로타리 문신 기계로 Xenopus laevis 를 문신하는 방법

요약

여기에서는 회전식 문신 기계로 성인 Xenopus laevis (아프리카 발톱 개구리)에 문신을 새기는 방법을 설명합니다. 적절한 문신을 하면 몇 달 동안 지속되는 어둡고 쉽게 읽을 수 있는 숫자가 생성되며 연구 및 기록 보관 목적으로 동물을 쉽게 구별할 수 있습니다.

초록

동물 모델은 생물 의학 연구의 범위를 확장하여 발달, 분자 및 세포 생물학에 대한 이해를 높이고 연구원이 인간 질병을 모델링할 수 있도록 합니다. 개별 동물을 기록하고 추적함으로써 연구자들은 연구에 필요한 동물의 수를 줄이고 동물 복지를 개선하기 위한 관행을 개선할 수 있습니다. 포유류를 표시하고 추적하기 위한 몇 가지 잘 문서화된 방법이 존재하며, 여기에는 귀 펀칭 및 귀 태그가 포함됩니다. 그러나 수생 양서류 종을 표시하는 방법은 제한적이며, 기존 자원은 구식이거나 비효율적이거나 엄청나게 비용이 많이 듭니다. 이 원고에서는 회전식 문신 기계로 Xenopus laevis 를 표시하는 방법과 모범 사례를 간략하게 설명합니다. 적절한 문신은 고품질 문신을 만들어 연구자들이 개인을 쉽게 구별할 수 있도록 하고 동물의 건강에 대한 위험을 최소화합니다. 우리는 또한 문신이 빨리 퇴색하고 동물에게 불필요한 해를 끼칠 수 있는 품질이 좋지 않은 문신의 원인을 강조합니다. 이 접근 방식을 통해 연구자와 수의사는 양서류를 표시하여 생물학적 복제 및 유전자 변형 계통을 추적하고 동물의 건강 상태에 대한 정확한 기록을 유지할 수 있습니다.

서문

동물 모델은 인간의 건강과 관련된 질문을 조사하는 데 유용한 도구입니다. 실제로, 동물 모델을 사용한 생물 의학 연구는 건강한 동물 군집의 신중한 조직과 유지를 필요로 합니다. 윤리적 동물 취급 및 축산을 위한 모범 사례는 실험에 필요한 동물의 수를 줄이고 동물 복지를 보장하기 위한 관행을 개선하는 것을 목표로 합니다¹. Xenopus laevis(X. laevis; 아프리카 발톱 개구리)와 Xenopus tropicalis (X. tropicalis; Western clawed frog)는 1930년대 남아프리카 공화국 의사들이 X. laevis를 사용하여 최초의 임신 테스트를 실시한 이래로 생물의학 연구에 사용되어 왔다². 현대의 임신 테스트기는 더 이상 개구리를 필요로 하지 않지만, 제노푸스 연구의 역할은 여전히 유효하다. 생물 의학 연구에 Xenopus를 사용하는 장점으로는 주석이 잘 달린 게놈³, 큰 난자의 연중 유도 배란⁴, 체외 수정이 가능한 외부에서 낳은 난자 등이 있습니다. 이러한 특징은 척추 동물의 발생학 및 발달 (vertebrate embryology)^{과 발달 (er})^5,6,7, 기초 분자 및 세포 생물학 (basic molecular and cellular biology) ^7,8,9,10 및 인간 질병 모델링 (human disease) 7,11,12,13에 유용한 자산입니다.

