Para empezar, las células de HEK293A de semillas en cubreobjetos de brillo se colocan en una placa de 24 pocillos que contiene DMEM con alto contenido de glucosa hasta que se vuelven 80% confluentes. Al día siguiente, las células murieron de hambre durante dos horas en la solución salina equilibrada de Earl. Después del tratamiento, aspire el medio y agregue 500 microlitros o una solución de formaldehído al 4% en PBS e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente para fijar las células.
Después de la fijación, reemplace la solución de formaldehído con 500 microlitros de PBS. A continuación, apague el grupo aldehído libre agregando 500 microlitros de solución de cloruro de amonio de 50 milimolares en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Reemplace la solución de cloruro de amonio con 500 microlitros de una solución de digitonina de 50 microgramos por mililitro en PBS durante cinco minutos para permeabilizar las células.
Después de la permeabilización, reemplace la solución de digitonina con 500 microlitros de PBS repitiendo el lavado de PBS tres veces. Después del último lavado, incubar las células en 500 microlitros de solución bloqueante durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, reemplace la solución de bloqueo con 500 microlitros de PBS.
A continuación, con unas pinzas, recoja los cubreobjetos del pocillo y retire el exceso de PBS con toallitas de papel fino. En la cámara humidificada, coloque suavemente el cubreobjetos con el lado de la célula hacia abajo sobre una gota de 50 microlitros de solución primaria de anticuerpos. Incubar las células en una cámara humidificada durante una hora a temperatura ambiente.
Después de la incubación, recoja los cubreobjetos y drene el exceso de solución de anticuerpos primarios. Vuelva a colocar los cubreobjetos en la placa de 24 pocillos con el lado de la celda hacia arriba y lávelos tres veces con PBS. Después del último lavado, recoja los cubreobjetos y escurra el exceso de PBS antes de colocar cada cubreobjetos con la célula hacia abajo sobre una gota de 50 microlitros de solución de anticuerpos secundarios.
Incubar en una cámara humidificada durante una hora. Después de la incubación, drene el exceso de solución de anticuerpos secundarios y lave el cubreobjetos tres veces con 500 microlitros de PBS en la placa de 24 pocillos. Después de drenar el exceso de PBS, coloque cada cubreobjetos con el lado de la celda hacia abajo sobre una gota de 50 microlitros de solución de ganchos diluida de uno a 4,000 en PBS en una cámara humidificada.
Incubar en una cámara humidificada durante cinco minutos. A continuación, retire el exceso de solución de ganchos y lave los cubreobjetos tres veces con PBS y una vez con agua desionizada en una placa de 24 pocillos. Después de drenar el exceso de agua desionizada, coloque cada cubreobjetos en una gota de 10 a 20 microlitros de solución de montaje colocada en un portaobjetos de microscopio evitando la formación de burbujas de aire.
