Para obtener imágenes de células vivas de construcciones ATG9A, se siembran células HEK293A en dos mililitros de DMEM con alto contenido de glucosa en una placa de cultivo de tejidos de 60 milímetros hasta que alcancen una confluencia del 65 al 70%. Al día siguiente, prepare y agregue la mezcla de ADN de lipofectamina a la placa de cultivo celular que contiene cuatro mililitros de medio de crecimiento y mueva suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás para distribuir la mezcla de manera uniforme. Incubar las células a 37 grados centígrados y 10% de dióxido de carbono.
Después de cuatro horas de transfección, reemplace el medio de cultivo con un medio fresco e incube las células durante la noche a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 10%. Al día siguiente, tripsinice las células añadiendo tripsina EDTA. A continuación, cuente las células desprendidas y vuelva a sembrarlas en una placa de cultivo adecuada para microscopía en vivo durante la noche.
Al día siguiente, tome imágenes de las células con un microscopio confocal. En condiciones basales, ATG9A se localiza principalmente en la red de Golgi, como lo indica la inmunofluorescencia de la proteína endógena y se superpone con GM130, un marcador cis-Golgi. El ATG9A marcado con eGFP N-terminal y el ATG9A marcado con mRFP N-terminal estaban menos localizados en el Golgi y residían principalmente en vesículas.
Por el contrario, la ATG9A marcada terminalmente con eGFPc es más propensa a agregarse dentro de la célula. La fusión de una secuencia 3x-FLAG entre un fluoróforo N-terminal y ATG9A ayudó a que la proteína sobreexpresada se comportara de manera similar a la endógena. El mCherry 3x-FLAG ATG9A sobreexpresado se colocaliza con el marcador de Golgi GM130 en condiciones de alimentación.
Esta localización y el compartimento vesicular de AG9A se conservaron a lo largo del tiempo, lo que permitió el estudio espacio-temporal del tráfico de ATG9A.
