הניזונים מגוויות. ביניהם, בכל פעם שיש גופה, הזבובים הנקרופיליים הבוגרי....

Protocol

הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש בסך הכל בחמש דגימות של C. megacephala – שלוש דגימות טריות (Fresh 1, Fresh 2 ו-Fresh 3), דגימה אחת שאוחסנה באלכוהול במשך שנתיים (Old 1), ודגימה אחת שאוחסנה באחסון יבש אטום למשך שנתיים כשהיא מוגנת מפני אור בלבד (Old 2). הדגימות חייבות להיות מסומנות בהתאם לדרישות הניסוי.

1. אחסון דגימות כללי והכנות

  1. בחירת דוגמאות והכנתן
    הערה: הקפד לעבוד במכסה האדים בעת מריחת אתיל אצטט לביצוע זבובים נקרופגיים. הסר את הנוזל מפני השטח של הזבוב לפני השקילה.
    1. דגימות טריות: הניחו שלוש דגימות זבובים שנאספו בבקבוקוני גז לאחר שהרגו אותן עם אתיל אצטט. שקלו וקראו לדגימות בשם Fresh 1, Fresh 2 ו-Fres....

תוצאות

השתמשנו בקורא מיקרו-צלחות כדי למדוד את הערכים של OD260 ו-OD280 של תמיסת הדנ"א שחולצה, ולאחר מכן קיבלנו את ערכי OD260/OD280 כדי להעריך את טוהר הדנ"א. OD260/OD280 של כל הדגימות הטריות והמדגם הישן 1 היה גדול מ- 2. הערך המרבי של OD260/OD280 של מדגם 2 הישן היה 2.187 למרות שהממוצע היה 1.753, ושלוש המדידות שלו השתנו מאוד בגלל הער.......

Discussion

מיצוי DNA הוא החוליה הקריטית ביותר בזיהוי מולקולרי של זבובים נקרופיליים, ושיטת המיצוי שלו ואיכות הדנ"א המופק משפיעים ישירות על הגילוי לאחר מכן. בניסוי זה חילצנו בהצלחה דנ"א מזבובים נקרופיליים באמצעות ערכת דם נפוצה, ללא צורך ברכישת ערכת מיצוי דנ"א מיוחדת של חרקים, מה שמקל על מיצוי דנ"א של חרקי.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82060341,81560304) ועל ידי פרויקט המחקר המדעי של פלטפורמת החדשנות האקדמית של מחוז האינאן (YSPTZX202134).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Buffer AEQiagen172026832DNA elution buffer
Buffer ALQiagen172028374lysis buffer
Buffer ATLQiagen172028162tissue lysis buffer
Buffer AW1Qiagen172028760protein removal buffer
Buffer AW2Qiagen57203108desalination buffer
C1-J-2495Taihe BiotechnologyTW21109216forword primer
C1-N-2800Taihe BiotechnologyTW21109217reverse primer
D2000 DNA ladderReal-Times(Beijing) BiotechnologyRTM415Measure the position of electrophoretic bands
DNeasy Mini spin columnQiagen166050343DNA adsorption column
Dry Bath IncubatorMiulabDKT200-2Dused for heating
MIX-30S Mini MixerMiulabMUC881206oscillatory action
Proteinase KQiagen172026218Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Qubit 3.0 FluorometerThermo Fisher Scientific2321611188
Speed Micro-CentrifugeScilogex9013001121centrifuge
Standard#1Thermo Fisher Scientific2342797
Standard#2Thermo Fisher Scientific2342797
Tanon 3500R Gel ImagerTanon16T5553R-455gel imaging
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Thermo CyclerZhuhai HemaVRB020Aordinary PCR
Working SolutionThermo Fisher Scientific2342797

References

  1. Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. Forensic entomology: applications and limitations. Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).
  2. Wydra, J., Matuszewski, S. T....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

207Chrysomya megacephalaDNADNADNAPCRCOI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved