Métodos para tatuar Xenopus laevis con una máquina de tatuar rotativa

Resumen

Aquí, describimos métodos para tatuar Xenopus laevis adulto (rana africana con garras) con una máquina de tatuar rotativa. Un tatuaje adecuado da como resultado números oscuros y fácilmente legibles que duran varios meses y hacen que los animales se distingan fácilmente para fines de investigación y mantenimiento de registros.

Resumen

Los modelos animales amplían el alcance de la investigación biomédica, lo que mejora nuestra comprensión de la biología del desarrollo, molecular y celular y permite a los investigadores modelar enfermedades humanas. El registro y el seguimiento de animales individuales permite a los investigadores reducir el número de animales necesarios para el estudio y perfeccionar las prácticas para mejorar el bienestar animal. Existen varios métodos bien documentados para marcar y rastrear mamíferos, incluidos los puñetazos en las orejas y las marcas en las orejas. Sin embargo, los métodos para marcar las especies de anfibios acuáticos son limitados, ya que los recursos existentes son obsoletos, ineficaces o prohibitivamente costosos. En este manuscrito, describimos los métodos y las mejores prácticas para marcar Xenopus laevis con una máquina de tatuar rotativa. Un tatuaje adecuado da como resultado tatuajes de alta calidad, lo que hace que las personas sean fácilmente distinguibles para los investigadores y representan un riesgo mínimo para la salud de los animales. También destacamos las causas de los tatuajes de mala calidad, que pueden dar lugar a tatuajes que se desvanecen rápidamente y causan daños innecesarios a los animales. Este enfoque permite a los investigadores y veterinarios marcar a los anfibios, lo que les permite rastrear réplicas biológicas y líneas transgénicas y mantener registros precisos de la salud animal.

Introducción

Los modelos animales son herramientas útiles para investigar cuestiones relacionadas con la salud humana. En la práctica, la investigación biomédica con modelos animales requiere una organización y un mantenimiento cuidadosos de una colonia animal sana. Las mejores prácticas para el manejo y la cría éticos de animales tienen como objetivo reducir el número de animales necesarios para la experimentación y perfeccionar las prácticas para garantizar el bienestar animal¹. El género de ranas con garras, incluyendo Xenopus laevis (X. laevis; Rana africana de garras) y Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Rana de uñas occidental), se han utilizado en la investigación biomédica desde la década de 1930, cuando los médicos sudafricanos utilizaron X. laevis para realizar las primeras pruebas de embarazo². Si bien las pruebas de embarazo modernas ya no requieren ranas, el papel de la investigación sobre Xenopus persiste. Las ventajas de usar Xenopus para la investigación biomédica incluyen sus genomas bien anotados³, la ovulación inducible durante todo el año de grandes nidadas de huevos⁴ y huevos puestos externamente susceptibles de fertilización in vitro. Estas características los convierten en un activo útil para la embriología y el desarrollo de vertebrados ^5,6,7, la biología molecular y celular básica ^7,8,9,10 y para modelar enfermedades humanas ^7,11,12,13.

Los métodos fiables para el seguimiento de animales individuales de Xenopus son esenciales para registrar las réplicas biológicas y mejorar el rigor y la reproducibilidad en la investigación. Dado que los Xenopus se alojan con frecuencia en grupos, el marcaje de animales permite a los investigadores rastrear fácilmente^{a los animales} individuales. Mantener un registro preciso de los animales puede ahorrar tiempo y recursos y mejorar la capacidad de realizar un seguimiento de la salud de los animales. Por ejemplo, la identificación individual de animales puede mejorar los flujos de trabajo de organización para generar líneas de Xenopus transgénicos, ya que esto requiere múltiples generaciones de ranas con genotipos específicos verificados por secuenciación¹⁴, lo que requiere organización e identificación individual de animales. Esto es particularmente cierto cuando estas mutaciones carecen de fenotipos adultos fácilmente discernibles. Del mismo modo, el uso de ovocitos y embriones de Xenopus para estudiar la biología celular básica y del desarrollo se beneficia del seguimiento de animales individuales. Después de inducir la ovulación, los animales necesitan descansar durante un mínimo de 3 meses para prevenir complicaciones de salud como el síndrome de hiperovulación¹⁵. Los métodos de identificación individual garantizan que los animales no sean inducidos a ovular con demasiada frecuencia.

