Este estudio desarrolló un ensayo para el cribado de alto rendimiento contra Mycobacterium abscessus con una cepa doble reportera de reciente creación, utilizando fluorescencia y luminiscencia para evaluar rápidamente la viabilidad bacteriana. Este protocolo será relevante para los investigadores que buscan cribar nuevos fármacos contra esta bacteria resistente a los fármacos.
Las infecciones por Mycobacterium abscessus (Mab) son difíciles de tratar debido a la alta resistencia intrínseca a los medicamentos, comparable a la tuberculosis multirresistente. Los tratamientos son extremadamente ineficaces y se basan en un régimen de múltiples fármacos, lo que resulta en un bajo cumplimiento por parte del paciente. En consecuencia, se insta a la comunidad científica a identificar fármacos nuevos y eficaces para tratar estas infecciones. Una de las estrategias empleadas para este fin es la readaptación de fármacos, es decir, el proceso de identificación de nuevas oportunidades terapéuticas para los fármacos existentes en el mercado, evitando el tiempo necesario para establecer los perfiles farmacocinéticos y de seguridad de los nuevos fármacos. Dado que la mayoría de los estudios sobre el desarrollo de fármacos contra el Mab se basan en métodos tradicionales y lentos, se desarrolló un ensayo para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra las micobacterias utilizando una cepa de Mab doble reportera desarrollada internamente. Mediante el uso de robótica de manejo de líquidos, microscopía automatizada y análisis, junto con cepas reporteras dobles desarrolladas internamente, la viabilidad bacteriana se puede medir rápidamente utilizando dos lecturas diferentes, luminiscencia y fluorescencia, sin agregar reactivos ni realizar ningún paso adicional. Esto reduce el tiempo y la variabilidad entre ensayos, una gran ventaja para los cribados de alto rendimiento. El protocolo descrito se validó mediante el cribado de una biblioteca de 1280 compuestos. Los resultados obtenidos fueron corroborados por la literatura, con detección eficiente de compuestos activos. De esta forma, este trabajo cumplió el objetivo de dotar al campo de una nueva herramienta que ayudara a combatir esta bacteria extremadamente resistente a los fármacos.
Mycobacterium abscessus (Mab) es un patógeno oportunista responsable de infecciones pulmonares, especialmente en personas con fibrosis quística y otros trastornos pulmonares. Las infecciones causadas por el Mab son infamemente difíciles de tratar debido a la exquisita resistencia intrínseca a los medicamentos, comparable a la tuberculosis multirresistente1. Los fármacos disponibles son en gran medida ineficaces debido a la envoltura celular micobacteriana altamente impermeable y a un genoma que codifica varias enzimas que desactivan losantibióticos. Por lo tanto, el tratamiento incluye la combinación de varios medicamentos que tarda meses o años. Este desafiante régimen de múltiples fármacos, combinado con un bajo cumplimiento por parte de los pacientes, da como resultado una tasa de curación promedio del 30 % al 50 %3. Además, la prevalencia de infecciones pulmonares causadas por micobacterias no tuberculosas ha aumentado en las últimas décadas, incluidas las causadas por Mab 1,4. En consecuencia, la comunidad científica está compitiendo para desarrollar nuevos compuestos para tratar las infecciones por Mab.
Una de las estrategias que se persiguen con este objetivo es la reutilización de fármacos, es decir, el proceso de identificación de nuevas oportunidades terapéuticas para los fármacos existentes. De este modo, se evita el mayor reto que acompaña a la fase de descubrimiento y desarrollo de un nuevo fármaco: el tiempo5. Este sencillo concepto aprovecha los perfiles farmacocinéticos y de seguridad ya establecidos de varios fármacos para reducir los costes de desarrollo y acortar el tiempo que se tarda en llevar un fármaco desde el laboratorio hasta la cabecera delpaciente. Por lo tanto, se han compilado bibliotecas que combinan cientos o miles de dichos compuestos, lo que permite a los investigadores probar rápidamente la posibilidad de reutilizar medicamentos contra el patógeno de interés.
La mayoría de los estudios sobre el desarrollo de fármacos contra el Mab se basan en un ensayo tradicional que evalúa la actividad in vitro de un compuesto frente a las micobacterias, es decir, las unidades formadoras de colonias7. A pesar de su precisión, este procedimiento requiere mucho tiempo, y rápidamente se vuelve inviable cuando alguien pretende probar bibliotecas que contienen miles de compuestos. Con este fin, se han integrado en el desarrollo de fármacos cribados de alto rendimiento (HTS), ensayos robustos que aprovechan la robótica y los dispositivos de manipulación de líquidos, lo que permite cribar rápidamente miles de compuestos en paralelo8. Por lo general, esto se hace probando una sola concentración inicialmente, utilizando placas de microtitulación de formatos de 96, 384, 1536 o 3456 pocillos, que actúan como punto de partida para identificar los resultados y optimizarlos aún más en el proceso para su uso clínico.
