Metodi per tatuare lo Xenopus laevis con una macchinetta rotativa per tatuaggi

Riepilogo

Qui, descriviamo i metodi per tatuare Xenopus laevis adulto (rana artigliata africana) con una macchinetta per tatuaggi rotante. Un tatuaggio corretto si traduce in numeri scuri e facilmente leggibili che durano per diversi mesi e rendono gli animali facilmente distinguibili per scopi di ricerca e registrazione.

Abstract

I modelli animali ampliano l'ambito della ricerca biomedica, migliorando la nostra comprensione della biologia dello sviluppo, molecolare e cellulare e consentendo ai ricercatori di modellare le malattie umane. La registrazione e il monitoraggio dei singoli animali consente ai ricercatori di ridurre il numero di animali necessari per lo studio e di perfezionare le pratiche per migliorare il benessere degli animali. Esistono diversi metodi ben documentati per marcare e rintracciare i mammiferi, tra cui la punzonatura delle orecchie e i marchi auricolari. Tuttavia, i metodi per marcare le specie di anfibi acquatici sono limitati, con le risorse esistenti obsolete, inefficaci o proibitive. In questo manoscritto, descriviamo i metodi e le migliori pratiche per marcare lo Xenopus laevis con una macchinetta rotativa. Un tatuaggio corretto si traduce in tatuaggi di alta qualità, rendendo gli individui facilmente distinguibili per i ricercatori e ponendo un rischio minimo per la salute degli animali. Evidenziamo anche le cause dei tatuaggi di scarsa qualità, che possono portare a tatuaggi che sbiadiscono rapidamente e causano danni inutili agli animali. Questo approccio consente a ricercatori e veterinari di marcare gli anfibi, consentendo loro di tracciare le repliche biologiche e le linee transgeniche e di tenere registri accurati della salute degli animali.

Introduzione

I modelli animali sono strumenti utili per indagare su questioni relative alla salute umana. In pratica, la ricerca biomedica che utilizza modelli animali richiede un'attenta organizzazione e il mantenimento di una colonia animale sana. Le migliori pratiche per la gestione e l'allevamento etico degli animali mirano a ridurre il numero di animali necessari per la sperimentazione e a perfezionare le pratiche per garantire il benessere degli animali¹. Il genere della rana artigliata, tra cui Xenopus laevis (X. laevis; Rana artigliata africana) e Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Rana artigliata occidentale), sono stati utilizzati nella ricerca biomedica dal 1930, quando X. laevis è stato utilizzato dai medici sudafricani per condurre i primi test di gravidanza². Sebbene i moderni test di gravidanza non richiedano più rane, il ruolo della ricerca su Xenopus persiste. I vantaggi dell'utilizzo di Xenopus per la ricerca biomedica includono i genomi ben annotati³, l'ovulazione inducibile tutto l'anno di grandi covate di uova⁴ e gli ovuli deposti esternamente suscettibili di fecondazione in vitro. Queste caratteristiche li rendono una risorsa utile per l'embriologia e lo sviluppo dei vertebrati ^5,6,7, la biologia molecolare e cellulare di base 7,8,9,10 e per la modellazione delle malattie umane 7,11,12,13.

Metodi affidabili per tracciare i singoli animali di Xenopus sono essenziali per registrare le repliche biologiche e migliorare il rigore e la riproducibilità della ricerca. Poiché gli Xenopus sono spesso alloggiati in gruppi, la marcatura degli animali consente ai ricercatori di rintracciare facilmente i singoli animali⁴. Mantenere un registro accurato degli animali può far risparmiare tempo e risorse e migliorare la capacità di monitorare la salute degli animali. Ad esempio, l'identificazione individuale degli animali può migliorare i flussi di lavoro organizzativi per la generazione di linee transgeniche di Xenopus , poiché ciò richiede più generazioni di rane con genotipi specifici verificati dal sequenziamento¹⁴, che richiede l'organizzazione e l'identificazione individuale degli animali. Ciò è particolarmente vero quando queste mutazioni mancano di fenotipi adulti facilmente distinguibili. Allo stesso modo, l'uso di ovociti ed embrioni di Xenopus per studiare la biologia cellulare e dello sviluppo di base trae vantaggio dal monitoraggio dei singoli animali. Dopo aver indotto l'ovulazione, gli animali devono riposare per un minimo di 3 mesi per prevenire complicazioni di salute come la sindrome da iper-ovulazione¹⁵. I metodi di identificazione individuali garantiscono che gli animali non siano indotti a ovulare troppo frequentemente.

