Métodos para tatuar Xenopus laevis com uma máquina de tatuagem rotativa

Resumo

Aqui, descrevemos métodos para tatuar Xenopus laevis adulto (sapo africano com garras) com uma máquina de tatuagem rotativa. A tatuagem adequada resulta em numerais escuros e facilmente legíveis que duram vários meses e tornam os animais facilmente distinguíveis para fins de pesquisa e manutenção de registros.

Resumo

Os modelos animais expandem o escopo da pesquisa biomédica, aprofundando nossa compreensão da biologia do desenvolvimento, molecular e celular e permitindo que os pesquisadores modelem doenças humanas. Registrar e rastrear animais individuais permite que os pesquisadores reduzam o número de animais necessários para o estudo e refinem as práticas para melhorar o bem-estar animal. Existem vários métodos bem documentados para marcar e rastrear mamíferos, incluindo socos e marcas de orelha. No entanto, os métodos de marcação de espécies de anfíbios aquáticos são limitados, sendo os recursos existentes desatualizados, ineficazes ou proibitivamente dispendiosos. Neste manuscrito, descrevemos métodos e melhores práticas para marcar Xenopus laevis com uma máquina de tatuagem rotativa. A tatuagem adequada resulta em tatuagens de alta qualidade, tornando os indivíduos facilmente distinguíveis para os pesquisadores e representando um risco mínimo para a saúde dos animais. Também destacamos as causas de tatuagens de baixa qualidade, que podem resultar em tatuagens que desbotam rapidamente e causam danos desnecessários aos animais. Essa abordagem permite que pesquisadores e veterinários marquem anfíbios, permitindo que eles rastreiem réplicas biológicas e linhagens transgênicas e mantenham registros precisos da saúde animal.

Introdução

Os modelos animais são ferramentas úteis para investigar questões relativas à saúde humana. Na prática, a pesquisa biomédica usando modelos animais requer organização e manutenção cuidadosas de uma colônia animal saudável. As melhores práticas para o manejo e criação éticos de animais visam reduzir o número de animais necessários para experimentação e refinar as práticas para garantir o bem-estar animal¹. O gênero de rãs com garras, incluindo Xenopus laevis (X. laevis; Sapo africano com garras) e Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Sapo com garras ocidentais), têm sido usados em pesquisas biomédicas desde a década de 1930, quando X. laevis foi usado por médicos sul-africanos para realizar os primeiros testes de gravidez². Embora os testes de gravidez modernos não exijam mais sapos, o papel da pesquisa de Xenopus persiste. As vantagens de usar Xenopus para pesquisa biomédica incluem seus genomas bem anotados³, ovulação induzível durante todo o ano de grandes ninhadas de ovos⁴ e ovos colocados externamente passíveis de fertilização in vitro. Essas características os tornam um recurso útil para a embriologia e desenvolvimento de vertebrados ^5,6,7, biologia molecular e celular básica ^7,8,9,10 e para modelar doenças humanas 7,11,12,13.

Métodos confiáveis para rastrear animais individuais de Xenopus são essenciais para registrar réplicas biológicas e melhorar o rigor e a reprodutibilidade na pesquisa. Como os Xenopus são frequentemente alojados em grupos, a marcação de animais permite que os pesquisadores rastreiem facilmente animais individuais⁴. Manter um registro preciso dos animais pode economizar tempo e recursos e melhorar a capacidade de rastrear a saúde dos animais. Por exemplo, a identificação individual de animais pode melhorar os fluxos de trabalho da organização para a geração de linhagens transgênicas de Xenopus , pois isso requer várias gerações de rãs com genótipos específicos verificados pelo sequenciamento¹⁴, o que requer organização e identificação individual dos animais. Isso é particularmente verdadeiro quando essas mutações carecem de fenótipos adultos facilmente discerníveis. Da mesma forma, o uso de oócitos e embriões de Xenopus para estudar biologia celular e de desenvolvimento básica se beneficia do rastreamento de animais individuais. Após a indução da ovulação, os animais precisam descansar por um período mínimo de 3 meses para evitar complicações de saúde, como a síndrome da hiperovulação¹⁵. Os métodos de identificação individual garantem que os animais não sejam induzidos a ovular com muita frequência.