개별 Xenopus 동물을 추적하기 위한 신뢰할 수 있는 방법은 생물학적 복제를 기록하고 연구의 엄격성과 재현성을 개선하는 데 필수적입니다. Xenopus 는 종종 그룹으로 수용되기 때문에 동물 표시를 통해 연구자는 개별 동물을 쉽게 추적 할 수 있습니다⁴. 동물에 대한 정확한 기록을 유지하면 시간과 자원을 절약하고 동물의 건강을 추적하는 능력을 향상시킬 수 있습니다. 예를 들어, 동물의 개별 식별은 형질전환 Xenopus 라인을 생성하기 위한 조직 워크플로우를 개선할 수 있는데, 이는 시퀀싱¹⁴에 의해 검증된 특정 유전자형을 가진 여러 세대의 개구리가 필요하기 때문에 동물의 조직 및 개별 식별이 필요하기 때문입니다. 이러한 돌연변이가 쉽게 식별할 수 있는 성인 표현형이 없는 경우 특히 그렇습니다. 마찬가지로, Xenopus 난모세포와 배아를 사용하여 기본 세포 및 발달 생물학을 연구하면 개별 동물을 추적할 수 있습니다. 배란을 유도한 후 동물은 과배란 증후군과 같은 건강 합병증을 예방하기 위해 최소 3개월 동안 휴식을 취해야 합니다¹⁵. 개체 식별 방법은 동물이 너무 자주 배란하도록 유도되지 않도록 합니다.

또한 동물을 표시하고 추적하면 실험실 직원이 동물의 건강 문제를 추적할 수 있습니다. 동일한 유전자형의 동물이 병에 걸렸다는 것은 과도한 근친 교배 또는 전이 유전자와 관련된 예상치 못한 건강 문제를 나타낼 수 있습니다. 마찬가지로, 최근 배란 후 병에 걸린 동물은 시약, 재료 또는 기술에 문제가 있음을 나타낼 수 있습니다. 동물과 동물의 건강을 추적하면 실험실 직원과 수의사가 우려 사항이 다시 떠오를 때 후속 조치를 취하고 향후 질병을 예방하기 위한 예방 조치를 취할 수 있습니다. 포유류에는 수많은 식별 방법이 있습니다. 마우스에 대한 영구적인 방법에는 귀 펀칭, 귀 태그, 문신 및 피하 마이크로칩이 포함됩니다¹⁶. 이들은 식민지 또는 케이지 내의 동물을 명확하고 신뢰할 수 있게 구별할 수 있으며 실험실 직원이 쉽게 투여할 수 있습니다. 귀 펀칭과 같은 방법은 최소 침습적이며 한 가지 특수 장비만 필요하며 대부분의 연령의 동물에게 효과가 있습니다. 이러한 시스템은 생쥐에게는 간단하고 유용하지만 개구리에서 사용하는 것은 고유한 일련의 문제를 제시합니다. 개구리와 다른 양서류는 귓바퀴(pinna, 외귀 구조)가 없습니다. 일부 연구자들은 동물의 턱, 발가락 또는 뒷다리에 태그를 부착했습니다^17,18. 이 접근법은 다양한 문제를 낳았다: 턱 꼬리표는 자극을 일으켰고, 흥분한 개구리는 앞다리로 꼬리표를 떼어내려고 시도했다¹⁷. 발가락 태그는 발가락 사이의 물갈퀴를 뚫어 움직임을 방해하고 길을 잃을 위험이 있습니다. 따라서 양서류는 식별을 위해 자체 방법이 필요합니다. 역사적으로, 발가락 깎기는 또한 양서류^17,19를 표시하는 데 사용되었습니다. 발가락은 날카로운 가위로 잘리며, 앞발과 뒷발의 발가락 길이 또는 발가락이 뒤로 자란 각도 (도롱뇽의 경우)로 동물을 식별 할 수 있습니다. 그러나, 이 방법은 발가락 깎기가 동물의 움직임을 손상시킬 수 있다는 윤리적 우려를 제기한다¹⁷. 또한 출혈을 일으키고 감염의 위험을 초래할 수 있습니다. 또 다른 확립된 마킹 시스템은 피부 자가이식술로, 개구리의 한 부분에서 피부를 채취하여 다른 부분에 외과적으로 부착합니다. 예를 들어, 개구리의 가슴 부분으로부터 밝은 색의 피부 이식편을 사용하여 개구리의 등이나 어깨를 표시하는 방법이 설명되어^있다(20). 피부 이식은 또한 한계와 위험을 수반합니다 : 절차는 침습적이며 잠재적으로 치명적인 질병 인 Aeromonas hydrophila 감염 또는 붉은 다리의 위험을 초래합니다. 자가이식편의 완전한 치유는 최대 6주가 소요됩니다. 그리고 설명된 방법을 사용하면 자가이식편을 넣을 장소가 제한되어 있기 때문에 6마리의 개구리만 함께 수용할 수 있습니다²⁰.