La marcatura e il monitoraggio degli animali consentono inoltre al personale di laboratorio di tenere traccia dei problemi di salute degli animali. Gli animali dello stesso genotipo che si ammalano possono indicare un'eccessiva consanguineità o problemi di salute imprevisti associati al transgene. Allo stesso modo, gli animali che si ammalano dopo una recente ovulazione possono indicare problemi con reagenti, materiali o tecniche. Il monitoraggio degli animali e della loro salute consente al personale di laboratorio e ai veterinari di seguire quando le preoccupazioni riemergono e di adottare misure preventive per prevenire malattie future. Nei mammiferi esistono numerosi metodi di identificazione. I metodi permanenti per i topi includono punzonatura dell'orecchio, marchi auricolari, tatuaggi e microchip sottocutanei¹⁶. Questi possono differenziare in modo chiaro e affidabile gli animali all'interno di una colonia o di una gabbia e possono essere facilmente somministrati dal personale di laboratorio. Metodi come la punzonatura dell'orecchio sono minimamente invasivi, richiedono solo un'attrezzatura specializzata e funzionano per animali della maggior parte delle età. Sebbene questi sistemi siano semplici e utili per i topi, il loro utilizzo nelle rane presenta una serie unica di sfide. Le rane e gli altri anfibi mancano di un padiglione auricolare (struttura dell'orecchio esterno). Alcuni ricercatori hanno attaccato etichette alla mascella, al dito del piede o all'arto posteriore dell'animale^17,18. Questo approccio ha comportato vari problemi: le etichette della mascella causavano irritazione e le rane agitate tentavano di staccare le etichette con gli arti anteriori¹⁷. Le targhette perforavano la fettuccia tra le dita dei piedi, compromettendo i movimenti e correndo il rischio di perdersi. Pertanto, gli anfibi richiedono i propri metodi per l'identificazione. Storicamente, il toe-clipping è stato utilizzato anche per marcare gli anfibi^17,19. Il dito del piede viene tagliato con un paio di forbici affilate e l'animale può essere identificato dalla lunghezza delle dita dei piedi anteriori e posteriori o dall'angolo con cui il dito è ricresciuto (nelle salamandre). Tuttavia, questo metodo pone la preoccupazione etica che il taglio delle dita dei piedi possa compromettere il movimento dell'animale¹⁷. Inoltre, questo può causare sanguinamento e introdurre un rischio di infezione. Un altro sistema di marcatura consolidato è l'autotrapianto cutaneo, in cui la pelle viene prelevata da una parte della rana e attaccata chirurgicamente a un'altra parte. Ad esempio, viene descritto un metodo per marcare la schiena o la spalla di una rana utilizzando un innesto di pelle di colore chiaro dal suo torace²⁰. Gli innesti cutanei comportano anche limitazioni e rischi: la procedura è invasiva e introduce il rischio di infezione da Aeromonas hydrophila, o gamba rossa, un'afflizione potenzialmente fatale; la guarigione completa dell'autotrapianto richiede fino a 6 settimane; E con i metodi descritti, solo 6 rane possono essere alloggiate insieme a causa dei posti limitati per mettere un autotrapianto²⁰.

Gli approcci di marcatura meno invasivi includono perle di vetro e chip transponder^17,19. Nel metodo delle perle di vetro, le perle di vetro vengono infilate su una piccola sutura e cucite nella pelle della rana. Ciò fornisce una maggiore variabilità rispetto agli autotrapianti cutanei, con almeno 60 combinazioni di colori distintive. C'è, tuttavia, il rischio che la sutura possa fuoriuscire e provocare la perdita delle perline. In alternativa, un transponder a microchip può essere impiantato sotto la pelle nel sacco linfatico dorsale della rana. Questo è considerato il metodo di marcatura più permanente e consente di identificare e catalogare individualmente un numero potenzialmente infinito di animali. Tuttavia, questo è anche il metodo più costoso, poiché i singoli microchip sono costosi e una grande colonia sarebbe costosa da marcare. I microchip richiedono anche uno scanner speciale per leggere¹⁹. Un approccio comune per l'identificazione di Xenopus è fare riferimento alla colorazione e al disegno naturale degli animali. Questo funziona particolarmente bene per le rane come X. laevis, che hanno modelli distinti che rimangono per tutta l'età adulta. Tuttavia, questi modelli possono cambiare nel tempo con lo stress e la colorazione può apparire diversa quando le rane vengono spostate tra contenitori trasparenti e colorati¹⁵. Inoltre, questo metodo di identificazione è meno utile per X. tropicalis, che ha modelli di marcatura meno distinti rispetto a X. laevis, o per gli animali albini, che non hanno marcature colorate²¹. Anche per le specie con marcature distinte, il personale di laboratorio può interpretare il posizionamento e le dimensioni delle marcature in modo diverso, il che può causare errori nell'identificazione. Per questo motivo, fotografare gli animali è più affidabile in combinazione con un metodo di identificazione aggiuntivo. Pertanto, cerchiamo di marcare e identificare gli animali Xenopus utilizzando una tecnica facilmente distinguibile, permanente e minimamente invasiva.