El marcado y el seguimiento de los animales también permiten al personal del laboratorio realizar un seguimiento de los problemas de salud de los animales. El hecho de que los animales del mismo genotipo enfermen puede indicar una endogamia excesiva o problemas de salud imprevistos asociados con el transgén. Del mismo modo, los animales que se enferman después de una ovulación reciente pueden indicar problemas con los reactivos, los materiales o las técnicas. El seguimiento de los animales y su salud permite al personal de laboratorio y a los veterinarios hacer un seguimiento cuando vuelven a surgir preocupaciones y tomar medidas preventivas para prevenir futuras enfermedades. En los mamíferos, existen numerosos métodos de identificación. Los métodos permanentes para ratones incluyen perforaciones en las orejas, marcas en las orejas, tatuajes y microchips subcutáneos¹⁶. Estos pueden diferenciar de manera clara y confiable a los animales dentro de una colonia o jaula y pueden ser administrados fácilmente por el personal del laboratorio. Métodos como el punzado de orejas son mínimamente invasivos, requieren solo una pieza de equipo especializado y funcionan para animales de la mayoría de las edades. Si bien estos sistemas son sencillos y útiles para los ratones, su uso en las ranas presenta un conjunto único de desafíos. Las ranas y otros anfibios carecen de pabellón auricular (estructura del oído externo). Algunos investigadores han colocado etiquetas en la mandíbula, el dedo del pie o la extremidad trasera del animal ^17,18. Este enfoque dio lugar a varios problemas: las marcas en la mandíbula causaban irritación y las ranas agitadas intentaban arrancar las etiquetas con sus extremidades delanteras¹⁷. Las marcas de los dedos perforaban la membrana entre los dedos, lo que perjudicaba el movimiento y conllevaba el riesgo de perderse. Como tal, los anfibios requieren sus propios métodos para su identificación. Históricamente, el corte de los dedos de los pies también se ha utilizado para marcar anfibios^17,19. El dedo del pie se corta con un par de tijeras afiladas, y el animal se puede identificar por la longitud de los dedos de las patas delanteras y traseras o por el ángulo en el que el dedo ha vuelto a crecer (en las salamandras). Sin embargo, este método plantea la preocupación ética de que el corte de los dedos de los pies pueda afectar el movimiento del animal¹⁷. Además, esto puede causar sangrado e introducir un riesgo de infección. Otro sistema de marcado establecido son los autoinjertos de piel, en los que se toma piel de una parte de la rana y se une quirúrgicamente a otra parte. Por ejemplo, se describe un método para marcar la espalda o el hombro de una rana utilizando un injerto de piel de color claro de su pecho²⁰. Los injertos de piel también conllevan limitaciones y riesgos: el procedimiento es invasivo e introduce el riesgo de infección por Aeromonas hydrophila, o pata roja, una afección potencialmente mortal; La cicatrización completa del autoinjerto tarda hasta 6 semanas; Y con los métodos descritos, solo se pueden alojar 6 ranas juntas debido a que los lugares para colocar un autoinjerto son limitados²⁰.

