Méthodes de tatouage de Xenopus laevis avec une machine à tatouer rotative

Résumé

Ici, nous décrivons les méthodes pour tatouer le Xenopus laevis adulte (grenouille à griffes africaines) avec une machine à tatouer rotative. Un tatouage approprié permet d’obtenir des chiffres sombres et facilement lisibles qui durent plusieurs mois et permettent de distinguer facilement les animaux à des fins de recherche et de tenue de registres.

Résumé

Les modèles animaux élargissent la portée de la recherche biomédicale, approfondissent notre compréhension de la biologie développementale, moléculaire et cellulaire et permettent aux chercheurs de modéliser les maladies humaines. L’enregistrement et le suivi des animaux individuels permettent aux chercheurs de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude et d’affiner les pratiques pour améliorer le bien-être des animaux. Il existe plusieurs méthodes bien documentées pour marquer et suivre les mammifères, notamment le poinçonnage des oreilles et les étiquettes d’oreille. Cependant, les méthodes de marquage des espèces d’amphibiens aquatiques sont limitées, les ressources existantes étant désuètes, inefficaces ou d’un coût prohibitif. Dans ce manuscrit, nous décrivons les méthodes et les meilleures pratiques pour marquer Xenopus laevis avec une machine à tatouer rotative. Un tatouage approprié permet d’obtenir des tatouages de haute qualité, ce qui rend les individus facilement distinguables par les chercheurs et présente un risque minimal pour la santé des animaux. Nous soulignons également les causes des tatouages de mauvaise qualité, qui peuvent entraîner des tatouages qui s’estompent rapidement et causent des dommages inutiles aux animaux. Cette approche permet aux chercheurs et aux vétérinaires de marquer les amphibiens, ce qui leur permet de suivre les réplicats biologiques et les lignées transgéniques et de tenir des registres précis de la santé animale.

Introduction

Les modèles animaux sont des outils utiles pour étudier des questions relatives à la santé humaine. En pratique, la recherche biomédicale utilisant des modèles animaux nécessite une organisation minutieuse et le maintien d’une colonie animale saine. Les meilleures pratiques en matière de manipulation et d’élevage éthiques des animaux visent à réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’expérimentation et à affiner les pratiques pour assurer le bien-être des animaux¹. Le genre de grenouille à griffes, y compris Xenopus laevis (X. laevis ; grenouille à griffes africaines) et Xenopus tropicalis (X. tropicalis ; Grenouille à griffes occidentales), sont utilisés dans la recherche biomédicale depuis les années 1930, lorsque X. laevis a été utilisé par les médecins sud-africains pour effectuer les premiers tests de grossesse². Bien que les tests de grossesse modernes ne nécessitent plus de grenouilles, le rôle de la recherche sur le xénope persiste. Les avantages de l’utilisation du xénope pour la recherche biomédicale comprennent ses génomes bien annotés³, l’ovulation inductible toute l’année de grandes couvées d’œufs⁴ et les œufs pondus à l’extérieur qui se prêtent à la fécondation in vitro. Ces caractéristiques en font un atout utile pour l’embryologie et le développement des vertébrés ^5,6,7, la biologie moléculaire et cellulaire de base 7,8,9,10 et pour la modélisation des maladies humaines 7,11,12,13.

Des méthodes fiables pour suivre les animaux Xénope sont essentielles pour enregistrer les réplicats biologiques et améliorer la rigueur et la reproductibilité de la recherche. Comme les xénopes sont souvent logés en groupes, le marquage des animaux permet aux chercheurs de suivre facilement les animaux individuels⁴. La tenue d’un registre précis des animaux peut permettre d’économiser du temps et des ressources et d’améliorer la capacité de suivre la santé des animaux. Par exemple, l’identification individuelle des animaux peut améliorer les flux de travail d’organisation pour générer des lignées transgéniques de Xénope, car cela nécessite plusieurs générations de grenouilles avec des génotypes spécifiques vérifiés par le séquençage¹⁴, ce qui nécessite l’organisation et l’identification individuelle des animaux. Cela est particulièrement vrai lorsque ces mutations n’ont pas de phénotypes adultes facilement discernables. De même, l’utilisation d’ovocytes et d’embryons de xénope pour étudier la biologie cellulaire et développementale de base bénéficie du suivi d’animaux individuels. Après avoir induit l’ovulation, les animaux doivent se reposer pendant au moins 3 mois pour prévenir les complications de santé telles que le syndrome d’hyper-ovulation¹⁵. Les méthodes d’identification individuelles permettent de ne pas inciter les animaux à ovuler trop fréquemment.

