Методы нанесения татуировки Xenopus laevis с помощью ротационной тату-машинки

Резюме

Здесь мы опишем методы нанесения татуировки взрослой особи Xenopus laevis (африканская когтистая лягушка) с помощью ротационной тату-машинки. Правильная татуировка приводит к темным, легко читаемым цифрам, которые сохраняются в течение нескольких месяцев и делают животных легко различимыми для исследований и ведения учета.

Аннотация

Животные модели расширяют сферу биомедицинских исследований, углубляя наше понимание биологии развития, молекулярной и клеточной биологии и позволяя исследователям моделировать болезни человека. Регистрация и отслеживание отдельных животных позволяет исследователям сократить количество животных, необходимых для исследования, и усовершенствовать методы для улучшения благополучия животных. Существует несколько хорошо задокументированных методов маркировки и отслеживания млекопитающих, включая пробивание ушей и ушные бирки. Тем не менее, методы маркировки водных видов амфибий ограничены, а существующие ресурсы устарели, неэффективны или непомерно дороги. В этой рукописи мы описываем методы и лучшие практики маркировки Xenopus laevis с помощью ротационной тату-машинки. Правильная татуировка приводит к получению высококачественных татуировок, что делает людей легко различимыми для исследователей и представляет минимальный риск для здоровья животных. Мы также выделяем причины некачественных татуировок, результатом которых могут стать татуировки, которые быстро выцветают и причиняют ненужный вред животным. Такой подход позволяет исследователям и ветеринарам маркировать амфибий, что позволяет им отслеживать биологические репликации и трансгенные линии, а также вести точные записи о здоровье животных.

Введение

Животные модели являются полезными инструментами для исследования вопросов, относящихся к здоровью человека. На практике биомедицинские исследования на животных моделях требуют тщательной организации и содержания здоровой колонии животных. Передовые методы этичного обращения с животными и их содержания направлены на сокращение количества животных, необходимых для экспериментов, и совершенствование методов обеспечения благополучия животных¹. Род когтистых лягушек, включая Xenopus laevis (X. laevis; Африканская когтистая лягушка) и Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Западная когтистая лягушка) использовались в биомедицинских исследованиях с 1930-х годов, когда X. laevis были использованы южноафриканскими врачами для проведения первых тестов на беременность^. В то время как современные тесты на беременность больше не требуют содержания лягушек, роль исследований Xenopus сохраняется. К преимуществам использования Xenopus в биомедицинских исследованиях относятся их хорошо аннотированные геномы³, круглогодичная индуцируемая овуляция больших кладок яйцеклеток⁴ и отложенные извне яйцеклетки, поддающиеся экстракорпоральному оплодотворению. Эти особенности делают их полезным активом для эмбриологии и развития позвоночных ^5,6,7, основ молекулярной и клеточной биологии ^7,8,9,10 и для моделирования болезней человека ^7,11,12,13.

Надежные методы отслеживания отдельных животных Xenopus имеют важное значение для регистрации биологических репликаций и повышения точности и воспроизводимости в исследованиях. Поскольку Xenopus часто размещаются в группах, маркировка животных позволяет исследователям легко отслеживать отдельных животных⁴. Ведение точного учета животных может сэкономить время и ресурсы, а также улучшить возможность отслеживания здоровья животных. Например, индивидуальная идентификация животных может улучшить организационные рабочие процессы для создания трансгенных линий Xenopus , поскольку для этого требуется несколько поколений лягушек с определенными генотипами, верифицированными с помощью секвенирования¹⁴, что требует организации и индивидуальной идентификации животных. Это особенно верно, когда в этих мутациях отсутствуют легко различимые фенотипы взрослых. Аналогичным образом, использование ооцитов и эмбрионов Xenopus для изучения основ клеточной биологии и биологии развития выигрывает от отслеживания отдельных животных. После стимуляции овуляции животным необходимо отдохнуть не менее 3 месяцев, чтобы предотвратить осложнения со здоровьем, такие как синдром гиперовуляции^. Индивидуальные методы идентификации гарантируют, что у животных не будет слишком частой овуляции.