A marcação e o rastreamento de animais também permitem que o pessoal do laboratório rastreie as preocupações com a saúde dos animais. Animais do mesmo genótipo adoecendo podem indicar endogamia excessiva ou problemas de saúde imprevistos associados ao transgene. Da mesma forma, animais adoecendo após ovulação recente podem indicar problemas com reagentes, materiais ou técnicas. O rastreamento de animais e sua saúde permite que o pessoal do laboratório e os veterinários acompanhem quando as preocupações ressurgirem e tomem medidas preventivas para prevenir doenças futuras. Nos mamíferos, existem vários métodos de identificação. Os métodos permanentes para camundongos incluem perfuração de orelhas, marcas de orelha, tatuagem e microchips subcutâneos¹⁶. Eles podem diferenciar de forma clara e confiável os animais dentro de uma colônia ou gaiola e podem ser facilmente administrados pelo pessoal do laboratório. Métodos como perfurar a orelha são minimamente invasivos, requerem apenas um equipamento especializado e funcionam para animais da maioria das idades. Embora esses sistemas sejam diretos e úteis para camundongos, seu uso em sapos apresenta um conjunto único de desafios. Rãs e outros anfíbios não possuem um pavilhão auricular (estrutura da orelha externa). Alguns pesquisadores colocaram etiquetas na mandíbula, dedo do pé ou membro posterior do animal^17,18. Essa abordagem resultou em vários problemas: as marcas da mandíbula causaram irritação e as rãs agitadas tentaram arrancar as marcas com os membros anteriores¹⁷. As marcas dos dedos perfuravam a teia entre os dedos, prejudicando o movimento e trazendo o risco de se perder. Como tal, os anfíbios requerem seus próprios métodos de identificação. Historicamente, o corte do dedo do pé também tem sido usado para marcar anfíbios^17,19. O dedo do pé é cortado com uma tesoura afiada, e o animal pode ser identificado pelo comprimento dos dedos das patas dianteiras e traseiras ou pelo ângulo em que o dedo do pé voltou a crescer (em salamandras). No entanto, esse método apresenta a preocupação ética de que a tosquia do dedo do pé possa prejudicar o movimento do animal¹⁷. Além disso, isso pode causar sangramento e introduzir risco de infecção. Outro sistema de marcação estabelecido são os autoenxertos de pele, nos quais a pele é retirada de uma parte do sapo e cirurgicamente fixada a outra parte. Por exemplo, é descrito um método para marcar as costas ou o ombro de um sapo usando um enxerto de pele de cor clara de seu peito²⁰. Os enxertos de pele também apresentam limitações e riscos: o procedimento é invasivo e apresenta o risco de infecção por Aeromonas hydrophila, ou perna vermelha, uma doença potencialmente fatal; a cicatrização completa do autoenxerto leva até 6 semanas; E com os métodos descritos, apenas 6 rãs podem ser alojadas juntas por causa de lugares limitados para colocar um autoenxerto²⁰.