Le marquage et le suivi des animaux permettent également au personnel de laboratoire de suivre les problèmes de santé des animaux. Le fait que des animaux du même génotype tombent malades peut indiquer une consanguinité excessive ou des problèmes de santé imprévus associés au transgène. De même, les animaux qui tombent malades après une ovulation récente peuvent indiquer des problèmes avec les réactifs, les matériaux ou les techniques. Le suivi des animaux et de leur santé permet au personnel de laboratoire et aux vétérinaires de faire un suivi lorsque des problèmes refont surface et de prendre des mesures préventives pour prévenir de futures maladies. Chez les mammifères, il existe de nombreuses méthodes d’identification. Les méthodes permanentes pour les souris comprennent les coups de poing dans les oreilles, les étiquettes d’oreille, le tatouage et les micropuces sous-cutanées¹⁶. Ceux-ci peuvent différencier clairement et de manière fiable les animaux au sein d’une colonie ou d’une cage et peuvent être facilement administrés par le personnel de laboratoire. Les méthodes telles que les coups de poing dans les oreilles sont peu invasives, ne nécessitent qu’une seule pièce d’équipement spécialisé et fonctionnent pour les animaux de tous âges. Bien que ces systèmes soient simples et utiles pour les souris, leur utilisation chez les grenouilles présente un ensemble unique de défis. Les grenouilles et autres amphibiens n’ont pas de pavillon (structure de l’oreille externe). Certains chercheurs ont attaché des étiquettes à la mâchoire, à l’orteil ou au membre postérieur de l’animal^17,18. Cette approche a entraîné divers problèmes : les étiquettes de la mâchoire provoquaient une irritation et les grenouilles agitées tentaient d’enlever les étiquettes avec leurs membres antérieurs¹⁷. Les étiquettes d’orteil perçaient la sangle entre les orteils, ce qui nuisait aux mouvements et comportait le risque de se perdre. En tant que tels, les amphibiens ont besoin de leurs propres méthodes d’identification. Historiquement, la coupe des orteils a également été utilisée pour marquer les amphibiens^17,19. L’orteil est coupé à l’aide d’une paire de ciseaux pointus, et l’animal peut être identifié par la longueur des orteils sur les pattes avant et arrière ou par l’angle auquel l’orteil a repoussé (chez les salamandres). Cependant, cette méthode pose le problème éthique que la coupe des orteils peut entraver le mouvement de l’animal¹⁷. De plus, cela peut provoquer des saignements et introduire un risque d’infection. Un autre système de marquage établi est l’autogreffe de peau, dans laquelle la peau est prélevée sur une partie de la grenouille et attachée chirurgicalement à une autre partie. Par exemple, une méthode est décrite pour marquer le dos ou l’épaule d’une grenouille à l’aide d’une greffe de peau de couleur claire de sa poitrine²⁰. Les greffes de peau comportent également des limites et des risques : la procédure est invasive et introduit un risque d’infection à Aeromonas hydrophila, ou jambe rouge, une affection potentiellement mortelle ; la cicatrisation complète de l’autogreffe prend jusqu’à 6 semaines ; Et avec les méthodes décrites, seules 6 grenouilles peuvent être logées ensemble en raison du nombre limité d’endroits pour mettre une autogreffe²⁰.

Les approches de marquage moins invasives comprennent les billes de verre et les puces de transpondeur^17,19. Dans la méthode des perles de verre, les perles de verre sont enfilées sur une petite suture et cousues dans la peau de la grenouille. Cela offre une plus grande variabilité que les autogreffes de peau, avec au moins 60 combinaisons de couleurs distinctives. Il existe cependant un risque que la suture se détache et entraîne la perte des billes. Alternativement, un transpondeur de micropuce peut être implanté sous la peau dans le sac lymphatique dorsal de la grenouille. Cette méthode est considérée comme la plus permanente et permet d’identifier et de cataloguer individuellement un nombre potentiellement infini d’animaux. Cependant, c’est aussi la méthode la plus coûteuse, car les micropuces individuelles sont chères et une grande colonie serait coûteuse à marquer. Les micropuces nécessitent également un scanner spécial pour lire¹⁹. Une approche courante pour l’identification du xénope consiste à se référer à la coloration et aux motifs naturels des animaux. Cela fonctionne particulièrement bien pour les grenouilles telles que X. laevis, qui ont des motifs distincts qui persistent tout au long de l’âge adulte. Cependant, ces motifs peuvent changer avec le temps avec le stress, et la coloration peut apparaître différente lorsque les grenouilles sont déplacées entre des récipients transparents et teintés¹⁵. De plus, cette méthode d’identification est moins utile pour X. tropicalis, qui a des motifs de marquage moins distincts que X. laevis, ou pour les animaux albinos, qui n’ont pas de marques de couleur²¹. Même pour les espèces avec des marques distinctes, le personnel de laboratoire peut interpréter différemment l’emplacement et la taille des marques, ce qui peut entraîner des erreurs d’identification. Pour cette raison, la photographie des animaux est plus fiable en conjonction avec une méthode d’identification supplémentaire. Par conséquent, nous cherchons à marquer et à identifier les animaux Xenopus à l’aide d’une technique facilement discernable, permanente et peu invasive.