Ci sono poche risorse pubblicate che descrivono i metodi per tatuare gli anfibi. Il tatuaggio è stato descritto insieme ad altre tecniche di branding, tra cui marchi di calore, marchi di nitrato d'argento e marchi di congelamento¹⁷. Nella stessa risorsa, il tatuaggio è stato fatto disegnando numeri con un ago ipodermico da 27G, e il processo è stato notato per non causare infezioni, in contrasto con le altre tecniche di marchiatura, che utilizzavano un filo a forma di numero o altro segno. In un'altra fonte, una macchinetta elettrica per tatuaggi (descritta come un ago vibrante) è stata utilizzata per marcare le rane, ma sono stati forniti pochi dettagli sulla tecnica^17,19. Gli autori avvertono che disturbando lo strato protettivo di melma della rana, questa procedura aumenta il rischio di zampe rosse. Sebbene non esista un metodo di marcatura o identificazione che sia completamente non invasivo (come le fotografie) e permanente (come i microchip), il tatuaggio fornisce un compromesso efficace. Il tatuaggio è relativamente semplice rispetto ad altre tecniche, come gli autotrapianti cutanei. Ulteriori vantaggi includono una curva di apprendimento più piccola e attrezzature relativamente economiche. Tatuare gli anfibi acquatici comporta alcune sfide, che possono intimidire i ricercatori e compromettere la marcatura degli animali. Questo articolo mira a fornire ai ricercatori metodi ben documentati per tatuare Xenopus adulti con una macchinetta rotativa.

Protocollo

Tutte le procedure per gli animali descritte sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Dartmouth College.

1. Configurazione dell'attrezzatura

NOTA: Sono inclusi un flusso di lavoro per la procedura e un esempio di configurazione del banco (Figura 1).

1. Collegare la pistola per tatuaggi e il pedale all'alimentazione. Posizionare il pedale sotto la superficie di lavoro.
2. Assemblaggio della pistola per tatuaggi
   1. Utilizzando una chiave a brugola o un cacciavite esagonale, allentare le viti nell'impugnatura (Figura 2A, cerchiate in rosso).
   2. Inserire la punta di plastica fino in fondo nell'impugnatura. Serrare la vite per tenerla in posizione.
   3. Inserire il tubo metallico nella parte posteriore dell'impugnatura (Figura 2A). Questo verrà regolato, quindi inseriscilo a metà della sua lunghezza. Serrare la vite per tenerla in posizione.
   4. Inserisci un ago per tatuaggio attraverso la parte posteriore dell'impugnatura in modo che si trovi comodamente nella punta di plastica nella parte anteriore dell'impugnatura (Figura 2B).
   5. Far scorrere la parte posteriore dell'ago e il tubo metallico attraverso il morsetto del tubo. Regolare il tubo di metallo in modo che l'ago si adatti comodamente alla punta di plastica (Figura 2B). Stringere a mano il morsetto del tubo fino a quando il tubo non è in grado di muoversi (Figura 2C).
   6. Rimuovere l'O-ring nero e agganciare l'ago al braccio del rotore; sostituire l'O-ring per fissare l'ago in posizione (Figura 2C).
3. Impostare la tensione sull'alimentatore in modo che ci sia abbastanza potenza per perforare la pelle, ma non così potente da essere difficile da controllare. Una volta che l'alimentatore è collegato e collegato, premere il pedale per assicurarsi che la macchina funzioni. Fare attenzione a non puntare l'ago verso se stessi o altri membri del personale.
   NOTA: La macchinetta per tatuaggi utilizzata in questo protocollo funziona meglio tra 6,0 e 9,0 V, ma questo può variare tra le macchinette per tatuaggi e gli alimentatori di tensione e dovrebbe essere determinato empiricamente.
4. Riempire il tappo di una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml o di un calamaio di plastica in dotazione con inchiostro nero per tatuaggi fino a circa tre quarti.