Маркировка и отслеживание животных также позволяет персоналу лаборатории отслеживать проблемы со здоровьем животных. Заболевание животных с одним и тем же генотипом может указывать на чрезмерный инбридинг или непредвиденные проблемы со здоровьем, связанные с трансгеном. Точно так же заболевшие животные после недавней овуляции могут указывать на проблемы с реагентами, материалами или методами. Отслеживание животных и их здоровья позволяет персоналу лабораторий и ветеринарам следить за возникающими проблемами и принимать профилактические меры для предотвращения заболеваний в будущем. У млекопитающих существует множество методов идентификации. Постоянные методы для мышей включают пробивание ушей, ушные бирки, татуировки и подкожные микрочипы. Они могут четко и надежно дифференцировать животных в колонии или клетке и могут быть легко введены лабораторным персоналом. Такие методы, как прокалывание ушей, являются минимально инвазивными, требуют только одного специализированного оборудования и подходят для животных большинства возрастов. В то время как эти системы просты и полезны для мышей, их использование на лягушках представляет собой уникальный набор проблем. У лягушек и других земноводных отсутствует ушная раковина (структура наружного уха). Некоторые исследователи прикрепляют метки к челюсти, пальцу ноги или задней конечности животного^17,18. Такой подход приводил к различным проблемам: челюстные бирки вызывали раздражение, а взволнованные лягушки пытались сорвать метки передними конечностями. Бирки на пальцах ног протыкали перепонку между пальцами, затрудняя движения и неся риск потеряться. Таким образом, амфибиям требуются свои собственные методы идентификации. Исторически сложилось так, что стрижка пальцев ног также использовалась для маркировки амфибий^17,19. Палец ноги подстригают острыми ножницами, и животное можно определить по длине пальцев на передних и задних лапах или по углу, под которым палец отрос (у саламандр). Тем не менее, этот метод создает этическую проблему, поскольку обрезание пальцев ног может нарушить движения животного¹⁷. Кроме того, это может вызвать кровотечение и внести риск инфицирования. Еще одной устоявшейся системой маркировки являются аутотрансплантаты кожи, при которых кожа берется из одной части лягушки и хирургическим путем прикрепляется к другой части. Например, описан способ маркировки спины или плеча лягушки с помощью кожного трансплантата светлого цвета из ее грудной клетки²⁰. Пересадка кожи также имеет ограничения и риски: процедура является инвазивной и представляет риск заражения Aeromonas hydrophila или красной ноги, потенциально смертельного недуга; полное заживление аутотрансплантата занимает до 6 недель; И с помощью описанных методов только 6 лягушек могут быть размещены вместе из-за ограниченного количества мест для установки аутотрансплантата²⁰.

Менее инвазивные подходы к маркировке включают стеклянные шарики и чипы транспондера^17,19. При использовании метода стеклянных бусин стеклянные бусины нанизываются на небольшой шов и вшиваются в кожу лягушки. Это обеспечивает большую вариабельность, чем кожные аутотрансплантаты, с не менее чем 60 отличительными цветовыми комбинациями. Однако существует риск того, что шов может выйти, что приведет к потере бусин. В качестве альтернативы, транспондер с микрочипом может быть имплантирован под кожу в дорсальный лимфатический мешок лягушки. Это считается наиболее постоянным методом маркировки и позволяет идентифицировать и каталогизировать потенциально бесконечное количество животных. Тем не менее, это также самый дорогой метод, так как отдельные микрочипы стоят дорого, а маркировка большой колонии будет дорогостоящей. Микрочипы также требуют специального сканера для считывания¹⁹. Одним из распространенных подходов к идентификации Xenopus является обращение к естественной окраске и рисунку животных. Это особенно хорошо работает для таких лягушек, как X. laevis, у которых есть отчетливые узоры, сохраняющиеся на протяжении всей взрослой жизни. Однако эти узоры могут меняться со временем под воздействием стресса, а окраска может выглядеть иначе, когда лягушек перемещают между прозрачными и тонированными^{контейнерами}. Кроме того, этот метод идентификации менее полезен для X. tropicalis, который имеет менее отчетливые маркировочные узоры по сравнению с X. laevis, или для животных-альбиносов, которые не имеют^{цветовых} отметин. Даже для видов с четкими отметинами персонал лаборатории может по-разному интерпретировать расположение и размер отметин, что может привести к ошибкам при идентификации. Благодаря этому фотографирование животных наиболее достоверно в сочетании с дополнительным методом идентификации. Поэтому мы стремимся маркировать и идентифицировать животных Xenopus с помощью метода, который является легко различимым, постоянным и минимально инвазивным.

