DNA 추출 및 오래된 네크로필릭 플라이 샘플과 신선한 네크로필릭 플라이 샘플 간의 비교

요약

이 기사에서는 수정된 일반 DNA 추출 키트를 사용하여 신선하고 오래된 네크로필릭 파리 DNA 추출을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

Chrysomya megacephala 검체 총 5개 검체(신선한 검체 3개, 알코올 속에 2년 동안 보관된 검체 1개, 빛만 차단된 건조 밀봉 보관 2년 보관 검체 1개)를 선정하여 혈액 DNA 추출 키트가 괴사파리의 DNA를 추출할 수 있는지 여부를 조사하고 알코올이 괴사파리의 DNA 보존을 연장할 수 있는지 여부를 확인했습니다. 먼저 혈액 DNA 추출 키트를 사용하여 흉부 조직에서 DNA를 추출했습니다. 그런 다음 마이크로플레이트 리더와 형광계를 사용하여 DNA 순도와 농도를 검사했습니다. 마지막으로, 추출된 DNA의 PCR 증폭 및 전기영동은 미토콘드리아 CO I 유전자 서열에 위치한 네크로필릭 플라이 특이적 프라이머로 수행되었습니다. 그 결과 모든 샘플의 DNA 순도가 2.0 이상인 것으로 나타났습니다. DNA 농도는 다음과 같은 순서로 관찰되었습니다 : 신선한 샘플 > 알코올로 보존 된 오래된 샘플 > 처리되지 않은 오래된 샘플. 모든 샘플은 PCR 증폭 후 특정 전기영동 밴드를 가졌습니다. 결론적으로, 혈액 DNA 추출 키트를 사용하여 괴사 파리에서 DNA를 성공적으로 추출할 수 있으며, 신선한 파리 샘플의 DNA 농도는 오래된 파리 샘플의 DNA 농도보다 높습니다. 파리는 알코올에 오랫동안 보관할 수 있습니다.

서문

사망 시각을 추정하는 것은 항상 사법 실무에서 해결해야 할 핵심적이고 어려운 문제 중 하나였습니다. 법의학 실무에서 형사 사건의 경우 사후 검시 간격을 결정하는 것은 범죄 시간을 추론하고 용의자를 확보하며 조사 범위를 좁히는 데 중요한 역할을 합니다. 사망 시간을 추론하는 전통적인 방법은 주로 초기 사후 현상에 기반을 두고 있으며, 일반적으로 24시간 이내의 사망 시간을 추론하는 데만 사용할 수 있습니다. 그러나 죽음의 긴 시간은 사후 현상에 의해 결정될 수 없다. 이제 법의학계에서는 법곤충학이 더 긴 사망 시간을 추론하는 효과적인 방법이 될 수 있는 잠재력을 가지고 있다는 것이 일반적으로 인정되고 있습니다.

Necrophagous 곤충은 시체를 먹는 유충의 이름을 따서 명명되었습니다. 그 중 사체가 있을 때마다 성충 괴사파리가 가장 먼저 사체에 도달하여 알이나 유충을 낳습니다. 유충은 시체 조직을 먹고 번성하여 번데기로 성장한 후 성충으로 번식합니다. 네크로필릭 파리는 규칙적인 생활 주기와 지리적 분포(예: 사망 시간 공제 및 사망 장소 결정) 때문에 법의학 실습에서 큰 역할을 합니다 ^1,2. 그러나 법의학 실습에서 괴사 파리를 사용하는....

프로토콜

참고: 이 프로토콜에는 총 5개의 C. megacephala 샘플 샘플이 사용되었으며, 3개의 신선한 샘플(Fresh 1, Fresh 2 및 Fresh 3), 1개의 샘플은 2년 동안 알코올에 보관(Old 1), 1개의 샘플은 빛으로부터 보호되는 2년 동안 건조 밀봉 보관(Old 2)되었습니다. 샘플은 실험 요구 사항에 따라 라벨을 부착해야 합니다.

1. 일반 시료 보관 및 준비

1. 시료 선택 및 준비
   알림: 괴사파리를 처형하기 위해 에틸 아세테이트를 적용할 때 흄 후드에서 작업해야 합니다. 무게를 측정하기 전에 플라이 표면에서 액체를 제거하십시오.
   1. 신선한 샘플: 수집된 3개의 플라이 샘플을 에틸 아세테이트로 죽인 후 가스 바이알에 넣습니다. 샘플을 계량하고 이름을 Fresh 1, Fresh 2 및 Fresh 3으로 지정하고 실험에 즉시 사용합니다.
      참고: 이 프로토콜의 신선한 파리 샘플의 질량은 56.8mg, 49.3mg 및 52.1mg이었습니다.
   2. 오래된 샘플 1: 에틸 아세테이트에 의해 사멸된 파리 샘플을 꺼내 알코올이 채워진 원심분리 튜브에 2년 동안 밀폐 밀봉하고 실온에서 빛으로부터 보호합니다. 여과지로 표면 액체를 흡착 한 후 샘플....

토론

DNA 추출은 괴사파리의 분자 식별에 가장 중요한 연결 고리이며, 추출 방법과 추출된 DNA의 품질은 후속 검출에 직접적인 영향을 미칩니다. 이 실험에서는 곤충 DNA 추출이 더 쉬워지는 특별한 곤충 DNA 추출 키트를 구입할 필요 없이 일반 혈액 키트를 사용하여 괴사파리에서 DNA를 추출하는 데 성공했습니다.

파리의 표면은 키틴질이 풍부하며, 특히 표피 키틴이 60-70%에 달하는 유?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buffer AE	Qiagen	172026832	DNA elution buffer
Buffer AL	Qiagen	172028374	lysis buffer
Buffer ATL	Qiagen	172028162	tissue lysis buffer
Buffer AW1	Qiagen	172028760	protein removal buffer
Buffer AW2	Qiagen	57203108	desalination buffer
C1-J-2495	Taihe Biotechnology	TW21109216	forword primer
C1-N-2800	Taihe Biotechnology	TW21109217	reverse primer
D2000 DNA ladder	Real-Times(Beijing) Biotechnology	RTM415	Measure the position of electrophoretic bands
DNeasy Mini spin column	Qiagen	166050343	DNA adsorption column
Dry Bath Incubator	Miulab	DKT200-2D	used for heating
MIX-30S Mini Mixer	Miulab	MUC881206	oscillatory action
Proteinase K	Qiagen	172026218	Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Qubit 3.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	2321611188
Speed Micro-Centrifuge	Scilogex	9013001121	centrifuge
Standard#1	Thermo Fisher Scientific	2342797
Standard#2	Thermo Fisher Scientific	2342797
Tanon 3500R Gel Imager	Tanon	16T5553R-455	gel imaging
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Taq Mix Pro	Monad	00007808-140534	PCR Mix
Thermo Cycler	Zhuhai Hema	VRB020A	ordinary PCR
Working Solution	Thermo Fisher Scientific	2342797