Il existe peu de ressources publiées décrivant les méthodes de tatouage des amphibiens. Le tatouage a été décrit aux côtés d’autres techniques de marquage, notamment les marques de chaleur, les marques de nitrate d’argent et les marques de congélation¹⁷. Dans la même ressource, le tatouage a été fait en dessinant des chiffres avec une aiguille hypodermique 27G, et le processus a été noté comme ne provoquant pas d’infection, contrairement aux autres techniques de marquage, qui utilisaient un fil en forme de chiffre ou d’une autre marque. Dans une autre source, une machine à tatouer électrique (décrite comme une aiguille vibrante) a été utilisée pour marquer les grenouilles, mais peu de détails ont été fournis sur la technique^17,19. Les auteurs avertissent qu’en perturbant la couche de boue protectrice de la grenouille, cette procédure augmente le risque de patte rouge. Bien qu’il n’existe pas de méthode de marquage ou d’identification à la fois totalement non invasive (comme les photographies) et permanente (comme les micropuces), le tatouage constitue un compromis efficace. Le tatouage est relativement simple par rapport à d’autres techniques, telles que les autogreffes de peau. Parmi les autres avantages, citons une courbe d’apprentissage plus courte et un équipement relativement peu coûteux. Le tatouage d’amphibiens aquatiques s’accompagne de certains défis, qui peuvent intimider les chercheurs et nuire au marquage réussi des animaux. Cet article vise à fournir aux chercheurs des méthodes bien documentées pour tatouer le xénope adulte avec une machine à tatouer rotative.

Protocole

Toutes les procédures décrites sur les animaux ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux du Dartmouth College.

1. Configuration de l’équipement

REMARQUE : un flux de travail pour la procédure et un exemple de configuration de banc sont inclus (Figure 1).

1. Connectez le pistolet de tatouage et la pédale à l’alimentation électrique. Placez la pédale sous la surface de travail.
2. Assemblage du pistolet de tatouage
   1. À l’aide d’une clé Allen ou d’un tournevis hexagonal, desserrez les vis de la poignée (Figure 2A, encerclée en rouge).
   2. Insérez l’embout en plastique à fond dans la poignée. Serrez la vis pour la maintenir en place.
   3. Insérez le tube métallique à l’arrière de la poignée (Figure 2A). Celui-ci sera ajusté, alors insérez-le à la moitié de sa longueur. Serrez la vis pour la maintenir en place.
   4. Insérez une aiguille de tatouage à l’arrière de la poignée de manière à ce qu’elle repose confortablement dans la pointe en plastique à l’avant de la poignée (Figure 2B).
   5. Faites glisser l’arrière de l’aiguille et du tube métallique à travers le collier de serrage. Ajustez le tube métallique de manière à ce que l’aiguille s’insère confortablement dans la pointe en plastique (Figure 2B). Serrez à la main le collier de serrage jusqu’à ce qu’il ne puisse plus bouger (Figure 2C).
   6. Retirez le joint torique noir et accrochez l’aiguille sur le bras du rotor ; replacez le joint torique pour fixer l’aiguille en place (Figure 2C).
3. Réglez la tension sur l’alimentation de manière à ce qu’il y ait suffisamment de puissance pour percer la peau, mais pas trop puissante pour qu’elle soit difficile à contrôler. Une fois l’alimentation branchée et connectée, appuyez sur la pédale pour vous assurer que la machine fonctionne. Veillez à ne pas pointer l’aiguille sur vous-même ou sur d’autres membres du personnel.
   REMARQUE : La machine à tatouer utilisée dans ce protocole fonctionne mieux entre 6,0 et 9,0 V, mais cela peut varier entre les machines à tatouer et les alimentations en tension et doit être déterminé empiriquement.
4. Remplissez le capuchon d’un tube de microcentrifugation de 1,5 ml ou d’un encrier en plastique fourni avec de l’encre de tatouage noire jusqu’à ce qu’il soit rempli aux trois quarts.