덜 침습적인 마킹 접근법은 유리 비드 및 트랜스폰더 칩(^17,19)을 포함한다. 유리구슬 공법에서는 유리구슬을 작은 봉합사에 끼워 개구리의 피부에 꿰매는 방식입니다. 이것은 피부 자가이식편보다 더 큰 다양성을 제공하며 최소 60개의 독특한 색상 조합을 제공합니다. 그러나 봉합사가 빠져 나와 구슬이 손실될 위험이 있습니다. 대안적으로, 마이크로칩 트랜스폰더를 개구리의 등쪽 림프낭의 피부 아래에 이식할 수 있습니다. 이것은 가장 영구적인 마킹 방법으로 간주되며 잠재적으로 무한한 수의 동물을 개별적으로 식별하고 분류할 수 있습니다. 그러나 이것은 개별 마이크로칩이 비싸고 큰 콜로니를 표시하는 데 비용이 많이 들기 때문에 가장 비용이 많이 드는 방법이기도 합니다. 마이크로칩은 또한¹⁹를 판독하기 위해 특수 스캐너를 필요로 한다. Xenopus 식별을 위한 일반적인 접근 방식 중 하나는 동물의 자연스러운 색상과 패턴을 참조하는 것입니다. 이것은 X. laevis와 같은 개구리에게 특히 효과적인데, 이들은 성체가 될 때까지 뚜렷한 패턴을 가지고 있습니다. 그러나 이러한 패턴은 스트레스에 따라 시간이 지남에 따라 변할 수 있으며, 개구리가 투명한 용기와 착색된 용기 사이를 이동할 때 색상이 다르게 나타날 수 있다¹⁵. 또한, 이 식별 방법은 X. laevis에 비해 뚜렷한 표시 패턴이 적은 X. tropicalis나 색상 표시가 없는 알비노 동물에 대해서는 덜 유용하다²¹. 뚜렷한 표시가 있는 종의 경우에도 실험실 직원이 표시의 배치와 크기를 다르게 해석할 수 있으며, 이로 인해 식별에 오류가 발생할 수 있습니다. 이 때문에 동물을 촬영하는 것은 추가 식별 방법과 함께 가장 신뢰할 수 있습니다. 따라서 우리는 쉽게 식별할 수 있고 영구적이며 최소한으로 침습적인 기술을 사용하여 Xenopus 동물을 표시하고 식별하려고 합니다.

양서류에 문신을 새기는 방법을 설명하는 출판 된 자료는 제한되어 있습니다. 문신은 히트 브랜드, 질산은 브랜드 및 동결 브랜드를 포함한 다른 브랜딩 기술과 함께 설명되었습니다¹⁷. 같은 자료에서 타투는 27G 피하 주사 바늘로 숫자를 그리는 방식으로 이루어졌으며, 숫자 또는 다른 표시로 된 철사를 사용하는 다른 브랜딩 기술과 달리 감염을 일으키지 않는 과정에 주목했습니다. 또 다른 출처에서는 전기 문신 기계 (진동 바늘로 묘사 됨)가 개구리를 표시하는 데 사용되었지만 기술에 대한 세부 사항은 거의 제공되지 않았습니다^17,19. 저자들은 이 시술이 개구리의 보호막인 점액층을 방해함으로써 붉은다리의 위험을 증가시킨다고 경고한다. 완전히 비침습적(예: 사진)이고 영구적(예: 마이크로칩)인 표시 또는 식별 방법은 없지만 문신은 효과적인 절충안을 제공합니다. 문신은 피부 자가 이식과 같은 다른 기술에 비해 비교적 간단합니다. 추가 이점으로는 학습 곡선이 작고 상대적으로 저렴한 장비가 있습니다. 수생 양서류에 문신을 새기는 것은 연구자를 위협하고 성공적인 동물 표시를 손상시킬 수 있는 특정 도전 과제가 있습니다. 이 논문은 연구자들에게 회전식 문신 기계로 성인 Xenopus에게 문신을 새기는 잘 문서화 된 방법을 제공하는 것을 목표로합니다.