Los ensayos basados en reporteros proporcionan una ventaja significativa para la robustez de HTS debido a su simplicidad y sensibilidad en comparación con otros ensayos basados en colorantes y absorbancias 7,9. Sin embargo, hasta donde sabemos, solo unos pocos estudios han optimizado un cribado de alto rendimiento contra Mab9.
Recientemente, nuestro laboratorio ha desarrollado cepas reporteras dobles capaces de emitir luminiscencia y fluorescencia10 de forma concomitante. La Mab operon_mScarlet es una de esas variedades. Es autoluminiscente debido a la expresión del operón LuxABCDE , que incluye una luciferasa bacteriana (por expresión de los genes luxAB ) y un sustrato de aldehído de cadena larga (por expresión de los genes luxCDE ). Por otro lado, la lectura fluorescente se obtiene a través de la expresión de una proteína fluorescente roja recientemente desarrollada, mScarlet, que supera a las proteínas eGFP y mCherry más utilizadas, proporcionando una señal más potente11. El uso de esta cepa nos permite evaluar la viabilidad bacteriana en cultivo líquido midiendo la señal luminiscente en un lector de microplacas sin añadir reactivos ni realizar pasos adicionales. En términos de detección, la fluorescencia intrínseca permite la visualización al microscopio en células vivas o fijas sin utilizar colorantes ni anticuerpos. Tener una sola cepa con ambas lecturas proporciona a los investigadores una ventaja significativa cuando se utiliza en ensayos HTS: la variabilidad reducida entre ensayos con diferentes lecturas, ya que no es necesario intercambiar cepas en función de la naturaleza del ensayo.
Por lo tanto, este trabajo desarrolló un ensayo de alto rendimiento contra Mab utilizando una deformación doble reportera diseñada internamente (Figura 1). Esto permitió una evaluación rápida de la actividad in vitro de los fármacos 1280 destinados a la reutilización utilizando una biblioteca comercial (véase la Tabla de Materiales). En primer lugar, las actividades se evaluaron en un ensayo de cultivo en caldo utilizando luminiscencia y, en segundo lugar, utilizando macrófagos infectados con Mab aprovechando la señal fluorescente, emulando mejor el proceso de infección observado in vivo12.
Figura 1: Resumen gráfico del protocolo establecido. El actor clave en este cribado es una cepa de micobacterias doble reportera desarrollada internamente , que se utiliza en todos los experimentos. En primer lugar, utilizando un dosificador de reactivos y bacterias planctónicas, se realiza un cribado inicial probando los compuestos en una sola concentración. Los resultados identificados continúan en el ensayo de validación, donde se prueban tres concentraciones diferentes. Ambos experimentos se realizan utilizando la lectura luminiscente. Los resultados validados continúan en el ensayo de infección, donde también se prueban tres concentraciones diferentes, y los macrófagos derivados de la médula ósea se infectan en MOI 1. Un sistema de imágenes de alto contenido adquiere la señal fluorescente bacteriana y se utiliza un software de análisis para evaluar la carga intracelular a través de la fórmula Mycoload. El número de compuestos se reduce a medida que aumenta la complejidad del ensayo. Creado con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Local de Ética Animal de i3S y autorizados por la Dirección General de Alimentación y Veterinaria de la Autoridad Portuguesa (DGAV), siguiendo la Directiva del Consejo Europeo (2010/63/UE) y la ley portuguesa (DL 113/2013) para el bienestar animal en experimentación.
1. Evaluación del factor Z'
NOTA: Para evaluar el rendimiento de un ensayo HTS, se pueden determinar varios parámetros. El parámetro más utilizado es el factor primo Z (factor Z'). Esta métrica mide el tamaño del efecto estadístico de un experimento determinado, lo que indica qué tan separados están los controles positivos y negativos. Si un factor Z' oscila entre 0,5 y 1, la separación entre ambas poblaciones es excelente, y estas condiciones se pueden utilizar en el ensayo HTS. Si Z' < 0,5, la separación es solo marginal y no se recomienda realizar el cribado13. Para ello, se diseñó un experimento utilizando la mitad de una placa con bacterias no tratadas y la otra mitad con un testigo positivo para calcular el factor Z' (Figura 1 suplementaria).