Los enfoques de marcado menos invasivos incluyen perlas de vidrio y chips de transpondedor^17,19. En el método de cuentas de vidrio, las cuentas de vidrio se enhebran en una pequeña sutura y se cosen en la piel de la rana. Esto proporciona una mayor variabilidad que los autoinjertos de piel, con al menos 60 combinaciones de colores distintivas. Sin embargo, existe el riesgo de que la sutura se salga y se pierdan las cuentas. Alternativamente, se puede implantar un transpondedor de microchip debajo de la piel en el saco linfático dorsal de la rana. Este se considera el método de marcaje más permanente y permite identificar y catalogar individualmente un número potencialmente infinito de animales. Sin embargo, este es también el método más caro, ya que los microchips individuales son caros y sería costoso marcar una colonia grande. Los microchips también requieren un escáner especial para leer¹⁹. Un enfoque común para la identificación de Xenopus es referirse a la coloración y el patrón natural de los animales. Esto funciona especialmente bien para ranas como X. laevis, que tienen patrones distintos que permanecen durante toda la edad adulta. Sin embargo, estos patrones pueden cambiar con el tiempo con el estrés, y la coloración puede parecer diferente cuando las ranas se mueven^{entre contenedores} transparentes y teñidos. Además, este método de identificación es menos útil para X. tropicalis, que tiene patrones de marca menos distintivos en comparación con X. laevis, o para los animales albinos, que no tienen marcas de color²¹. Incluso para especies con marcas distintas, el personal del laboratorio puede interpretar la ubicación y el tamaño de las marcas de manera diferente, lo que puede causar errores en la identificación. Debido a esto, fotografiar animales es más confiable junto con un método de identificación adicional. Por lo tanto, buscamos marcar e identificar a los animales Xenopus utilizando una técnica que sea fácilmente discernible, permanente y mínimamente invasiva.

Hay recursos publicados limitados que describen los métodos para tatuar anfibios. El tatuaje se ha descrito junto con otras técnicas de marca, incluidas las marcas de calor, las marcas de nitrato de plata y las marcas de congelación¹⁷. En el mismo recurso, el tatuaje se realizó dibujando números con una aguja hipodérmica de 27 G, y se observó que el proceso no causaba infección, en contraste con las otras técnicas de marcado, que usaban un alambre en forma de número u otra marca. En otra fuente, se utilizó una máquina de tatuar eléctrica (descrita como una aguja vibratoria) para marcar ranas, pero se proporcionaron pocos detalles sobre la técnica^17,19. Los autores advierten que al perturbar la capa protectora de baba de la rana, este procedimiento aumenta el riesgo de patas rojas. Si bien no existe un método de marcado o identificación que sea completamente no invasivo (como las fotografías) y permanente (como los microchips), el tatuaje proporciona un compromiso efectivo. El tatuaje es relativamente sencillo en comparación con otras técnicas, como los autoinjertos de piel. Los beneficios adicionales incluyen una curva de aprendizaje más pequeña y un equipo relativamente económico. Tatuar anfibios acuáticos conlleva ciertos desafíos, que pueden intimidar a los investigadores y perjudicar el marcaje exitoso de los animales. Este artículo tiene como objetivo proporcionar a los investigadores métodos bien documentados para tatuar Xenopus adulto con una máquina de tatuar rotativa.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Dartmouth College.

1. Configuración del equipo

NOTA: Se incluye un flujo de trabajo para el procedimiento y un ejemplo de configuración del banco (Figura 1).

1. Conecte la pistola de tatuaje y el pedal a la fuente de alimentación. Coloque el pedal debajo de la superficie de trabajo.
2. Montaje de la pistola de tatuajes
   1. Con una llave Allen o un destornillador hexagonal, afloje los tornillos de la empuñadura (Figura 2A, con un círculo rojo).
   2. Inserte la punta de plástico completamente en la empuñadura. Apriete el tornillo para mantenerlo en su lugar.
   3. Inserte el tubo de metal en la parte posterior de la empuñadura (Figura 2A). Esto se ajustará, así que insértelo a la mitad de su longitud. Apriete el tornillo para mantenerlo en su lugar.
   4. Inserte una aguja de tatuaje a través de la parte posterior de la empuñadura para que se asiente cómodamente en la punta de plástico en la parte delantera de la empuñadura (Figura 2B).
   5. Deslice la parte posterior de la aguja y el tubo de metal a través de la abrazadera del tubo. Ajuste el tubo de metal para que la aguja quepa cómodamente en la punta de plástico (Figura 2B). Apriete a mano la abrazadera del tubo hasta que el tubo no pueda moverse (Figura 2C).
   6. Retire la junta tórica negra y enganche la aguja en el brazo del rotor; vuelva a colocar la junta tórica para asegurar la aguja en su lugar (Figura 2C).
3. Ajuste el voltaje de la fuente de alimentación para que haya suficiente energía para perforar la piel, pero no tan potente como para que sea difícil de controlar. Una vez que la fuente de alimentación esté enchufada y conectada, presione el pedal para asegurarse de que la máquina esté funcionando. Tenga cuidado de no apuntar la aguja hacia usted mismo o hacia otras personas.
   NOTA: La máquina de tatuar utilizada en este protocolo funciona mejor entre 6.0 y 9.0 V, pero esto puede variar entre las máquinas de tatuar y las fuentes de voltaje y debe determinarse empíricamente.
4. Llene la tapa de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml o un tintero de plástico provisto con tinta negra para tatuajes hasta aproximadamente tres cuartas partes de su capacidad.

