En el caso de la infección lentiviral, coloque una placa en las células diana tripsinizadas de MPNST después de contarlas, manteniendo 2,5 millones de células por placa de 15 centímetros. Transducir las células con el virus descongelado a una multiplicidad de 0,5 de infección, en presencia de cinco microgramos por mililitro del polímero catiónico. Tripsinizar las células tres días después de la adición de puromicina.
Centrifugar la mitad de la población celular a 200 G durante cinco minutos en una centrífuga de mesa. Después de volver a sembrar la otra mitad de la población celular, cultivarlas durante aproximadamente siete duplicaciones de población antes de cosecharlas y centrifugarlas como se demostró anteriormente. Divida el gránulo de celda resuspendida correspondiente al tiempo deseado en dos tubos de polimetilpenteno de 15 mililitros.
Agregue 500 microlitros de SDS al 10% por tubo. Mezclar e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Coloque los tubos en un dispositivo de cizallamiento de ADN para sonicar el ADN.
Tras la adición de fenol y cloroformo. Mezcle bien mediante vórtice vigorosamente a la máxima velocidad posible durante 45 a 60 segundos. Transfiera tres mililitros de la fase superior transparente resultante de cada tubo a otro tubo nuevo de 15 mililitros.
Agregue 0,5 mililitros de acetato de sodio de tres molares y cuatro mililitros de isopropanol y mezcle bien. Después de centrifugar los tubos durante 30 minutos a 7, 200 G y 20 grados centígrados y desechar el sobrenadante, agregue 0,5 mililitros de etanol al 70% al gránulo y desaloje pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Combine los gránulos resuspendidos de ambos tubos en un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.
Realice las reacciones de PCR utilizando las condiciones que se muestran en la pantalla. Después de la segunda reacción de PCR, combine las cuatro muestras en un tubo de microcentrífuga. Y agrégale 80 microlitros de tinte de carga 6X.
Visualice el gel y confirme una banda en aproximadamente 250 pares de bases. Las células MPNST humanas transducidas con un control no objetivo y lentivirus, que expresan cuatro ARN diferentes de horquilla corta Bcl-6, revelaron que varios de los ARN de horquilla corta Bcl-6 redujeron notablemente el número de células. El inmunoblot mostró que el grado de disminución en el número de células se correlacionaba con el grado de eliminación de Bcl-6.