2. Cribado de éxitos en la biblioteca
NOTA: Los primeros cribados se realizaron contra bacterias que crecían en cultivo líquido. La configuración fue diseñada para placas de 384 pocillos con 30 μL de volumen final. Cada placa contenía pocillos en blanco (solo medio de crecimiento líquido), controles negativos (bacterias no tratadas) y control de solvente (bacterias más solvente de compuesto, en este caso, DMSO; Figura complementaria 2). Los compuestos o el disolvente se añadieron a la placa a 2 veces la concentración final deseada, y las bacterias se añadieron 1:1 (diluyendo todo a la mitad).
3. Análisis de datos de detección de resultados
NOTA: Para identificar los aciertos con los datos de luminiscencia adquiridos, los valores deben normalizarse al disolvente en el que se disuelven los compuestos y, si se produce, al efecto de borde verificado en las placas de 384 microtítulos.
4. Ensayo de validación de aciertos
NOTA: Después de identificar los resultados, estos deben validarse utilizando diferentes concentraciones. El ensayo de validación utiliza una configuración similar con los mismos controles, pero cada golpe se someterá a diluciones en serie 1:2. Para este ensayo, se utilizaron tres concentraciones: 13,3 μM, 6,66 μM y 3,3 μM. Los controles de solvente contendrán el mismo % de solvente que cada pozo compuesto (Figura suplementaria 3).
5. Ensayo de infección
NOTA: Mab es un patógeno facultativo intracelular, por lo que la actividad antimicrobiana y la toxicidad del huésped deben determinarse en ensayos de infección. Para ello, los macrófagos derivados de la médula ósea (BMM) se infectaron con Mab y se trataron con los hits validados en el paso 4 a diferentes concentraciones. Cada ensayo incluyó blanco (solo agua), controles negativos (macrófagos infectados no tratados), controles positivos (macrófagos infectados tratados con un antibiótico eficaz), controles con disolventes (en este caso, DMSO) y los compuestos a probar en tres concentraciones: 13,3 μM, 6,66 μM y 3,3 μM (Figura complementaria 4).
6. Análisis de imágenes
NOTA: El análisis de imágenes se realiza con el software de análisis, que es el mismo que el sistema de imágenes de alto contenido utilizado para adquirir las imágenes. Se debe crear una canalización de análisis utilizando imágenes de muestra (Figura complementaria 5). Posteriormente, se aplicará a todo el pozo (57 FOV) y al conjunto de datos (todas las placas). El software de análisis sigue una secuencia lógica de pasos, comenzando con la segmentación de las diferentes regiones de interés (núcleos, citoplasma, células y bacterias), relacionándolas (por ejemplo, bacterias dentro de las células) y luego extrayendo las propiedades morfológicas y de intensidad (por ejemplo, área, intensidad). A continuación se describen los pasos esenciales del análisis de imágenes. El protocolo completo utilizado se puede encontrar en la Figura complementaria 5.
Evaluación del factor Z'
La Figura 2 muestra los datos de uno de los dos experimentos realizados para calcular el factor Z'. El control positivo fue claritromicina a 4 μg/mL. Ambos experimentos arrojaron factores Z' de 0,64 y 0,62, lo que significa que las condiciones y la lectura utilizadas para este ensayo se pueden aplicar al ensayo de cribado posterior (Z' > 0,5). No obstante, se calculó el factor Z' para todos los experimentos restantes (ensayo de infección) para controlar el rendimiento de cada experimento.
Como prueba de concepto del ensayo HTS diseñado, se probó una biblioteca de compuestos destinados a la reutilización de fármacos. Comprende 1280 moléculas diversas y pequeñas, el 95% de las cuales son medicamentos aprobados por la FDA y la EMA. Estas moléculas ofrecen una alta diversidad química y farmacológica.
Figura 2: Resultados de la evaluación del factor Z'. Mab a 2,5 x 105 UFC/mL se incubó con y sin claritromicina a 4 μg/mL durante 48 h a 37 °C. Después del período de incubación, se midió la luminiscencia para evaluar la viabilidad de las micobacterias. El gráfico muestra los valores de luminiscencia individuales de las micobacterias viables tratadas y no tratadas en un experimento independiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Proyección de éxitos en la biblioteca
Todos los compuestos se probaron a 6,66 μM frente a Mab. Debido al tamaño de la biblioteca, los compuestos se dividieron en cuatro placas de 384 pocillos de microtitulación diferentes (Figura 3A-D). Los resultados se normalizaron tanto para el solvente como para el efecto de borde verificado.