2. Anesthésie

1. Préparez l’anesthésie dans un réservoir suffisamment grand pour immerger une grenouille X . laevis femelle adulte.
   1. À l’aide d’eau sans danger pour les grenouilles (sans chlore), ajoutez de la tricaïne à la concentration finale de 1,5 g/L et du bicarbonate de sodium à la concentration finale de 3,5 g/L. Mélangez pour dissoudre. Le pH de cette solution est de 7,15.
      ATTENTION : La tricaïne est un irritant.
2. Immergez une grenouille dans le réservoir d’anesthésie. Assurez-vous que la grenouille reste immergée dans la solution de tricaïne jusqu’à ce qu’elle soit anesthésiée (7-8 min).
   1. Pour vérifier si la grenouille est complètement anesthésiée, prenez-la, tenez-la à l’envers et pressez-la fermement sur un pied. Si la grenouille ne bronche pas ou ne répond pas, elle peut être tatouée.
   2. Si les grenouilles mettent constamment plus de 10 minutes pour être anesthésiées, préparez une solution de tricaïne fraîche tamponnée avec du bicarbonate de sodium.
      REMARQUE : Les grenouilles ne doivent pas passer plus de 30 minutes dans la solution de tricaïne¹⁵.

3. Le tatouage

REMARQUE : Avant de tatouer un animal vivant, il peut être utile de s’entraîner sur un morceau de fruit à peau ferme (comme un citron ou une banane).

1. Préparez une cuve de récupération pour les grenouilles avant le tatouage. Remplissez un réservoir de 10 à 15 L d’eau fraîche sans danger pour les grenouilles et ajoutez un îlot en polystyrène. Cela fournira une surface pour que la grenouille puisse se réveiller sans se noyer.
   REMARQUE : Un îlot en polystyrène peut être fabriqué à l’aide du couvercle d’un conteneur d’expédition frigorifique en polystyrène placé à l’intérieur d’un sac à fermeture éclair.
2. Placez la grenouille anesthésiée sur son dos sur une serviette en papier sèche ou du papier de banc (figure 3A). Utilisez des essuie-tout non blanchis (bruns) pour tous les travaux impliquant des grenouilles.
3. À l’aide d’une lingette sèche non pelucheuse, essuyez l’eau et le mucus de la poitrine de la grenouille.
4. Trouvez le sternum au centre de la poitrine de la grenouille avec les doigts et, à l’aide de la main non dominante, maintenez la peau tendue.
5. Marquage de la grenouille
   1. Tenez le pistolet de tatouage assemblé verticalement par rapport à la surface de travail et trempez l’aiguille dans l’encre (Figure 3B).
   2. En gardant le pistolet de tatouage assemblé vertical, appuyez la pointe de l’aiguille sur la peau de la grenouille avant d’appuyer sur la pédale. Tracez des lignes sur la peau de la grenouille tout en appliquant une pression uniforme.
      REMARQUE : Certains saignements ou rougeurs mineurs sont normaux, tout comme une desquamation cutanée mineure.
   3. Si l’aiguille se coince sur la peau de la grenouille, enlevez l’excès d’encre ou de peau de l’aiguille avec une lingette. L’excès d’encre est normal lors du tatouage.
   4. Si la poitrine de la grenouille est recouverte d’une trop grande quantité d’encre pour voir clairement la zone marquée (figure 3C), éliminez l’excès d’encre avec de l’eau sans danger pour la grenouille et une lingette (figure 3C). Ensuite, évacuez l’humidité avec une lingette sèche et continuez l’encrage.
      REMARQUE : Une bouteille compressible d’eau sans danger pour les grenouilles peut être préparée avant le tatouage.
   5. Continuez à encrer la même zone jusqu’à ce que les chiffres soient foncés et lisibles après avoir essuyé l’excès d’encre (Figure 3D). Au lieu de dessiner l’ensemble du marquage ou du numéro en un seul trait, faites à plusieurs reprises des traits plus petits, en particulier pour les courbes.