2. Anestesia

1. Preparare l'anestesia in una vasca abbastanza grande da immergere una femmina adulta di rana X. laevis .
   1. Utilizzando acqua sicura per le rane (senza cloro), aggiungere la tricaina alla concentrazione finale di 1,5 g/L e il bicarbonato di sodio alla concentrazione finale di 3,5 g/L. Mescolare per sciogliere. Il pH di questa soluzione è 7,15.
      ATTENZIONE: La tricaina è irritante.
2. Immergere una rana nella vasca di anestesia. Assicurarsi che la rana rimanga immersa nella soluzione di tricaina fino a quando non viene anestetizzata (7-8 min).
   1. Per verificare se la rana è completamente anestetizzata, raccoglila, tienila a testa in giù e stringila con decisione su un piede. Se la rana non sussulta o non risponde, può essere tatuata.
   2. Se le rane impiegano costantemente più di 10 minuti per essere anestetizzate, preparare una soluzione fresca di tricaina tamponata con bicarbonato di sodio.
      NOTA: Le rane non dovrebbero trascorrere più di 30 minuti nella soluzione di tricaina¹⁵.

3. Tatuaggio

NOTA: Prima di tatuare un animale vivo, può essere utile esercitarsi su un frutto con una buccia soda (come un limone o una banana).

1. Prepara una vasca di recupero per le rane prima di tatuare. Riempi un serbatoio con 10-15 L di acqua fresca sicura per le rane e aggiungi un'isola di polistirolo. Questo fornirà una superficie in cui la rana si sveglierà senza annegare.
   NOTA: Un'isola di polistirolo può essere realizzata utilizzando il coperchio di un contenitore di spedizione freddo in polistirolo posizionato all'interno di una borsa con cerniera.
2. Posizionare la rana anestetizzata sul dorso su un tovagliolo di carta asciutto o carta da banco (Figura 3A). Usa tovaglioli di carta non sbiancati (marroni) per tutti i lavori che coinvolgono le rane.
3. Usando un panno asciutto e privo di lanugine, rimuovere l'acqua e il muco dal petto della rana.
4. Trova lo sterno al centro del torace della rana con le dita e, usando la mano non dominante, tieni tesa la pelle.
5. Marcatura della rana
   1. Tenere la pistola per tatuaggi assemblata verticalmente rispetto alla superficie di lavoro e immergere l'ago nell'inchiostro (Figura 3B).
   2. Mantenendo la pistola per tatuaggi assemblata in verticale, premere la punta dell'ago sulla pelle della rana prima di premere il pedale. Disegna delle linee sulla pelle della rana applicando una pressione uniforme.
      NOTA: Qualche lieve sanguinamento o arrossamento è normale, così come una piccola desquamazione della pelle.
   3. Se l'ago si impiglia nella pelle della rana, rimuovere l'inchiostro in eccesso o la pelle dall'ago con una salvietta. L'eccesso di inchiostro è normale durante il tatuaggio.
   4. Se il petto della rana è coperto da troppo inchiostro per vedere chiaramente l'area da contrassegnare (Figura 3C), rimuovere l'inchiostro in eccesso con acqua sicura per le rane e una salvietta (Figura 3C'). Quindi, rimuovere l'umidità con un panno asciutto e continuare a inchiostrare.
      NOTA: Prima del tatuaggio si può preparare una bottiglia di acqua sicura per le rane.
   5. Continuare a inchiostrare la stessa area fino a quando rimangono numeri scuri e leggibili dopo aver rimosso l'inchiostro in eccesso (Figura 3D). Invece di disegnare l'intero segno o numero in un solo tratto, fai ripetutamente tratti più piccoli, soprattutto per le curve.