En este ensayo de cribado, se identificaron treinta y tres aciertos, treinta de los cuales disminuyeron significativamente la emisión de luminiscencia, reduciendo la viabilidad de las micobacterias (Figura 3). Curiosamente, tres compuestos condujeron a una mayor emisión de luminiscencia, posiblemente relacionada con un mayor metabolismo o proliferación bacteriana (Figura 3). Los 33 resultados se llevaron al ensayo de validación, incluidos los tres compuestos que aumentaron la luminiscencia, para probar si se mantendría este perfil.
Figura 3: Resultados del cribado en la biblioteca. (A-D) Mab a 2,5 x 105 UFC/mL se incubó con 1280 compuestos a 6,66 μM durante 48 h a 37 °C. Después de la incubación, se midió la luminiscencia para evaluar la viabilidad de las micobacterias. Los gráficos muestran la RLU de un experimento independiente, presentada como unidades arbitrarias después de la normalización del efecto solvente y del borde. Se calculó la RLU AVG y su SD correspondiente para cada placa para determinar un umbral (en gris; AVG ± 3SD). Los símbolos redondos representan un compuesto probado. En azul, cualquier compuesto fuera de ese umbral se considera un éxito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Ensayo de validación de aciertos
Las concentraciones utilizadas para este ensayo fueron 13,3 μM, 6,66 μM y 3,3 μM. Cada compuesto se probó por duplicado para aumentar la robustez.
Es importante destacar que los compuestos 30, 31 y 32, previamente asociados con una RLU más alta (Figura 3A, C), mantuvieron este perfil, con más del 200% de viabilidad micobacteriana lograda en los pozos tratados con el compuesto 32 (Figura 4).
Los compuestos 20 y 33 se consideraron inactivos, ya que la viabilidad micobacteriana es cercana al 100% en todas las concentraciones analizadas (Figura 4).
Los compuestos 9 y 21 mostraron una inactividad similar en las dos concentraciones más bajas; sin embargo, a diferencia de 20, permanecen activos en el nivel más alto, 13,3 μM, y el compuesto 21 muestra una mayor potencia (Figura 4).
El compuesto 3 también muestra inactividad en la concentración más baja y una pérdida de actividad a 6,66 μM, aunque menor que el compuesto 21 (Figura 4). Solo en la concentración más baja, los compuestos 2, 7, 8, 10, 16, 18, 24 y 28 mostraron un menor potencial terapéutico. Sin embargo, 2, 10 y 28 aún conducen a un <50% de la viabilidad de las micobacterias.
A nivel mundial, los catorce compuestos restantes estaban activos en todas las concentraciones analizadas.
Figura 4: Resultados del ensayo de validación de aciertos. Se incubó Mab a 2,5 x 105 UFC/mL con cada golpe previamente identificado a 13,3 μM, 6,66 μM y 3,3 μM (1,3%, 0,7% y 0,3% de DMSO, respectivamente) durante 48 h a 37 °C. Después del período de incubación, se midió la luminiscencia para evaluar la viabilidad de las micobacterias. El gráfico muestra los porcentajes de micobacterias viables tratadas en relación con las micobacterias no tratadas de un experimento independiente, con cada compuesto probado por duplicado. Los símbolos redondos representan los duplicados de cada compuesto. Las barras representan el promedio de esos duplicados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Ensayo de infección
De los treinta y tres compuestos probados, se seleccionaron veintiocho para el ensayo de infección (Figura 4). Los compuestos 7, 8, 9, 20 y 33 no fueron seleccionados para este ensayo. Mientras que el 9, el 20 y el 33 quedaron fuera por su inactividad al validarse (Figura 4), los dos primeros quedaron fuera por razones técnicas. Sin embargo, estos compuestos fueron identificados como rifampicina y linezolid, antibióticos ya utilizados para el tratamiento de las infecciones por Mab12. Se identificaron todos los compuestos probados en el ensayo de infección y se enumeran en la Tabla 1. La actividad antimicrobiana de los compuestos contra los macrófagos infectados con Mab se evaluó utilizando la fluorescencia intrínseca de las bacterias como lectura.