2. Anestesia

1. Prepare la anestesia en un tanque lo suficientemente grande como para sumergir una rana hembra adulta de X. laevis .
   1. Usando agua segura para ranas (sin cloro), agregue tricaína a la concentración final de 1.5 g/L y bicarbonato de sodio a la concentración final de 3.5 g/L. Mezcle para disolver. El pH de esta solución es de 7,15.
      PRECAUCIÓN: La tricaína es un irritante.
2. Sumerge una rana en el tanque de anestesia. Asegúrese de que la rana permanezca sumergida en la solución de tricaña hasta que esté anestesiada (7-8 min).
   1. Para verificar si la rana está completamente anestesiada, levántela, sujétala boca abajo y apriétala firmemente en una pata. Si la rana no se inmuta ni responde, se puede tatuar.
   2. Si las ranas tardan más de 10 minutos en ser anestesiadas, prepare una solución fresca de tricaína tamponada con bicarbonato de sodio.
      NOTA: Las ranas no deben pasar más de 30 minutos en la solución de tricaína¹⁵.

3. Tatuaje

NOTA: Antes de tatuar un animal vivo, puede ser útil practicar con una pieza de fruta con una cáscara firme (como un limón o un plátano).

1. Prepara un tanque de recuperación para las ranas antes de tatuarlas. Llene un tanque con 10-15 L de agua fresca segura para ranas y agregue una isla de espuma de poliestireno. Esto proporcionará una superficie para que la rana se despierte sin ahogarse.
   NOTA: Se puede hacer una isla de espuma de poliestireno con la tapa de un contenedor de envío frío de espuma de poliestireno colocado dentro de una bolsa con cierre hermético.
2. Coloque a la rana anestesiada boca arriba sobre una toalla de papel seca o papel de banco (Figura 3A). Use toallas de papel sin blanquear (marrones) para todo el trabajo que involucre ranas.
3. Con una toallita seca sin pelusa, limpia el agua y la mucosidad del pecho de la rana.
4. Encuentra el esternón en el centro del pecho de la rana con los dedos y, con la mano no dominante, mantén la piel tensa.
5. Marcando la rana
   1. Sostenga la pistola de tatuaje ensamblada verticalmente en relación con la superficie de trabajo y sumerja la aguja en la tinta (Figura 3B).
   2. Manteniendo la pistola de tatuaje montada en posición vertical, presiona la punta de la aguja sobre la piel de la rana antes de pisar el pedal. Dibuja líneas en la piel de la rana mientras aplicas una presión uniforme.
      NOTA: Es normal que haya un poco de sangrado o enrojecimiento, al igual que un poco de descamación de la piel.
   3. Si la aguja se engancha en la piel de la rana, limpia el exceso de tinta o piel de la aguja con una toallita. El exceso de tinta es normal durante el tatuaje.
   4. Si el pecho de la rana está cubierto con demasiada tinta para ver claramente el área que se está marcando (Figura 3C), limpie el exceso de tinta con agua apta para ranas y una toallita (Figura 3C'). Luego, absorba la humedad con una toallita seca y continúe entintando.
      NOTA: Se puede preparar una botella exprimible de agua apta para ranas antes de tatuar.
   5. Continúe entintando la misma área hasta que queden oscuros y legibles después de limpiar el exceso de tinta (Figura 3D). En lugar de dibujar toda la marca o el número de un solo trazo, haz repetidamente trazos más pequeños, especialmente para las curvas.

