Methoden zum Tätowieren von Xenopus laevis mit einer rotierenden Tätowiermaschine

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir Methoden zum Tätowieren von adulten Xenopus laevis (Afrikanischer Krallenfrosch) mit einer rotierenden Tätowiermaschine. Das richtige Tätowieren führt zu dunklen, gut lesbaren Ziffern, die mehrere Monate halten und die Tiere für Forschungs- und Aufzeichnungszwecke leicht unterscheidbar machen.

Zusammenfassung

Tiermodelle erweitern den Anwendungsbereich der biomedizinischen Forschung, erweitern unser Verständnis der Entwicklungs-, Molekular- und Zellbiologie und ermöglichen es Forschern, menschliche Krankheiten zu modellieren. Die Aufzeichnung und Verfolgung einzelner Tiere ermöglicht es den Forschern, die Anzahl der für Studien erforderlichen Tiere zu reduzieren und die Praktiken zur Verbesserung des Tierwohls zu verfeinern. Es gibt mehrere gut dokumentierte Methoden zur Markierung und Verfolgung von Säugetieren, darunter Ohrstanzen und Ohrmarken. Die Methoden zur Markierung aquatischer Amphibienarten sind jedoch begrenzt, da die vorhandenen Ressourcen veraltet, ineffektiv oder unerschwinglich teuer sind. In diesem Manuskript skizzieren wir Methoden und Best Practices für die Markierung von Xenopus laevis mit einer rotierenden Tätowiermaschine. Die richtige Tätowierung führt zu qualitativ hochwertigen Tätowierungen, die Individuen für Forscher leicht unterscheidbar machen und ein minimales Risiko für die Gesundheit der Tiere darstellen. Wir beleuchten auch die Ursachen für minderwertige Tätowierungen, die dazu führen können, dass Tätowierungen schnell verblassen und Tieren unnötigen Schaden zufügen. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern und Tierärzten, Amphibien zu markieren, wodurch sie biologische Replikate und transgene Linien verfolgen und genaue Aufzeichnungen über die Tiergesundheit führen können.

Einleitung

Tiermodelle sind nützliche Werkzeuge, um Fragen der menschlichen Gesundheit zu untersuchen. In der Praxis erfordert die biomedizinische Forschung mit Tiermodellen eine sorgfältige Organisation und Pflege einer gesunden Tierkolonie. Best Practices für einen ethischen Umgang und eine ethische Tierhaltung zielen darauf ab, die Anzahl der für Versuche benötigten Tiere zu reduzieren und die Praktiken zu verfeinern, um den Tierschutz zu gewährleisten¹. Die Gattung der Krallenfrösche, zu denen auch Xenopus laevis (X. laevis; Afrikanischer Krallenfrosch) und Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Westlicher Krallenfrosch) werden seit den 1930er Jahren in der biomedizinischen Forschung eingesetzt, als X. laevis von südafrikanischen Ärzten zur Durchführung der ersten Schwangerschaftstests verwendet wurden². Während moderne Schwangerschaftstests keine Frösche mehr erfordern, besteht die Rolle der Xenopus-Forschung fort. Zu den Vorteilen der Verwendung von Xenopus für die biomedizinische Forschung gehören die gut annotierten Genome³, der ganzjährig induzierbare Eisprung großer Gelege⁴ und extern gelegte Eier, die für eine In-vitro-Fertilisation geeignet sind. Diese Eigenschaften machen sie zu einer nützlichen Bereicherung für die Embryologie und Entwicklung von Wirbeltieren ^5,6,7, die Grundlagen der Molekular- und Zellbiologie ^7,8,9,10 und für die Modellierung menschlicher Krankheiten 7,11,12,13.