Compuesto | Nombre | Compuesto | Nombre |
1 | Sulfathiazol | 18 | Cefuroxima |
2 | Ciprofloxacino | 19 | Rifaximina |
3 | Cefotaxima | 21 | Cefdinir |
4 | Daunorrubicina | 22 | Claritromicina |
5 | Doxorrubicina | 23 | Besifloxacina |
6 | Thiostrepton | 24 | Levofloxacino |
10 | Amikacina | 25 | Rifabutin |
11 | Moxalactama | 26 | Gatifloxacina |
12 | Sulfamethizole | 27 | Epirubicina |
13 | Sulfamonometoxina | 28 | Pamoato de pirvinio |
14 | Cefoxitin | 29 | Moxifloxacina |
15 | Novobiocina | 30 | Troleandomicina |
16 | Cefmetazol | 31 | Lincomicina |
17 | Roxitromicina | 32 | Espiramicina |
Tabla 1: Lista de los compuestos probados en el ensayo de infección. Los compuestos validados en el paso 4 se probaron en el ensayo de infección (paso 5).
La toxicidad de los compuestos frente a los macrófagos infectados con Mab fue el primer parámetro evaluado. El umbral establecido para considerar un compuesto como tóxico o no tóxico fue del 85% de macrófagos viables (Figura 5). De los veintiocho compuestos analizados, 4, 5, 6, 27 y 28 se consideraron tóxicos. (Figura 5). Por lo tanto, estos cinco compuestos se excluyeron de la siguiente evaluación de actividad intramacrofágica.
Figura 5: Toxicidad de Hits hacia macrófagos infectados con Mab. Los ratones BALB/c BMM se infectaron con Mab (MOI=1) y se incubaron con cada golpe previamente identificado a 13,3 μM, 6,66 μM y 3,3 μM (1,3%, 0,7% y 0,3% de DMSO, respectivamente) durante 48 h a 37 °C con 7% de CO2. Las células se observaron en un microscopio de fluorescencia de cribado de alto contenido, utilizando el número de núcleos (teñidos con DAPI) para medir la viabilidad celular. El gráfico muestra los porcentajes de macrófagos infectados viables tratados en relación con los macrófagos infectados viables no tratados de dos experimentos independientes. Los símbolos redondos representan la viabilidad de la célula para cada ensayo. Las barras representan el promedio de dos experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Para inferir la actividad intramacrofágica de los veintitrés compuestos restantes frente al Mab intracelular (Figura 6), se utilizó la fórmula Mycoload (explicada previamente en el paso 6) para obtener el porcentaje de viabilidad micobacteriana normalizada a los macrófagos infectados no tratados. La mayoría de los compuestos perdieron su potencial terapéutico frente a las micobacterias internalizadas (Figura 6) en comparación con el ensayo de validación de aciertos (Figura 4), ya que el número de aciertos se redujo de veinticinco a seis en la concentración más alta probada. Sorprendentemente, los tres compuestos que aumentaron la viabilidad del Mab planctónico en comparación con las bacterias no tratadas (30, 31 y 32; Figura 3 y Figura 4) mostraron actividad antimicobacteriana frente al Mab intracelular, presentándose los compuestos 30 y 32 una diferencia estadísticamente significativa en comparación con el DMSO, incluso a 3,3 μM en el caso del compuesto 32 (Figura 6). Las micobacterias tratadas con los compuestos 11 y 23 mostraron una viabilidad <50% a 13,3 μM; sin embargo, esto no fue significativamente diferente del control DMSO (Figura 6). Los compuestos 21, 26 y 29 fueron lo suficientemente potentes a 13,3 μM como para justificar una diferencia estadística significativa, siendo 29 el más activo (Figura 6). Por último, los compuestos 17, 22 y 25 fueron extremadamente potentes en todas las concentraciones probadas contra micobacterias internalizadas. Estos se identificaron como roxitromicina, claritromicina y rifabutina, respectivamente (Tabla 1). De los tres compuestos, la claritromicina fue el más activo frente al Mab, con una viabilidad micobacteriana que nunca superó el 10%, presentando un valor p <0,0001 en todas las concentraciones ensayadas en comparación con el DMSO (Figura 6).