Существует ограниченное количество опубликованных ресурсов, описывающих методы нанесения татуировок амфибиям. Татуировка была описана наряду с другими техниками клеймения, включая тепловые клейма, бренды нитрата серебра и бренды заморозки¹⁷. В том же ресурсе татуировка делалась путем рисования цифр иглой для подкожных инъекций 27G, и было отмечено, что процесс не вызывает инфицирования, в отличие от других техник клеймения, в которых использовалась проволока в форме цифры или другого знака. В другом источнике для маркировки лягушек использовалась электрическая татуировочная машинка (описанная как вибрирующая игла), но мало подробностей о технике^17,19. Авторы предупреждают, что, нарушая защитный слой слизи лягушки, эта процедура увеличивает риск появления красной ноги. Несмотря на то, что не существует метода маркировки или идентификации, который был бы одновременно полностью неинвазивным (например, фотографии) и постоянным (например, микрочипы), татуировка обеспечивает эффективный компромисс. Татуировка относительно проста по сравнению с другими техниками, такими как аутотрансплантаты кожи. К дополнительным преимуществам относятся меньшая кривая обучения и относительно недорогое оборудование. Нанесение татуировок водным амфибиям сопряжено с определенными проблемами, которые могут напугать исследователей и помешать успешному мечению животных. Цель этой статьи — предоставить исследователям хорошо задокументированные методы нанесения татуировки взрослым Xenopus с помощью ротационной тату-машинки.

протокол

Все описанные процедуры для животных были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Дартмутского колледжа.

1. Настройка оборудования

ПРИМЕЧАНИЕ: В комплект входят рабочий процесс для процедуры и пример настройки стенда (Рисунок 1).

1. Подключите тату-пистолет и ножную педаль к источнику питания. Расположите ножную педаль под рабочей поверхностью.
2. Сборка тату-пистолета
   1. С помощью шестигранного ключа или шестигранной отвертки ослабьте винты в рукоятке (рисунок 2A, обведен красным цветом).
   2. Вставьте пластиковый наконечник до упора в рукоятку. Затяните винт, чтобы удержать его на месте.
   3. Вставьте металлическую трубку в заднюю часть рукоятки (рисунок 2A). Это будет регулироваться, поэтому вставьте его на половину его длины. Затяните винт, чтобы зафиксировать его на месте.
   4. Вставьте иглу для татуировки через заднюю часть рукоятки так, чтобы она удобно сидела в пластиковом наконечнике в передней части рукоятки (рисунок 2B).
   5. Проденьте заднюю часть иглы и металлическую трубку через зажим трубки. Отрегулируйте металлическую трубку так, чтобы игла удобно помещалась в пластиковый наконечник (рисунок 2B). Затяните зажим трубки вручную до упора до тех пор, пока трубка не сможет двигаться (рисунок 2C).
   6. Снимите черное уплотнительное кольцо и зацепите иглу за рычаг ротора; Установите на место уплотнительное кольцо, чтобы зафиксировать иглу на месте (Рисунок 2C).
3. Установите напряжение на блоке питания так, чтобы мощности хватало для прокалывания кожи, но не настолько мощное, чтобы его было сложно контролировать. После того как источник питания будет включен в розетку и подключен, нажмите ножную педаль, чтобы убедиться, что машина работает. Будьте осторожны, чтобы не направлять иглу на себя или других сотрудников.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тату-машинка, используемая в этом протоколе, лучше всего работает в диапазоне от 6,0 до 9,0 В, но она может варьироваться в зависимости от тату-машинки и источников напряжения и должна быть определена опытным путем.
4. Заполните колпачок микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл или прилагаемой пластиковой чернильницы черными чернилами для татуировок примерно на три четверти.