4. Récupération

1. Mouillez une serviette en papier avec de l’eau sans danger pour les grenouilles et placez-la à plat sur l’îlot en polystyrène (figure 4A).
2. Remise des grenouilles dans les bassins sur pied
   1. Posez la grenouille sur le ventre sur la serviette face à l’eau (Figure 4B). Pliez la moitié de l’essuie-tout sur la moitié arrière de la grenouille et, à l’aide des mains en coupe, mouillez le haut de la grenouille. Une fois qu’une grenouille sort de l’anesthésie (environ 1 h après le tatouage), elle entrera dans l’eau de manière indépendante et nagera normalement.
   2. Remettez les grenouilles dans un logement à long terme après 24 heures, une fois que le tatouage est complètement cicatrisé.

5. Nettoyage et entretien de l’équipement

1. Réutilisation et autoclave des aiguilles de tatouage
   1. Rincez les aiguilles dans de l’isopropanol à 100 % et de l’eau déminéralisée pour détacher l’encre et frotter l’encre restante qui n’est pas dissoute.
   2. Après avoir frotté, placez les aiguilles dans un boîtier d’autoclave en métal ou enveloppez-les de papier d’aluminium et d’autoclave pendant 30 minutes sur un cycle de séchage.
2. S’il y a de l’encre sur des morceaux de la machine à tatouer ou d’un autre équipement, essuyez-le avec de l’éthanol à 100% et une serviette en papier.
3. La solution anesthésique a une concentration finale de tricaïne d’environ 0,5 %. Éliminez-les conformément aux lignes directrices de l’établissement en matière de gestion des déchets dangereux.
4. Stockage et entretien de l’équipement
   1. Si possible, rangez la machine à tatouer dans une pièce sèche. L’excès d’humidité endommagera les composants électriques et réduira la longévité de la machine.
   2. Pour maintenir la machine à tatouer en bon état de fonctionnement, vérifiez le roulement du rotor (Figure 2C) pour vous assurer qu’il ne s’est pas détaché des vibrations²². Celui-ci peut être serré à l’aide d’une clé Allen ou d’un tournevis hexagonal.
   3. Environ une fois par mois, lubrifiez le roulement sur le bras du rotor à l’aide d’une graisse lubrifiante épaisse²².
   4. Sur certaines machines à tatouer, le bras du rotor peut se coincer et ne vibrera pas. Pour corriger ce problème, tournez le bras du rotor ou comprimez le ressort de sorte que l’aiguille soit en position abaissée (Figure 2C).

Résultats

Les tatouages de haute qualité auront des traits sombres et lisibles sur la poitrine de la grenouille et peuvent être clairement différenciés à plusieurs pieds de distance (Figure 5A). En général, les grands nombres et les marques sont meilleurs pour la lisibilité, mais les noms et les numéros plus longs peuvent être réduits pour s’adapter confortablement à la poitrine de la grenouille. La longévité des tatouages est plus difficile à juger, mais les tatouages de grenouilles ...

Discussion

Tatouer des humains est une forme d’art qui remonte à des milliers d’années, et depuis que les humains se tatouent eux-mêmes, ils ont également tatoué ou marqué des animaux²³. L’équipement et les techniques de marquage des animaux, en particulier des mammifères, sont bien établis, bien documentés et largement accessibles. Alors que le marquage des animaux servait à l’origine à distinguer le bétail et les moyens de dissuasion contre le vol²³, son rôle d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1203RLB	Packaged sterile
5 Needle Round Disposable ULTRA	Worldwide Tattoo Supply	HTIPRS5-U	Packaged sterile
5 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1205RLB	Packaged sterile
7 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1207RLB	Packaged sterile
Clip Cord	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Foot pedal	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Inkpots	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Kimwipes, delicate task wipes	Fisher Scientific	06-666A
RCA Connection	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Scream Ink Pitch Black, 1oz	Worldwide Tattoo Supply	SI101
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Stainless steel grips	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set	Worldwide Tattoo Supply	STEALTH2-SET
Styrofoam island	N/A	N/A	This is the lid of a styrofoam cold shipping container
Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)	Sigma-Aldrich	E10521	CAUTION: IRRITANT
Unbleached paper towels	Grainger	2U229	Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians
Voltage Supply	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Wash bottle (with frog-safe water)	Fisher Scientific	FB0340923T	Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS
X. laevis adult female	Xenopus1	N/A
Zip-top plastic bag	N/A	N/A	This bag should be large enough to hold the styrofoam island