Abordagens de marcação menos invasivas incluem contas de vidro e chips de transponder^17,19. No método de contas de vidro, as contas de vidro são enfiadas em uma pequena sutura e costuradas na pele do sapo. Isso fornece maior variabilidade do que os autoenxertos de pele, com pelo menos 60 combinações de cores distintas. Existe, no entanto, o risco de que a sutura possa sair e resultar na perda das contas. Alternativamente, um transponder de microchip pode ser implantado sob a pele no saco linfático dorsal do sapo. Este é considerado o método de marcação mais permanente e permite que um número potencialmente infinito de animais seja identificado e catalogado individualmente. No entanto, este também é o método mais caro, pois microchips individuais são caros e uma grande colônia seria cara para marcar. Os microchips também requerem um scanner especial para ler¹⁹. Uma abordagem comum para a identificação de Xenopus é referir-se à coloração e padronização naturais dos animais. Isso funciona especialmente bem para sapos como X. laevis, que têm padrões distintos que permanecem durante a idade adulta. No entanto, esses padrões podem mudar com o tempo com o estresse, e a coloração pode parecer diferente quando os sapos são movidos entre recipientes transparentes e coloridos¹⁵. Além disso, esse método de identificação é menos útil para X. tropicalis, que possui padrões de marcação menos distintos em comparação com X. laevis, ou para animais albinos, que não apresentam marcações de cor²¹. Mesmo para espécies com marcações distintas, o pessoal do laboratório pode interpretar a colocação e o tamanho das marcações de maneira diferente, o que pode causar erros na identificação. Por isso, fotografar animais é mais confiável em conjunto com um método de identificação adicional. Portanto, buscamos marcar e identificar animais Xenopus usando uma técnica que seja facilmente discernível, permanente e minimamente invasiva.

Existem recursos publicados limitados que descrevem métodos para tatuar anfíbios. A tatuagem foi descrita ao lado de outras técnicas de branding, incluindo marcas de calor, marcas de nitrato de prata e marcas de congelamento¹⁷. No mesmo recurso, a tatuagem foi feita desenhando numerais com uma agulha hipodérmica 27G, e o processo foi observado para não causar infecção, ao contrário das outras técnicas de marcação, que usavam um fio em forma de numeral ou outra marca. Em outra fonte, uma máquina de tatuagem elétrica (descrita como agulha vibratória) foi usada para marcar sapos, mas poucos detalhes foram fornecidos sobre a técnica ^17,19. Os autores alertam que, ao perturbar a camada protetora de lodo do sapo, esse procedimento aumenta o risco de perna vermelha. Embora não exista um método de marcação ou identificação que seja completamente não invasivo (como fotografias) e permanente (como microchips), a tatuagem fornece um compromisso eficaz. A tatuagem é relativamente simples em comparação com outras técnicas, como autoenxertos de pele. Os benefícios adicionais incluem uma curva de aprendizado menor e equipamentos relativamente baratos. Tatuar anfíbios aquáticos traz certos desafios, que podem intimidar os pesquisadores e prejudicar a marcação bem-sucedida dos animais. Este artigo tem como objetivo fornecer aos pesquisadores métodos bem documentados para tatuar Xenopus adulto com uma máquina de tatuagem rotativa.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Dartmouth College.

1. Configuração do equipamento

NOTA: Um fluxo de trabalho para o procedimento e um exemplo de configuração de bancada estão incluídos (Figura 1).

1. Conecte a pistola de tatuagem e o pedal à fonte de alimentação. Posicione o pedal embaixo da superfície de trabalho.
2. Montando a pistola de tatuagem
   1. Usando uma chave Allen ou chave de fenda sextavada, solte os parafusos na empunhadura (Figura 2A, circulada em vermelho).
   2. Insira a ponta de plástico totalmente na alça. Aperte o parafuso para mantê-lo no lugar.
   3. Insira o tubo de metal na parte de trás da alça (Figura 2A). Isso será ajustado, então insira-o na metade do comprimento. Aperte o parafuso para mantê-lo no lugar.
   4. Insira uma agulha de tatuagem na parte de trás da empunhadura para que ela se encaixe confortavelmente na ponta de plástico na frente da empunhadura (Figura 2B).
   5. Deslize a parte de trás da agulha e do tubo de metal através do tubo clamp. Ajuste o tubo de metal para que a agulha se encaixe confortavelmente na ponta de plástico (Figura 2B). Aperte manualmente o tubo clamp até que o tubo não consiga se mover (Figura 2C).
   6. Remova o O-ring preto e prenda a agulha no braço do rotor; recoloque o O-ring para prender a agulha no lugar (Figura 2C).
3. Defina a tensão na fonte de alimentação para que haja energia suficiente para perfurar a pele, mas não tão poderosa que seja difícil de controlar. Assim que a fonte de alimentação estiver conectada e conectada, pressione o pedal para certificar-se de que a máquina está funcionando. Tome cuidado para não apontar a agulha para você ou para outra pessoa.
   NOTA: A máquina de tatuagem usada neste protocolo funciona melhor entre 6,0 e 9,0 V, mas isso pode variar entre máquinas de tatuagem e fontes de tensão e deve ser determinado empiricamente.
4. Encha a tampa de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL ou um pote de tinta de plástico fornecido com tinta de tatuagem preta até cerca de três quartos.