2. Анестезия

1. Приготовьте анестезию в резервуаре, достаточно большом, чтобы погрузить в воду одну взрослую самку лягушки X. laevis .
   1. Используя безопасную для лягушек (не содержащую хлора) воду, добавьте трикаин до конечной концентрации 1,5 г/л и бикарбонат натрия до конечной концентрации 3,5 г/л. Перемешайте до растворения. pH этого раствора составляет 7,15.
      ВНИМАНИЕ: Трикаин является раздражителем.
2. Погрузите одну лягушку в резервуар для анестезии. Следите за тем, чтобы лягушка оставалась погруженной в раствор трикаина до тех пор, пока она не будет обезболена (7-8 минут).
   1. Чтобы проверить, полностью ли находится под наркозом лягушка, возьмите ее в руки, держите вниз головой и крепко сожмите одной ногой. Если лягушка не вздрагивает или не реагирует, на нее можно нанести татуировку.
   2. Если лягушкам постоянно требуется более 10 минут для обезболивания, приготовьте свежий раствор трикаина, буферизованный бикарбонатом натрия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лягушки не должны проводить более 30 минут в растворе трикаина¹⁵.

3. Татуировка

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед нанесением татуировки живому животному может быть полезно потренироваться на кусочке фрукта с твердой кожурой (например, лимона или банана).

1. Подготовьте восстановительный резервуар для лягушек перед нанесением татуировки. Наполните бак 10-15 л свежей воды, безопасной для лягушек, и добавьте остров из пенополистирола. Это обеспечит поверхность для того, чтобы лягушка проснулась, не утонув.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Остров из пенополистирола может быть изготовлен с использованием крышки контейнера для холодной транспортировки из пенополистирола, помещенного в пакет с застежкой-молнией.
2. Положите находящуюся под наркозом лягушку на спину на сухое бумажное полотенце или скамейку бумаги (рисунок 3А). Используйте неотбеленные (коричневые) бумажные полотенца для всех работ, связанных с лягушками.
3. С помощью сухой безворсовой салфетки сотрите воду и слизь с груди лягушки.
4. Найдите пальцами грудину в центре груди лягушки и, используя недоминантную руку, натяните кожу.
5. Маркировка лягушки
   1. Держите собранный тату-пистолет вертикально относительно рабочей поверхности и окуните иглу в чернила (рисунок 3В).
   2. Держа собранный тату-пистолет в вертикальном положении, перед тем как нажать на ножную педаль, прижмите кончик иглы к коже лягушки. Нарисуйте линии на коже лягушки, равномерно надавливая.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Незначительное кровотечение или покраснение являются нормальным явлением, как и незначительное шелушение кожи.
   3. Если игла застряла на коже лягушки, удалите излишки чернил или кожи с иглы салфеткой. Избыток чернил является нормальным явлением во время нанесения татуировки.
   4. Если грудная клетка лягушки покрыта слишком большим количеством чернил, чтобы четко разглядеть отмеченную область (Рисунок 3C), удалите излишки чернил безопасной для лягушки водой и салфеткой (Рисунок 3C'). Затем смойте влагу сухой салфеткой и продолжайте рисовать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед нанесением татуировки можно приготовить бутылку с водой, безопасной для лягушек.
   5. Продолжайте рисовать чернилами на той же области, пока не останутся темные, разборчивые цифры после стирания излишков чернил (Рисунок 3D). Вместо того, чтобы рисовать всю маркировку или цифру одним штрихом, многократно делайте более мелкие штрихи, особенно для кривых.