프로토콜

설명된 모든 동물 시술은 다트머스 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 장비 설정

참고: 절차에 대한 작업 흐름과 벤치 설정 예가 포함되어 있습니다(그림 1).

1. 타투 건과 풋 페달을 전원 공급 장치에 연결합니다. 발 페달을 작업 표면 아래에 놓습니다.
2. 문신 총 조립
   1. 육각 렌치 또는 육각 드라이버를 사용하여 그립의 나사를 풉니다(빨간색 원으로 표시된 그림 2A).
   2. 플라스틱 팁을 그립에 완전히 삽입합니다. 나사를 조여 제자리에 고정합니다.
   3. 그립 뒤쪽에 금속 튜브를 삽입합니다(그림 2A). 이것은 조정되므로 길이의 절반으로 삽입하십시오. 나사를 조여 제자리에 고정합니다.
   4. 그립 뒤쪽을 통해 문신 바늘을 삽입하여 그립 앞쪽의 플라스틱 팁에 편안하게 앉도록 합니다(그림 2B).
   5. 튜브 cl을 통해 바늘과 금속 튜브의 뒷면을 밀어 넣습니다.amp. 바늘이 플라스틱 팁에 편안하게 맞도록 금속 튜브를 조정합니다(그림 2B). 튜브가 움직일 수 없을 때까지 튜브 cl을 손으로 조입니다.amp (그림 2C).
   6. 검은색 O-링을 제거하고 바늘을 로터 암에 겁니다. O-링을 교체하여 바늘을 제자리에 고정합니다(그림 2C).
3. 피부를 뚫을 수 있을 만큼 충분한 전력이 있지만 제어하기 어려울 정도로 강력하지 않도록 전원 공급 장치의 전압을 설정합니다. 전원 공급 장치가 연결되고 연결되면 풋 페달을 밟아 기계가 작동하는지 확인하십시오. 바늘이 자신이나 다른 사람에게 향하지 않도록 주의하십시오.
   알림: 이 프로토콜에 사용된 타투 기계는 6.0V에서 9.0V 사이에서 가장 잘 작동하지만 이는 타투 기계와 전압 공급 간에 다를 수 있으며 경험적으로 결정해야 합니다.
4. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브 또는 제공된 플라스틱 잉크통의 캡에 검은색 타투 잉크를 약 4분의 3까지 채웁니다.

2. 마취

1. 성인 암컷 X. laevis 개구리 한 마리를 잠글 수 있을 만큼 큰 탱크에서 마취를 준비합니다.
   1. 개구리에게 안전한(염소가 없는) 물을 사용하여 트리케인을 최종 농도 1.5g/L에 첨가하고 중탄산나트륨을 최종 농도 3.5g/L에 첨가합니다. 이 용액의 pH는 7.15입니다.
      주의: 트리케인은 자극제입니다.
2. 개구리 한 마리를 마취조에 담그십시오. 개구리가 마취될 때까지 트리케인 용액에 잠겨 있는지 확인하십시오(7-8분).
   1. 개구리가 완전히 마취되었는지 확인하려면 개구리를 집어 들고 거꾸로 잡고 한쪽 발을 단단히 쥐십시오. 개구리가 움찔하거나 반응하지 않으면 문신을 할 수 있습니다.
   2. 개구리가 마취되는 데 지속적으로 10분 이상 걸리면 중탄산나트륨으로 완충된 새로운 트리케인 용액을 준비합니다.
      알림: 개구리는 트리케인 용액¹⁵에서 30분 이상을 보내서는 안 됩니다.