Zuverlässige Methoden zur Verfolgung einzelner Xenopus-Tiere sind unerlässlich, um biologische Replikate zu erfassen und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit in der Forschung zu verbessern. Da Xenopus häufig in Gruppen untergebracht sind, ermöglicht die Tiermarkierung den Forschern, einzelne Tiere leicht zu verfolgen⁴. Die Führung einer genauen Aufzeichnung der Tiere kann Zeit und Ressourcen sparen und die Fähigkeit zur Nachverfolgung der Gesundheit der Tiere verbessern. Zum Beispiel kann die individuelle Identifizierung von Tieren die Organisationsabläufe für die Generierung transgener Xenopus-Linien verbessern, da dies mehrere Generationen von Fröschen mit spezifischen Genotypen erfordert, die durch Sequenzierung¹⁴ verifiziert werden, was eine Organisation und individuelle Identifizierung der Tiere erfordert. Dies gilt insbesondere dann, wenn diesen Mutationen leicht erkennbare adulte Phänotypen fehlen. In ähnlicher Weise profitiert die Verwendung von Xenopus-Eizellen und -Embryonen zur Untersuchung grundlegender Zell- und Entwicklungsbiologie von der Verfolgung einzelner Tiere. Nach dem Auslösen des Eisprungs müssen sich die Tiere mindestens 3 Monate lang ausruhen, um gesundheitliche Komplikationen wie das Hyperovulationssyndrom^{zu vermeiden 15}. Individuelle Identifizierungsmethoden stellen sicher, dass die Tiere nicht zu häufig zum Eisprung veranlasst werden.

Die Kennzeichnung und Verfolgung von Tieren ermöglicht es dem Laborpersonal auch, die gesundheitlichen Bedenken der Tiere zu verfolgen. Die Erkrankung von Tieren desselben Genotyps kann auf übermäßige Inzucht oder unvorhergesehene gesundheitliche Bedenken im Zusammenhang mit dem Transgen hinweisen. In ähnlicher Weise können Tiere, die nach dem kürzlichen Eisprung krank werden, auf Probleme mit Reagenzien, Materialien oder Techniken hinweisen. Die Verfolgung von Tieren und ihrer Gesundheit ermöglicht es Labormitarbeitern und Tierärzten, nachzugehen, wenn Bedenken wieder auftauchen, und vorbeugende Maßnahmen zu ergreifen, um zukünftige Krankheiten zu verhindern. Bei Säugetieren gibt es zahlreiche Bestimmungsmethoden. Zu den dauerhaften Methoden für Mäuse gehören das Stanzen von Ohren, Ohrmarken, Tätowieren und subkutane Mikrochips¹⁶. Diese können Tiere innerhalb einer Kolonie oder eines Käfigs eindeutig und zuverlässig unterscheiden und können vom Laborpersonal einfach verabreicht werden. Methoden wie das Ohrlochen sind minimalinvasiv, erfordern nur ein Spezialgerät und funktionieren für Tiere jeden Alters. Während diese Systeme für Mäuse unkompliziert und nützlich sind, stellt ihr Einsatz bei Fröschen eine Reihe einzigartiger Herausforderungen dar. Fröschen und anderen Amphibien fehlt eine Ohrmuschel (äußere Ohrstruktur). Einige Forscher haben Tags am Kiefer, an der Zehe oder an den Hintergliedmaßen des Tieres angebracht^17,18. Dieser Ansatz führte zu verschiedenen Problemen: Kiefermarken verursachten Irritationen, und aufgeregte Frösche versuchten, mit ihren Vordergliedmaßen Marken abzureißen¹⁷. Zehenmarken durchbohrten das Gurtband zwischen den Zehen, beeinträchtigten die Bewegung und bergen die Gefahr, verloren zu gehen. Daher benötigen Amphibien ihre eigenen Methoden zur Bestimmung. In der Vergangenheit wurde das Zehenkürzen auch zur Markierung von Amphibien verwendet^17,19. Die Zehe wird mit einer scharfen Schere geschoren, und das Tier kann an der Länge der Zehen an den Vorder- und Hinterpfoten oder an dem Winkel, in dem die Zehe nachgewachsen ist (bei Salamandern), identifiziert werden. Diese Methode wirft jedoch die ethische Befürchtung auf, dass das Scheren der Zehen die Bewegung des Tieres beeinträchtigen kann¹⁷. Darüber hinaus kann dies zu Blutungen führen und ein Infektionsrisiko mit sich bringen. Ein weiteres etabliertes Markierungssystem sind die Hautautotransplantate, bei denen die Haut von einem Teil des Strahls entnommen und chirurgisch mit einem anderen Teil verbunden wird. Zum Beispiel wird ein Verfahren beschrieben, um den Rücken oder die Schulter eines Frosches mit Hilfe eines hellen Hauttransplantats aus seiner Brust^{zu markieren 20}. Hauttransplantationen sind auch mit Einschränkungen und Risiken verbunden: Das Verfahren ist invasiv und birgt das Risiko einer Aeromonas hydrophila-Infektion oder des roten Beins, einer potenziell tödlichen Erkrankung; Die vollständige Heilung des Autotransplantats dauert bis zu 6 Wochen; Und mit den beschriebenen Methoden können nur 6 Frösche zusammen untergebracht werden, da die Plätze für ein Autotransplantat^{begrenzt sind 20}.