4. Recupero

1. Inumidisci un tovagliolo di carta con acqua sicura per le rane e posizionalo in piano sopra l'isola di polistirolo (Figura 4A).
2. Riportare le rane nei serbatoi in piedi
   1. Appoggiare la rana a pancia in giù sull'asciugamano rivolto verso l'acqua (Figura 4B). Piega metà del tovagliolo di carta sulla metà posteriore del nasetto e, usando le mani a coppa, bagna la parte superiore del nasetto. Una volta che una rana emerge dall'anestesia (circa 1 ora dopo il tatuaggio), entrerà in acqua in modo indipendente e nuoterà normalmente.
   2. Riporta le rane in un alloggio a lungo termine dopo 24 ore, una volta che il tatuaggio è completamente guarito.

5. Pulizia e manutenzione delle attrezzature

1. Riutilizzo e sterilizzazione in autoclave degli aghi per tatuaggi
   1. Sciacquare gli aghi con isopropanolo al 100% e acqua deionizzata per sciogliere l'inchiostro e rimuovere l'inchiostro rimanente che non si è sciolto.
   2. Dopo lo strofinamento, posizionare gli aghi in una custodia metallica per autoclave o avvolgerli con un foglio di alluminio e sterilizzarli in autoclave per 30 minuti con ciclo a secco.
2. Se c'è dell'inchiostro su pezzi della macchinetta per tatuaggi o di altre attrezzature, puliscilo con etanolo al 100% e un tovagliolo di carta.
3. La soluzione anestetica ha una concentrazione finale di tricaina di circa lo 0,5%. Smaltire questo secondo le linee guida istituzionali per la gestione dei rifiuti pericolosi.
4. Stoccaggio e manutenzione delle attrezzature
   1. Se possibile, conservare la macchinetta per tatuaggi in un luogo asciutto. L'umidità in eccesso danneggerà i componenti elettrici e ridurrà la longevità della macchina.
   2. Per mantenere la macchinetta per tatuaggi in buone condizioni, controllare il cuscinetto sul rotore (Figura 2C) per assicurarsi che non si sia allentato a causa delle vibrazioni²². Questo può essere serrato con una chiave a brugola o un cacciavite esagonale.
   3. Circa una volta al mese, lubrificare il cuscinetto sul braccio del rotore con un grasso lubrificante denso²².
   4. Su alcune macchinette per tatuaggi, il braccio del rotore può bloccarsi e non vibrare. Per correggere questo problema, ruotare il braccio del rotore o comprimere la molla in modo che l'ago sia in posizione abbassata (Figura 2C).

Risultati

I tatuaggi di alta qualità avranno tratti scuri e leggibili sul petto della rana e possono essere chiaramente differenziati da diversi metri di distanza (Figura 5A). In generale, i numeri e i segni più grandi sono migliori per la leggibilità, ma i nomi e i numeri più lunghi possono essere rimpiccioliti per adattarsi comodamente al petto della rana. La longevità del tatuaggio è più difficile da giudicare, ma i tatuaggi di rana di alta qualità dovrebbero rimanere scuri e leggibili per ...

Discussione

Tatuare gli esseri umani è una forma d'arte che risale a migliaia di anni fa e, da quando gli esseri umani si tatuano, hanno anche tatuato o marchiato animali²³. Le attrezzature e le tecniche per marcare gli animali, in particolare i mammiferi, sono ben consolidate, ben documentate e ampiamente accessibili. Mentre la marcatura degli animali era originariamente per distinguere il bestiame e i deterrenti contro i furti²³, il suo ruolo nella ricerca biomedica è diventato alt...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1203RLB	Packaged sterile
5 Needle Round Disposable ULTRA	Worldwide Tattoo Supply	HTIPRS5-U	Packaged sterile
5 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1205RLB	Packaged sterile
7 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1207RLB	Packaged sterile
Clip Cord	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Foot pedal	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Inkpots	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Kimwipes, delicate task wipes	Fisher Scientific	06-666A
RCA Connection	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Scream Ink Pitch Black, 1oz	Worldwide Tattoo Supply	SI101
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Stainless steel grips	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set	Worldwide Tattoo Supply	STEALTH2-SET
Styrofoam island	N/A	N/A	This is the lid of a styrofoam cold shipping container
Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)	Sigma-Aldrich	E10521	CAUTION: IRRITANT
Unbleached paper towels	Grainger	2U229	Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians
Voltage Supply	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Wash bottle (with frog-safe water)	Fisher Scientific	FB0340923T	Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS
X. laevis adult female	Xenopus1	N/A
Zip-top plastic bag	N/A	N/A	This bag should be large enough to hold the styrofoam island