3. 문신

알림: 살아있는 동물에 문신을 하기 전에 껍질이 단단한 과일 조각(예: 레몬 또는 바나나)에 연습하는 것이 유용할 수 있습니다.

1. 문신을 하기 전에 개구리를 위한 회수 탱크를 준비하십시오. 탱크에 개구리에게 안전한 신선한 물 10-15L를 채우고 스티로폼 아일랜드를 추가합니다. 이것은 개구리가 익사하지 않고 깨어날 수 있는 표면을 제공할 것입니다.
   알림: 스티로폼 아일랜드는 지퍼백 안에 넣은 스티로폼 냉장 배송 컨테이너의 뚜껑을 사용하여 만들 수 있습니다.
2. 마취된 개구리를 마른 종이 타월이나 벤치 종이에 등을 대고 놓습니다(그림 3A). 개구리와 관련된 모든 작업에는 표백되지 않은(갈색) 종이 타월을 사용하십시오.
3. 보푸라기가 없는 마른 물티슈를 사용하여 개구리의 가슴에서 물과 점액을 닦아냅니다.
4. 손가락으로 개구리의 가슴 중앙에 있는 흉골을 찾아 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 피부를 팽팽하게 잡습니다.
5. 개구리 표시
   1. 조립된 타투 건을 작업 표면에 대해 수직으로 잡고 바늘을 잉크에 담궈냅니다(그림 3B).
   2. 조립된 타투 건을 수직으로 유지한 상태에서 발 페달을 밟기 전에 바늘 끝을 개구리의 피부에 누릅니다. 개구리의 피부에 선을 그리면서 균일한 압력을 가합니다.
      알림: 약간의 경미한 출혈이나 발적은 정상이며 경미한 피부 벗겨짐도 마찬가지입니다.
   3. 바늘이 개구리의 피부에 걸리면 바늘에서 과도한 잉크나 피부를 닦아내십시오. 문신을 하는 동안 과도한 잉크는 정상입니다.
   4. 개구리의 가슴이 너무 많은 잉크로 덮여 있어 표시된 부분을 명확하게 볼 수 없는 경우(그림 3C) 개구리에게 안전한 물과 물티슈로 여분의 잉크를 제거합니다(그림 3C'). 그런 다음 마른 물티슈로 수분을 흡수하고 잉크를 계속 칠합니다.
      알림: 문신을 하기 전에 개구리에게 안전한 물 한 병을 짜서 준비할 수 있습니다.
   5. 여분의 잉크를 닦아낸 후 어둡고 읽을 수 있는 숫자가 남을 때까지 동일한 영역에 계속 잉크를 칠합니다(그림 3D). 한 획으로 전체 표시나 숫자를 그리는 대신 특히 곡선의 경우 더 작은 획을 반복적으로 만듭니다.

4. 회복

1. 종이 타월에 개구리에게 안전한 물을 적셔 스티로폼 아일랜드 위에 평평하게 놓습니다(그림 4A).
2. 개구리를 서 있는 수조로 돌려보내기
   1. 물을 향한 수건 위에 개구리 배를 아래로 눕힙니다(그림 4B). 종이 타월의 절반을 개구리의 뒤쪽 절반 위에 접고 컵을 쥔 손을 사용하여 개구리의 윗부분을 적십니다. 개구리가 마취에서 나오면(문신 후 약 1시간 후) 독립적으로 물에 들어가 정상적으로 수영합니다.
   2. 문신이 완전히 치유되면 24 시간 후에 개구리를 장기 주택으로 반환하십시오.