4. Восстановление

1. Смочите бумажное полотенце водой, безопасной для лягушек, и положите его на вершину острова из пенополистирола (рисунок 4A).
2. Возвращение лягушек в стоящие танки
   1. Положите лягушку животом вниз на полотенце лицом к воде (рисунок 4В). Накиньте половину бумажного полотенца на заднюю половину лягушки и, сложив чашечки, намочите верхнюю часть лягушки. Как только лягушка выйдет из наркоза (примерно через 1 час после нанесения татуировки), она будет самостоятельно входить в воду и нормально плавать.
   2. Возвращают лягушек в долгосрочное жилье через 24 ч, как только татуировка полностью заживет.

5. Чистка и обслуживание оборудования

1. Повторное использование и автоклавирование игл для татуажа
   1. Промойте иглы в 100% изопропаноле и деионизированной воде, чтобы разрыхлить чернила, и сотрите остатки чернил, которые не растворились.
   2. После чистки поместите иглы в металлический футляр для автоклава или оберните их алюминиевой фольгой и автоклавируйте на 30 минут в сухом цикле.
2. Если на кусочках тату-машинки или другого оборудования есть чернила, протрите их 100% этанолом и бумажным полотенцем.
3. Раствор анестетика имеет конечную концентрацию трикаина примерно 0,5%. Утилизируйте их в соответствии с руководящими принципами обращения с опасными отходами учреждения.
4. Хранение и обслуживание оборудования
   1. По возможности храните тату-машинку в сухом помещении. Избыток влаги повредит электрические компоненты и уменьшит срок службы машины.
   2. Чтобы сохранить тату-машинку в хорошем рабочем состоянии, проверьте подшипник на роторе (рисунок 2C), чтобы убедиться, что он не ослаб от вибраций²². Его можно затянуть с помощью шестигранного ключа или шестигранной отвертки.
   3. Примерно раз в месяц смазывайте подшипник на рычаге ротора густой консистентной смазкой²².
   4. На некоторых тату-машинках рычаг ротора может застрять и не будет вибрировать. Чтобы исправить это, поверните рычаг ротора или сожмите пружину так, чтобы игла оказалась в опущенном положении (рисунок 2C).

Результаты

Высококачественные татуировки будут иметь темные, разборчивые штрихи на груди лягушки и могут быть четко различимы с расстояния в несколько футов (Рисунок 5А). В целом, более крупные цифры и маркировки лучше для удобочитаемости, но более длинные имена и номера можно сдел...

Обсуждение

Татуировка людей — это форма искусства, насчитывающая тысячи лет, и до тех пор, как люди татуируют себя, они также татуируют или клеймят животных^. Оборудование и методы маркировки животных, особенно млекопитающих, хорошо зарекомендовали себя, хорошо задокументированы и ши?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1203RLB	Packaged sterile
5 Needle Round Disposable ULTRA	Worldwide Tattoo Supply	HTIPRS5-U	Packaged sterile
5 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1205RLB	Packaged sterile
7 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1207RLB	Packaged sterile
Clip Cord	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Foot pedal	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Inkpots	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Kimwipes, delicate task wipes	Fisher Scientific	06-666A
RCA Connection	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Scream Ink Pitch Black, 1oz	Worldwide Tattoo Supply	SI101
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Stainless steel grips	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set	Worldwide Tattoo Supply	STEALTH2-SET
Styrofoam island	N/A	N/A	This is the lid of a styrofoam cold shipping container
Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)	Sigma-Aldrich	E10521	CAUTION: IRRITANT
Unbleached paper towels	Grainger	2U229	Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians
Voltage Supply	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Wash bottle (with frog-safe water)	Fisher Scientific	FB0340923T	Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS
X. laevis adult female	Xenopus1	N/A
Zip-top plastic bag	N/A	N/A	This bag should be large enough to hold the styrofoam island