Zu den weniger invasiven Markierungsansätzen gehören Glasperlen und Transponderchips^17,19. Bei der Glasperlenmethode werden Glasperlen auf eine kleine Naht aufgefädelt und in die Haut des Frosches eingenäht. Dies bietet eine größere Variabilität als Hautautotransplantate mit mindestens 60 unverwechselbaren Farbkombinationen. Es besteht jedoch die Gefahr, dass sich die Naht lösen und die Kügelchen verloren gehen. Alternativ kann ein Mikrochip-Transponder unter die Haut im dorsalen Lymphsack des Frosches implantiert werden. Dies gilt als die dauerhafteste Markierungsmethode und ermöglicht es, eine potenziell unendliche Anzahl von Tieren individuell zu identifizieren und zu katalogisieren. Dies ist jedoch auch die teuerste Methode, da einzelne Mikrochips teuer sind und die Markierung einer großen Kolonie kostspielig wäre. Mikrochips benötigen auch einen speziellen Scanner, um¹⁹ zu lesen. Ein gängiger Ansatz zur Identifizierung von Xenopus bezieht sich auf die natürliche Färbung und Musterung der Tiere. Dies funktioniert besonders gut bei Fröschen wie X. laevis, die ausgeprägte Muster aufweisen, die bis ins Erwachsenenalter bestehen bleiben. Diese Muster können sich jedoch im Laufe der Zeit bei Belastung ändern, und die Färbung kann anders aussehen, wenn Frösche zwischen transparenten und getönten Behältern bewegt werden¹⁵. Darüber hinaus ist diese Identifizierungsmethode weniger nützlich für X. tropicalis, die im Vergleich zu X. laevis weniger ausgeprägte Markierungsmuster aufweist, oder für Albino-Tiere, die keine Farbmarkierungen aufweisen²¹. Selbst bei Spezies mit unterschiedlichen Markierungen kann das Laborpersonal die Platzierung und Größe der Markierungen unterschiedlich interpretieren, was zu Fehlern bei der Identifizierung führen kann. Aus diesem Grund ist das Fotografieren von Tieren in Verbindung mit einer zusätzlichen Identifizierungsmethode am zuverlässigsten. Daher versuchen wir, Xenopus-Tiere mit einer Technik zu markieren und zu identifizieren, die leicht erkennbar, dauerhaft und minimalinvasiv ist.

Es gibt nur wenige veröffentlichte Quellen, die Methoden zum Tätowieren von Amphibien beschreiben. Das Tätowieren wurde zusammen mit anderen Branding-Techniken beschrieben, darunter Hitzemarken, Silbernitratmarken und Gefriermarken¹⁷. In der gleichen Ressource wurde das Tätowieren durch Zeichnen von Ziffern mit einer 27G-Injektionsnadel durchgeführt, und es wurde festgestellt, dass der Prozess keine Infektion verursachte, im Gegensatz zu den anderen Branding-Techniken, bei denen ein Draht verwendet wurde, der zu einer Ziffer oder einer anderen Markierung geformt wurde. In einer anderen Quelle wurde eine elektrische Tätowiermaschine (beschrieben als vibrierende Nadel) verwendet, um Frösche zu markieren, aber es wurden nur wenige Details über die Technik geliefert^17,19. Die Autoren warnen davor, dass dieses Verfahren durch die Störung der schützenden Schleimschicht des Frosches das Risiko für ein rotes Bein erhöht. Es gibt zwar keine Markierungs- oder Identifizierungsmethode, die sowohl völlig nicht-invasiv (z. B. Fotos) als auch dauerhaft (z. B. Mikrochips) ist, aber das Tätowieren stellt einen wirksamen Kompromiss dar. Das Tätowieren ist im Vergleich zu anderen Techniken, wie z. B. Hautautotransplantaten, relativ einfach. Zu den weiteren Vorteilen gehören eine kleinere Lernkurve und eine relativ günstige Ausstattung. Das Tätowieren von Amphibien im Wasser bringt gewisse Herausforderungen mit sich, die Forscher einschüchtern und die erfolgreiche Tiermarkierung beeinträchtigen können. Diese Arbeit zielt darauf ab, Forschern gut dokumentierte Methoden zum Tätowieren von erwachsenen Xenopus mit einer rotierenden Tätowiermaschine an die Hand zu geben.