4. Recuperación

1. Moje una toalla de papel con agua apta para ranas y colóquela plana sobre la isla de espuma de poliestireno (Figura 4A).
2. Devolver las ranas a los tanques en pie
   1. Coloque la rana boca abajo sobre la toalla frente al agua (Figura 4B). Dobla la mitad de la toalla de papel sobre la mitad trasera de la rana y, con las manos ahuecadas, humedece la parte superior de la rana. Una vez que una rana emerge de la anestesia (aproximadamente 1 h después del tatuaje), entrará en el agua de forma independiente y nadará normalmente.
   2. Regrese las ranas a un alojamiento a largo plazo después de 24 horas, una vez que el tatuaje haya sanado por completo.

5. Limpieza y mantenimiento de equipos

1. Reutilización y esterilización en autoclave de agujas de tatuaje
   1. Enjuague las agujas con isopropanol al 100% y agua desionizada para aflojar la tinta y frotar la tinta restante que no se haya disuelto.
   2. Después de fregar, coloque las agujas en un estuche metálico para esterilizar en autoclave o envuélvalas con papel de aluminio y autoclave durante 30 minutos en un ciclo seco.
2. Si hay tinta en pedazos de la máquina de tatuar u otro equipo, límpialo con etanol al 100% y una toalla de papel.
3. La solución anestésica tiene una concentración final de tricaína de aproximadamente el 0,5%. Deséchelo de acuerdo con las pautas institucionales de manejo de desechos peligrosos.
4. Almacenamiento y mantenimiento de equipos
   1. Si es posible, guarda la máquina de tatuar en una habitación seca. El exceso de humedad dañará los componentes eléctricos y reducirá la longevidad de la máquina.
   2. Para mantener la máquina de tatuar en buen estado de funcionamiento, revise el cojinete del rotor (Figura 2C) para asegurarse de que no se haya soltado por las vibraciones²². Esto se puede apretar con una llave Allen o un destornillador hexagonal.
   3. Aproximadamente una vez al mes, lubrique el rodamiento en el brazo del rotor con una grasa lubricante espesa²².
   4. En algunas máquinas de tatuar, el brazo del rotor puede atascarse y no vibrar. Para corregir esto, gire el brazo del rotor o comprima el resorte para que la aguja quede en la posición bajada (Figura 2C).

Resultados

Los tatuajes de alta calidad tendrán trazos oscuros y legibles en el pecho de la rana y se pueden diferenciar claramente a varios pies de distancia (Figura 5A). En general, los números y marcas más grandes son mejores para la legibilidad, pero los nombres y números más largos se pueden hacer más pequeños para que quepan cómodamente en el pecho de la rana. La longevidad de los tatuajes es más difícil de juzgar, pero los tatuajes de ranas de alta calidad deben permanecer oscuros y le...

Discusión

Tatuar humanos es una forma de arte que se remonta a miles de años, y durante el tiempo que los humanos se han tatuado a sí mismos, también han tatuado o marcado animales²³. El equipo y las técnicas para marcar animales, en particular mamíferos, están bien establecidos, bien documentados y son ampliamente accesibles. Si bien el marcado de animales fue originalmente para distinguir el ganado y disuadir el robo²³, su papel en la investigación biomédica se ha vuelto ig...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1203RLB	Packaged sterile
5 Needle Round Disposable ULTRA	Worldwide Tattoo Supply	HTIPRS5-U	Packaged sterile
5 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1205RLB	Packaged sterile
7 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1207RLB	Packaged sterile
Clip Cord	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Foot pedal	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Inkpots	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Kimwipes, delicate task wipes	Fisher Scientific	06-666A
RCA Connection	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Scream Ink Pitch Black, 1oz	Worldwide Tattoo Supply	SI101
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Stainless steel grips	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set	Worldwide Tattoo Supply	STEALTH2-SET
Styrofoam island	N/A	N/A	This is the lid of a styrofoam cold shipping container
Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)	Sigma-Aldrich	E10521	CAUTION: IRRITANT
Unbleached paper towels	Grainger	2U229	Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians
Voltage Supply	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Wash bottle (with frog-safe water)	Fisher Scientific	FB0340923T	Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS
X. laevis adult female	Xenopus1	N/A
Zip-top plastic bag	N/A	N/A	This bag should be large enough to hold the styrofoam island