Figura 6: Actividad intramacrofágica de Hits frente a macrófagos infectados con Mab. Los BMM de ratones BALB/c se infectaron con Mab (MOI=1) y se incubaron con cada golpe previamente identificado a 13,3, 6,66 y 3,3 μM (1,3, 0,7 y 0,3% de DMSO, respectivamente) durante 48 h a 37 °C con 7% de CO2. Las células se obtuvieron en un microscopio de fluorescencia de cribado de alto contenido y se utilizó la señal fluorescente para calcular la micocarga (véase el paso 6). El gráfico muestra los porcentajes de Mycoload encontrados en los macrófagos infectados tratados en relación con los macrófagos infectados no tratados en dos experimentos independientes. La estadística se realizó mediante ANOVA de dos vías con la prueba de comparación múltiple de Dunnet; *, p < 0,05; **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001 en comparación con el DMSO (control de disolventes). Los asteriscos siguen el mismo código de color para cada concentración que la leyenda del gráfico. Los símbolos redondos representan la Mycoload para cada ensayo. Las barras representan el promedio de dos experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Ejemplo de un diseño de placa de 384 pocillos utilizado en la evaluación del factor Z'. Blanco: pozos en blanco (solo medio de crecimiento líquido); amarillo - control positivo (bacterias tratadas con un antibiótico); Rojo - control negativo (bacterias no tratadas). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Ejemplo de un diseño de placa de 384 pocillos utilizado en el cribado de la biblioteca. Blanco: pozos en blanco (solo medio de crecimiento líquido); verde - control de solventes; rojo - control negativo (bacterias no tratadas); Azul: compuestos que se van a examinar. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 3: Ejemplo de un diseño de placa de 384 pocillos utilizado para la validación de impactos. Blanco: pozos en blanco (solo medio de crecimiento líquido); verde - control de disolventes (por duplicados); rojo - control negativo (bacterias no tratadas); Azul: compuestos que se van a cribar (por duplicado). Los colores difuminados representan diluciones en serie 1:2. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 4: Ejemplo de un diseño de placa de 96 pocillos utilizado para un ensayo de infección. Blanco - pozos en blanco (agua para evitar la evaporación); rojo - control negativo (macrófagos no tratados); amarillo - control positivo (macrófagos tratados con un antibiótico); verde - control de solventes; Azul: compuestos que se van a probar. Los colores difuminados representan diluciones en serie 1:2. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 5: Protocolo de análisis de imágenes. En este trabajo se utiliza un protocolo detallado de análisis de imágenes, que puede adaptarse a software de código abierto. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Este protocolo describe una línea de cribado de fármacos contra Mab utilizando en cepas desarrolladas internamente 10. Mediante el uso de robótica de manejo de líquidos, microscopía y análisis automatizados y cepas reporteras dobles, la viabilidad bacteriana se evalúa rápidamente mediante luminiscencia o fluorescencia sin agregar reactivos ni realizar pasos adicionales. Este enfoque reduce el tiempo y la variabilidad entre ensayos, lo cual es una ventaja significativa cuando se considera el propósito de los ensayos HTS.
Al analizar miles de compuestos, un fármaco eficaz debe identificarse fácilmente. Con este fin, el factor Z' se utiliza a menudo para medir el tamaño del efecto estadístico, inferiendo el rendimiento del ensayo. Si el factor Z' > 0,5, las condiciones ensayadas son óptimas para distinguir entre poblaciones tratadas y no tratadas13. Las condiciones ensayadas arrojaron factores Z' > 0,6 (Figura 2), demostrando estadísticamente que podrían aplicarse a una campaña de cribado. Este paso es crucial para garantizar la eficacia del cribado.
Así, se desarrolló un protocolo HTS para detectar la actividad antimicrobiana de miles de compuestos frente al Mab que crece planctónicamente. Dado que Mab es un patógeno facultativo intracelular, el protocolo diseñado también examina la actividad antimicrobiana intracelular contra la misma cepa bacteriana, una ventaja fundamental. Además, también se puede evaluar la toxicidad para las células huésped. Por lo tanto, se describe un enfoque de varios pasos para el cribado de fármacos contra Mab, utilizando diferentes configuraciones experimentales para evaluar la actividad antimicrobiana junto con la citotoxicidad, lo que aumenta las posibilidades de éxito. Como prueba de concepto, se seleccionó una biblioteca química compuesta por 1280 compuestos.
Se identificaron un total de treinta y tres aciertos (Figura 3). De ellos, tres aumentaron significativamente la viabilidad micobacteriana en cultivos líquidos (compuestos 30, 31 y 32; Figura 3 y Figura 4). Cabe señalar que estos compuestos pueden interferir con la emisión de luminiscencia sin afectar la viabilidad bacteriana. Cuando se probaron contra micobacterias internalizadas, estos compuestos mostraron actividad antimicrobiana (Figura 6), demostrando una mayor eficacia contra Mab después de la internalización de la célula huésped. Estos compuestos se identificaron como troleandomicina (30), espiramicina (32) y lincomicina (31; Tabla 1). Los dos primeros son macrólidos, una clase de antibióticos utilizados para tratar infecciones micobacterianas16, y el último es una lincosamida, un antibiótico con un mecanismo de acción similar a los macrólidos17. Se ha reportado que el Mab es particularmente resistente a otra lincosamida, la clindamicina, tanto en cultivos líquidos como sólidos18. No obstante, se han asociado propiedades inmunomoduladoras y antiinflamatorias con macrólidos19,20 y lincosamidas21, lo que podría explicar el aumento de la actividad antimicrobiana frente a micobacterias internalizadas (Figura 6).