Protokoll

Alle beschriebenen Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Dartmouth College genehmigt.

1. Einrichtung der Ausrüstung

HINWEIS: Ein Workflow für das Verfahren und ein Beispiel für die Einrichtung einer Prüfbank sind enthalten (Abbildung 1).

1. Verbinde die Tattoopistole und das Fußpedal mit dem Stromnetz. Positionieren Sie das Fußpedal unter der Arbeitsfläche.
2. Zusammenbau der Tattoo-Pistole
   1. Lösen Sie mit einem Inbusschlüssel oder einem Inbusschraubendreher die Schrauben im Griff (Abbildung 2A, rot eingekreist).
   2. Führen Sie die Kunststoffspitze ganz in den Griff ein. Ziehen Sie die Schraube fest, um sie an Ort und Stelle zu halten.
   3. Führen Sie das Metallrohr in die Rückseite des Griffs ein (Abbildung 2A). Dies wird angepasst, also führen Sie es auf die Hälfte seiner Länge ein. Ziehen Sie die Schraube fest, um sie festzuhalten.
   4. Führen Sie eine Tätowiernadel durch die Rückseite des Griffs, so dass sie bequem in der Kunststoffspitze an der Vorderseite des Griffs sitzt (Abbildung 2B).
   5. Schieben Sie die Rückseite der Nadel und des Metallrohrs durch die Rohrschelle. Stellen Sie das Metallrohr so ein, dass die Nadel bequem in die Kunststoffspitze passt (Abbildung 2B). Ziehen Sie die Rohrschelle von Hand fest, bis sich das Rohr nicht mehr bewegen kann (Abbildung 2C).
   6. Entfernen Sie den schwarzen O-Ring und haken Sie die Nadel in den Rotorarm ein. Setzen Sie den O-Ring wieder ein, um die Nadel zu fixieren (Abbildung 2C).
3. Stellen Sie die Spannung am Netzteil so ein, dass genügend Strom vorhanden ist, um die Haut zu durchbohren, aber nicht so stark, dass es schwierig ist, sie zu kontrollieren. Sobald das Netzteil eingesteckt und angeschlossen ist, drücken Sie das Fußpedal, um sicherzustellen, dass die Maschine funktioniert. Achten Sie darauf, die Nadel nicht auf sich selbst oder andere Mitarbeiter zu richten.
   HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendete Tätowiermaschine funktioniert am besten zwischen 6,0 und 9,0 V, dies kann jedoch zwischen Tätowiermaschinen und Spannungsversorgungen variieren und sollte empirisch bestimmt werden.
4. Füllen Sie die Kappe eines 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens oder eines bereitgestellten Kunststoff-Tintenfasses mit schwarzer Tätowierfarbe zu etwa drei Vierteln.

2. Anästhesie

1. Bereiten Sie die Anästhesie in einem Tank vor, der groß genug ist, um ein erwachsenes Weibchen X. laevis Frosch zu tauchen.
   1. Mit froschfestem (chlorfreiem) Wasser Tricain bis zur Endkonzentration von 1,5 g/l und Natriumbicarbonat bis zur Endkonzentration von 3,5 g/l hinzufügen. Der pH-Wert dieser Lösung beträgt 7,15.
      ACHTUNG: Tricain ist ein Reizstoff.
2. Tauchen Sie einen Frosch in den Anästhesietank. Stellen Sie sicher, dass der Strahl bis zur Betäubung (7-8 Minuten) in die Tricainlösung eingetaucht bleibt.
   1. Um zu überprüfen, ob der Frosch vollständig betäubt ist, heben Sie ihn auf, halten Sie ihn auf den Kopf und drücken Sie ihn fest auf einen Fuß. Wenn der Frosch nicht zusammenzuckt oder reagiert, kann er sich tätowieren lassen.
   2. Wenn Frösche durchweg länger als 10 Minuten brauchen, um betäubt zu werden, bereiten Sie frische Tricainlösung vor, die mit Natriumbicarbonat gepuffert ist.
      HINWEIS: Frösche sollten nicht länger als 30 Minuten in Tricainlösung¹⁵ verbringen.