5. 청소 및 장비 유지 보수

1. 문신 바늘 재사용 및 고압 멸균
   1. 100% 이소프로판올과 탈이온수로 바늘을 헹구어 잉크를 느슨하게 하고 녹지 않은 나머지 잉크를 문지릅니다.
   2. 문지른 후 바늘을 금속 오토클레이브 케이스에 넣거나 알루미늄 호일과 오토클레이브로 싸서 건조 사이클에서 30분 동안 합니다.
2. 문신 기계나 기타 장비의 조각에 잉크가 묻어 있으면 100% 에탄올과 종이 타월로 닦으십시오.
3. 마취액의 최종 트리카인 농도는 약 0.5%입니다. 기관 유해 폐기물 관리 지침에 따라 폐기하십시오.
4. 장비 보관 및 유지 보수
   1. 가능하면 타투 기계를 건조한 방에 보관하십시오. 과도한 수분은 전기 부품을 손상시키고 기계의 수명을 단축시킵니다.
   2. 문신 기계가 양호한 작동 상태를 유지하려면 로터의 베어링(그림 2C)을 점검하여 진동²²로 인해 느슨해지지 않았는지 확인하십시오. 이것은 육각 렌치 또는 육각 드라이버로 조일 수 있습니다.
   3. 한 달에 한 번 정도 두꺼운 윤활 그리스²²를 사용하여 로터 암의 베어링을 윤활합니다.
   4. 일부 문신 기계에서는 로터 암이 끼어 진동하지 않을 수 있습니다. 이 문제를 해결하려면 로터 암을 비틀거나 스프링을 압박하여 바늘이 내린 위치에 오도록 합니다(그림 2C).

결과

고품질 문신은 개구리의 가슴에 어둡고 읽을 수 있는 획이 있으며 몇 피트 떨어진 곳에서도 명확하게 구별할 수 있습니다(그림 5A). 일반적으로 숫자와 표시가 클수록 가독성이 좋지만 긴 이름과 숫자는 개구리의 가슴에 편안하게 맞도록 작게 만들 수 있습니다. 문신 수명은 판단하기가 더 어렵지만 고품질 개구리 문신은 최소 3-6개월 동안 어둡고 읽을 수 있어야 합니다(

토론

인간에게 문신을 새기는 것은 수천 년 전으로 거슬러 올라가는 예술 형식이며, 인간이 문신을 하는 동안 동물에게도 문신을 하거나 낙인을 찍었습니다²³. 동물, 특히 포유류를 표시하는 장비와 기술은 잘 확립되어 있고 잘 문서화되어 있으며 널리 접근할 수 있습니다. 동물에 표시를 하는 것은 원래 가축과 절도 방지를 구별하기 위한 것이었지만²³ 생물의학 연?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
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5 Needle Round Disposable ULTRA	Worldwide Tattoo Supply	HTIPRS5-U	Packaged sterile
5 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1205RLB	Packaged sterile
7 needle round liners	Worldwide Tattoo Supply	1207RLB	Packaged sterile
Clip Cord	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Foot pedal	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Inkpots	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Kimwipes, delicate task wipes	Fisher Scientific	06-666A
RCA Connection	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Scream Ink Pitch Black, 1oz	Worldwide Tattoo Supply	SI101
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761
Stainless steel grips	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Stealth 2.0 Rotary Tattoo Machine Box Set	Worldwide Tattoo Supply	STEALTH2-SET
Styrofoam island	N/A	N/A	This is the lid of a styrofoam cold shipping container
Tricaine (ethyl 3-aminobenzonate methanesulfate)	Sigma-Aldrich	E10521	CAUTION: IRRITANT
Unbleached paper towels	Grainger	2U229	Paper towels MUST be unbleached, bleach is toxic to amphibians
Voltage Supply	Worldwide Tattoo Supply	N/A
Wash bottle (with frog-safe water)	Fisher Scientific	FB0340923T	Frog safe water is dechlorinated, pH 7.0-8.5, conductivity 1200-1800 uS
X. laevis adult female	Xenopus1	N/A
Zip-top plastic bag	N/A	N/A	This bag should be large enough to hold the styrofoam island