2. Anestesia

1. Prepare a anestesia em um tanque grande o suficiente para submergir uma fêmea adulta de sapo X. laevis .
   1. Usando água própria para rãs (sem cloro), adicione tricaína à concentração final de 1,5 g/L e bicarbonato de sódio à concentração final de 3,5 g/L. Misture para dissolver. O pH desta solução é 7,15.
      CUIDADO: A tricaína é irritante.
2. Mergulhe um sapo no tanque de anestesia. Certifique-se de que o sapo permaneça submerso na solução de tricaína até que seja anestesiado (7-8 min).
   1. Para verificar se o sapo está totalmente anestesiado, pegue-o, segure-o de cabeça para baixo e aperte-o com firmeza em um pé. Se o sapo não vacilar ou responder, ele pode ser tatuado.
   2. Se as rãs demorarem mais de 10 minutos para serem anestesiadas, prepare uma solução fresca de tricaína tamponada com bicarbonato de sódio.
      NOTA: As rãs não devem passar mais de 30 minutos em solução de tricaína¹⁵.

3. Tatuagem

NOTA: Antes de tatuar um animal vivo, pode ser útil praticar em um pedaço de fruta com casca firme (como limão ou banana).

1. Prepare um tanque de recuperação para os sapos antes de tatuar. Encha um tanque com 10-15 L de água fresca segura para sapos e adicione uma ilha de isopor. Isso fornecerá uma superfície para o sapo acordar sem se afogar.
   NOTA: Uma ilha de isopor pode ser feita usando a tampa de um contêiner de transporte frio de isopor colocado dentro de um saco com zíper.
2. Coloque o sapo anestesiado de costas sobre uma toalha de papel seca ou papel de bancada (Figura 3A). Use toalhas de papel cruas (marrons) para todos os trabalhos envolvendo sapos.
3. Usando um pano seco sem fiapos, limpe a água e o muco do peito do sapo.
4. Encontre o esterno no centro do peito do sapo com os dedos e, usando a mão não dominante, segure a pele esticada.
5. Marcando o sapo
   1. Segure a pistola de tatuagem montada verticalmente em relação à superfície de trabalho e mergulhe a agulha na tinta (Figura 3B).
   2. Mantendo a pistola de tatuagem montada na vertical, pressione a ponta da agulha na pele do sapo antes de pressionar o pedal. Desenhe linhas na pele do sapo enquanto aplica pressão uniforme.
      NOTA: Algum sangramento ou vermelhidão menor é normal, assim como uma pequena descamação da pele.
   3. Se a agulha estiver presa na pele do sapo, limpe o excesso de tinta ou pele da agulha com um lenço. O excesso de tinta é normal durante a tatuagem.
   4. Se o peito do sapo estiver coberto de muita tinta para ver claramente a área que está sendo marcada ( Figura 3C ), limpe o excesso de tinta com água segura para sapos e um lenço umedecido ( Figura 3C '). Em seguida, absorva a umidade com um pano seco e continue pintando.
      NOTA: Uma garrafa squeeze de água segura para sapos pode ser preparada antes da tatuagem.
   5. Continue a pintar a mesma área até que os números escuros e legíveis permaneçam depois de limpar o excesso de tinta (Figura 3D). Em vez de desenhar toda a marcação ou número em um traço, faça repetidamente traços menores, especialmente para curvas.