3. Tätowieren

HINWEIS: Bevor Sie ein lebendes Tier tätowieren, kann es nützlich sein, an einem Stück Obst mit fester Schale (z. B. einer Zitrone oder Banane) zu üben.

1. Bereite vor dem Tätowieren einen Auffangtank für die Frösche vor. Füllen Sie einen Tank mit 10-15 l frischem froschsicherem Wasser und fügen Sie eine Styroporinsel hinzu. Dies bietet dem Frosch eine Oberfläche, auf der er aufwachen kann, ohne zu ertrinken.
   HINWEIS: Eine Styroporinsel kann mit dem Deckel eines Styropor-Kalttransportbehälters hergestellt werden, der in einem Beutel mit Reißverschluss platziert ist.
2. Legen Sie den betäubten Frosch auf den Rücken auf ein trockenes Papiertuch oder Bankpapier (Abbildung 3A). Verwenden Sie ungebleichte (braune) Papiertücher für alle Arbeiten, bei denen Frösche zu tun haben.
3. Wischen Sie mit einem trockenen, fusselfreien Tuch das Wasser und den Schleim von der Brust des Frosches ab.
4. Finde das Brustbein mit den Fingern in der Mitte der Brust des Frosches und halte die Haut mit der nicht dominanten Hand straff.
5. Markieren des Frosches
   1. Halten Sie die zusammengebaute Tätowierpistole senkrecht relativ zur Arbeitsfläche und tauchen Sie die Nadel in die Tinte (Abbildung 3B).
   2. Halten Sie die zusammengebaute Tätowierpistole senkrecht und drücken Sie die Nadelspitze auf die Haut des Frosches, bevor Sie das Fußpedal drücken. Zeichnen Sie Linien auf die Haut des Frosches und üben Sie dabei gleichmäßigen Druck aus.
      HINWEIS: Leichte Blutungen oder Rötungen sind normal, ebenso wie leichte Hautschuppungen.
   3. Wenn sich die Nadel an der Haut des Frosches verfängt, entfernen Sie überschüssige Tinte oder Haut mit einem Tuch von der Nadel. Überschüssige Tinte ist beim Tätowieren normal.
   4. Wenn die Brust des Frosches mit zu viel Tinte bedeckt ist, um den markierten Bereich deutlich zu sehen (Abbildung 3C), entfernen Sie überschüssige Tinte mit froschsicherem Wasser und einem Tuch (Abbildung 3C'). Dann die Feuchtigkeit mit einem trockenen Tuch ableiten und mit dem Einfärben fortfahren.
      HINWEIS: Vor dem Tätowieren kann eine Quetschflasche mit froschsicherem Wasser vorbereitet werden.
   5. Fahren Sie mit der Tinte im selben Bereich fort, bis nach dem Abwischen der überschüssigen Tinte dunkle, lesbare Zahlen übrig bleiben (Abbildung 3D). Anstatt die gesamte Markierung oder Zahl in einem Strich zu zeichnen, machen Sie immer wieder kleinere Striche, insbesondere bei Kurven.

4. Wiederherstellung

1. Befeuchten Sie ein Papiertuch mit froschsicherem Wasser und legen Sie es flach auf die Styroporinsel (Abbildung 4A).
2. Rückführung von Fröschen in stehende Becken
   1. Legen Sie den Frosch mit dem Bauch nach unten auf das Handtuch mit dem Gesicht zum Wasser (Abbildung 4B). Falten Sie die Hälfte des Papiertuchs über die hintere Hälfte des Frosches und befeuchten Sie mit den hohlen Händen die Oberseite des Frosches. Sobald ein Frosch aus der Narkose kommt (ca. 1 h nach dem Tätowieren), geht er selbstständig ins Wasser und schwimmt normal.
   2. Bringen Sie die Frösche nach 24 Stunden in die Langzeithaltung zurück, sobald die Tätowierung vollständig verheilt ist.