De los treinta impactos restantes, once reducen en un >90% la viabilidad micobacteriana en todas las concentraciones (Figura 4). Dado que, un ensayo HTS típico tiene una tasa de aciertos esperada de ~1%22, el protocolo desarrollado está de acuerdo con lo que se observa habitualmente. No obstante, varios otros compuestos seguían activos, y veintiocho continuaron con el ensayo de infección.
De los compuestos identificados, cinco compuestos se consideraron tóxicos (Figura 5): daunorrubicina (4), doxorrubicina (5), epirrubicina (27), tiostreptón (6) y pamoato de pirvinio (28; Tabla 1). Los tres primeros son agentes antineoplásicos 23,24,25, por lo que, como era de esperar, son tóxicos para las células de mamíferos utilizadas en este ensayo. El pamoato de pirvinio se utilizó durante muchos años como un antihelmíntico eficaz; Sin embargo, desde 2004, también se ha relacionado con actividades antineoplásicas26. Por último, el tiostrepton es un oligopéptido utilizado a menudo en medicina veterinaria, nunca aprobado para su uso en humanos27. Se ha reportado la actividad de este fármaco contra las células de cáncer de mama28. No se evaluó la actividad intramacrofágica del tiostrepton debido a su toxicidad sobre los macrófagos derivados de la médula ósea (Figura 5). Sin embargo, se ha demostrado que el tiostrepton es efectivo a 5 μM en células THP-1 infectadas con Mab29. Los resultados reportados contra las bacterias planctónicas29 son similares a los obtenidos en este cribado, siendo el tiostrepton extremadamente potente (Figura 4).
La mayoría de los compuestos analizados para la actividad intramacrófica no mostraron potencial terapéutico (Figura 6). El crecimiento intracelular bacteriano es considerablemente diferente del de los cultivos planctónicos. En este último, siempre es posible el contacto directo entre bacterias y fármacos. En el primero, debido a la internalización por parte de las células huésped, varias membranas del huésped actúan como barreras físicas que los fármacos deben transponer para llegar al objetivo, lo que puede ayudar a explicar la disminución de la actividad antimicrobiana de la mayoría de los golpes. A la concentración más alta, 13,3 μM, tres compuestos mostraron suficiente potencia para ser estadísticamente diferentes del control de DMSO (Figura 6): cefdinir (21), gatifloxacino (26) y moxifloxacina (29; Tabla 1). Mientras que la moxifloxacina ya se utiliza como fármaco antituberculoso de segunda línea16, el cefdinir se utiliza habitualmente para tratar varias infecciones bacterianas del tracto respiratorio, como la neumonía30. Sin embargo, se ha reportado su actividad contra M. tuberculosis31 y Mab, mostrando un potente efecto sinérgico con un carbapenémico contra este último32. La gatifloxacina es una fluoroquinolona, y su actividad se ha reportado contra varias micobacterias en los últimos 33,34 años. Los tres compuestos más activos en este ensayo (Figura 6) fueron la roxitromicina (17), la claritromicina (22) y la rifabutina (25; Tabla 1), que son extremadamente potentes en todas las concentraciones. Los dos primeros son macrólidos, mientras que la rifabutina es una rifamicina, y ambas clases sirven como base para el tratamiento contra muchas infecciones micobacterianas16.