4. Recuperação

1. Molhe uma toalha de papel com água própria para sapos e coloque-a plana em cima da ilha de isopor (Figura 4A).
2. Devolvendo sapos a tanques permanentes
   1. Deite o sapo de barriga para baixo na toalha de frente para a água (Figura 4B). Dobre metade da toalha de papel sobre a metade de trás do sapo e, usando as mãos em concha, molhe a parte superior do sapo. Uma vez que um sapo emerge da anestesia (cerca de 1 h após a tatuagem), ele entra na água de forma independente e nadará normalmente.
   2. Devolva os sapos ao alojamento de longo prazo após 24 horas, assim que a tatuagem estiver totalmente cicatrizada.

5. Limpeza e manutenção de equipamentos

1. Reutilização e autoclavagem de agulhas de tatuagem
   1. Enxágue as agulhas em 100% de isopropanol e água deionizada para soltar a tinta e esfregar a tinta restante que não se dissolveu.
   2. Após esfregar, coloque as agulhas em um estojo de autoclavagem de metal ou envolva-as com papel alumínio e autoclave por 30 min em ciclo seco.
2. Se houver tinta em pedaços da máquina de tatuagem ou outro equipamento, limpe-o com etanol 100% e uma toalha de papel.
3. A solução anestésica tem uma concentração final de tricaína de aproximadamente 0,5%. Descarte isso de acordo com as diretrizes institucionais de gerenciamento de resíduos perigosos.
4. Armazenamento e manutenção de equipamentos
   1. Se possível, guarde a máquina de tatuagem em uma sala seca. O excesso de umidade danificará os componentes elétricos e reduzirá a longevidade da máquina.
   2. Para manter a máquina de tatuagem em boas condições de funcionamento, verifique o rolamento do rotor (Figura 2C) para certificar-se de que não se soltou devido às vibrações²². Isso pode ser apertado com uma chave Allen ou chave de fenda sextavada.
   3. Cerca de uma vez por mês, lubrifique o rolamento no braço do rotor usando uma graxa lubrificante espessa²².
   4. Em algumas máquinas de tatuagem, o braço do rotor pode ficar preso e não vibrar. Para corrigir isso, gire o braço do rotor ou comprima a mola para que a agulha fique na posição abaixada (Figura 2C).

Resultados

Tatuagens de alta qualidade terão traços escuros e legíveis no peito do sapo e podem ser claramente diferenciadas a vários metros de distância (Figura 5A). Em geral, números e marcações maiores são melhores para legibilidade, mas nomes e números mais longos podem ser reduzidos para caber confortavelmente no peito do sapo. A longevidade da tatuagem é mais difícil de julgar, mas as tatuagens de sapo de alta qualidade devem permanecer escuras e legíveis por pelo menos 3-6 meses (

Discussão

Tatuar humanos é uma forma de arte que remonta a milhares de anos e, desde que os humanos se tatuam, eles também tatuam ou marcam animais²³. O equipamento e as técnicas para marcar animais, particularmente mamíferos, estão bem estabelecidos, bem documentados e amplamente acessíveis. Embora a marcação de animais fosse originalmente para distinguir o gado e os impedimentos de roubo²³, seu papel na pesquisa biomédica tornou-se igualmente importante.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1203RLB	Packaged sterile
5 Needle Round Disposable ULTRA	Worldwide Tattoo Supply	HTIPRS5-U	Packaged sterile
5 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1205RLB	Packaged sterile
7 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1207RLB	Packaged sterile
Clip Cord	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Foot pedal	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Inkpots	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Kimwipes, delicate task wipes	Fisher Scientific	06-666A
RCA Connection	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Scream Ink Pitch Black, 1oz	Worldwide Tattoo Supply	SI101
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Stainless steel grips	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set	Worldwide Tattoo Supply	STEALTH2-SET
Styrofoam island	N/A	N/A	This is the lid of a styrofoam cold shipping container
Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)	Sigma-Aldrich	E10521	CAUTION: IRRITANT
Unbleached paper towels	Grainger	2U229	Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians
Voltage Supply	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Wash bottle (with frog-safe water)	Fisher Scientific	FB0340923T	Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS
X. laevis adult female	Xenopus1	N/A
Zip-top plastic bag	N/A	N/A	This bag should be large enough to hold the styrofoam island