5. Reinigung und Wartung der Geräte

1. Wiederverwendung und Autoklavieren von Tätowiernadeln
   1. Spülen Sie die Nadeln mit 100 % Isopropanol und entionisiertem Wasser aus, um die Tinte zu lösen und die verbleibende Tinte, die sich nicht aufgelöst hat, abzuschrubben.
   2. Legen Sie die Nadeln nach dem Schrubben in ein Autoklaviergehäuse aus Metall oder wickeln Sie sie mit Aluminiumfolie ein und autoklavieren Sie sie 30 Minuten lang im Trockengang.
2. Wenn sich Tinte auf Teilen der Tätowiermaschine oder anderer Geräte befindet, wische sie mit 100% Ethanol und einem Papiertuch ab.
3. Die Anästhesielösung hat eine endgültige Tricainkonzentration von ca. 0,5%. Entsorgen Sie diese gemäß den Richtlinien der institutionellen Entsorgung gefährlicher Abfälle.
4. Lagerung und Wartung der Ausrüstung
   1. Wenn möglich, lagere die Tätowiermaschine in einem trockenen Raum. Übermäßige Feuchtigkeit beschädigt die elektrischen Komponenten und verringert die Langlebigkeit der Maschine.
   2. Um die Tätowiermaschine in gutem Zustand zu halten, überprüfen Sie das Lager am Rotor (Abbildung 2C), um sicherzustellen, dass es sich nicht durch Vibrationen²² gelöst hat. Dieser kann mit einem Inbusschlüssel oder Inbusschraubendreher festgezogen werden.
   3. Schmieren Sie etwa einmal im Monat das Lager am Rotorarm mit einem dickflüssigen Schmierfett²².
   4. Bei einigen Tätowiermaschinen kann der Rotorarm stecken bleiben und vibriert nicht. Um dies zu korrigieren, drehen Sie den Rotorarm oder drücken Sie die Feder so zusammen, dass sich die Nadel in der abgesenkten Position befindet (Abbildung 2C).

Ergebnisse

Hochwertige Tätowierungen haben dunkle, lesbare Striche auf der Brust des Frosches und können aus mehreren Metern Entfernung deutlich unterschieden werden (Abbildung 5A). Im Allgemeinen sind größere Zahlen und Markierungen besser für die Lesbarkeit, aber längere Namen und Nummern können kleiner gemacht werden, damit sie bequem auf die Brust des Frosches passen. Die Langlebigkeit von Tätowierungen ist schwieriger zu beurteilen, aber hochwertige Frosch-Tattoos sollten mindestens 3-6 Mo...

Diskussion

Das Tätowieren von Menschen ist eine Kunstform, die Tausende von Jahren zurückreicht, und solange Menschen sich selbst tätowiert haben, haben sie auch Tiere tätowiert oder gebrandmarkt²³. Die Ausrüstung und die Techniken zur Markierung von Tieren, insbesondere von Säugetieren, sind gut etabliert, gut dokumentiert und allgemein zugänglich. Während die Kennzeichnung von Tieren ursprünglich zur Unterscheidung von Nutztieren und zur Abschreckung von Diebstahl diente²³,...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1203RLB	Packaged sterile
5 Needle Round Disposable ULTRA	Worldwide Tattoo Supply	HTIPRS5-U	Packaged sterile
5 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1205RLB	Packaged sterile
7 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1207RLB	Packaged sterile
Clip Cord	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Foot pedal	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Inkpots	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Kimwipes, delicate task wipes	Fisher Scientific	06-666A
RCA Connection	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Scream Ink Pitch Black, 1oz	Worldwide Tattoo Supply	SI101
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Stainless steel grips	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set	Worldwide Tattoo Supply	STEALTH2-SET
Styrofoam island	N/A	N/A	This is the lid of a styrofoam cold shipping container
Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)	Sigma-Aldrich	E10521	CAUTION: IRRITANT
Unbleached paper towels	Grainger	2U229	Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians
Voltage Supply	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Wash bottle (with frog-safe water)	Fisher Scientific	FB0340923T	Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS
X. laevis adult female	Xenopus1	N/A
Zip-top plastic bag	N/A	N/A	This bag should be large enough to hold the styrofoam island