Este cribado se basa en equipos de manipulación de líquidos específicos y costosos para reducir la variabilidad entre ensayos. A pesar de ser extremadamente reproducible, el manipulador de líquidos no tiene una transferencia de compuestos sin contacto, como una acústica. Por lo tanto, ciertos compuestos adherentes pueden permanecer adheridos a los pines metálicos entre transferencias, trasladándose a los pozos siguientes, lo que resulta en falsos positivos durante la fase de cribado: esto fue lo que sucedió con el compuesto 33. Esta es la razón por la que la validación del cribado es tan importante para su éxito, ya que garantiza que ningún falso positivo pase a los siguientes pasos del proceso de cribado de fármacos. El ensayo de infección utiliza un sistema de imágenes de alto contenido con un modo confocal para obtener la mejor definición posible de las regiones bacterianas. No obstante, todavía es posible utilizarlo sin un modo confocal, aunque con una pérdida de definición y posiblemente dificultando la identificación de regiones bacterianas. Este protocolo aprovecha el software de análisis simple y fácil de usar integrado con el sistema de imágenes; sin embargo, el software de código abierto se puede utilizar siguiendo el protocolo (Figura complementaria 5). En última instancia, a pesar de no reutilizar fármacos para tratar las infecciones por Mab, estos resultados son extremadamente importantes porque validan el protocolo establecido, que puede ampliarse a bibliotecas más grandes. Es importante destacar que creemos que este protocolo se puede adaptar a cualquier bacteria, siempre que se disponga de lecturas fluorescentes o luminiscentes. Así, este trabajo contribuye significativamente al campo del descubrimiento de fármacos, proporcionando las herramientas necesarias para ayudar a combatir uno de los mayores problemas de salud pública, las bacterias resistentes a los antibióticos, y en particular un patógeno casi intratable, Mycobacterium abscessus.
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Este trabajo está financiado por fondos nacionales portugueses a través de FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P, dentro del proyecto PTDC/BIA-MIC/3458/2020 (DOI: 10.54499/PTDC/BIA-MIC/3458/2020) y becas de doctorado 2021.07335.BD a GSO y UI/BD/150830/2021 a CMB; FWO - Fundación de Investigación de Flandes, beca n° 1S68720N; Iniciativa de Medicina Innovadora 2 Convocatoria 16 (IMI2-Convocatoria 16) propuesta RespiriTB bajo el acuerdo número 853903. Los autores agradecen el apoyo de la Plataforma Científica i3S BioSciences Screening, miembro de las infraestructuras nacionales PT-OPENSCREEN (NORTE-01-0145-FEDER-085468) y PPBI - Plataforma Portuguesa de Bioimagen (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% Neutral buffered formalin | Bio Optica | 05-01005Q | fixation solution |
384-well black round bottom polypropylene not treated microplate | Corning | 3658 | White microplates can be used; polystyrene can be used |
50 TS Washer | BioTek | ||
Breathe-Easy sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z380059-1PAK | |
cell::explorer | Revvity | equipment handling robot | |
Clarithromycin | Sigma-Aldrich | A3487-100MG | Dissolved in DMSO to the desired concentration |
DMSO | Fisher Scientific | D/4121/PB15 | Dilute in liquid growth medium to the desired concentration |
Harmony 5.1 | Revvity | analysis software | |
Heracell VIOS 160i CO2 Incubator, 165 L | Thermo Scientific | cell incubator | |
JANUS with 4 Tip Arm and MDT Arm | Revvity | liquid handler | |
KB 8182 | Termaks | incubator with agitation | |
Libra S4+ | Biochrom | ||
Multidrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | ||
Opera Phenix Plus | Revvity | imaging system | |
PhenoPlate | Revvity | 6055302 | Necessary for high-content microscopes |
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1x | NA | NA | washing solution |
Prestwick Chemical libraries | Commercial chemical library intended for drug repurposing | ||
Shaking incubator 3031 | GFL | ||
VICTOR Nivo | Revvity | ||
Cell culture medium: | When needed, add 10% of supplement | ||
DMEM | Gibco | 10938-025 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
HEPES Buffer Solution (1 M) | Gibco | 15630-056 | |
LCCM | NA | NA | Conditioned media from L929 cell line that releases Macrophage colony stimulating factor (M-CSF); cell culture medium supplement |
L-glutamin (200 mM) | Thermo Scientific | 25030024 | |
Sodium Pyruvate 100 mM (100X) | Gibco | 11360-039 | |
Infection washing solution | |||
Apirogenic water | Multiple suppliers available | ||
Hank's Balanced Salt Solution 10x | Gibco | 14060-040 | Dilute to 1x with apirogenic water |
Permeabilising Solution | PBS with 0.1% Triton X100 | ||
PBS 1x | NA | NA | |
Triton X100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Other suppliers available |
Staining solution | PBS with DAPI (500 ng/mL) and HCS Far Red (10 ng/mL) | ||
DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
HCS Far Red | Invitrogen | H32721 | |
PBS 1x | NA | NA | Multiple suppliers available |
Liquid growth medium | When needed, add 10% supplement | ||
Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | |
Tween80 | Sigma-Aldrich | P4780 | 0.05% final concentration. Other suppliers available |
Liquid growth medium supplement: | |||
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9702-100 | |
D-Glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 |
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