מימון חלקי של הפרויקט USDA רב למדינה מחקר W-2171 &quot;תא הנבט ופיתוח העובר מניפולציה לשיפור משק חי&quot; היא הודתה בהכרת תודה. הכישרון האמנותי של ריאן קלהאן, שהכין את האיורים טכני עבור חלק הווידאו של מאמר זה, הם גם הכירו בהכרת תודה.

1. הערכת התאמתם של עוברים cryopreservation 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות שנקטפו מן באיברי הרבייה של נקבות אדם התורם צריך להיות ממוקם בתוך המדיום עובר איזוטוני מחזיק במשך 10 דקות לפני הערכה באמצעות stereomicroscope. כדי להיות בטוח לשמור עוברים מן הנקבה כל התורם נפרדים אחד מהשני כדי לאפשר זיהוי של הורות של צאצאים החזרת העוברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בהגדלה נמוכה (≤ 10X), דגימות מן הנקבה תורם יחיד צריך להיות הפרדה לקבוצות נפרדות בהיקף של ביצית מופרית, מנוונת עוברים, או עוברים באיכות להעברה. רק בכיתה איכות 1 או 2 עוברים ב morula קומפקטית שלבים הבלסטוציסט מורחבת של התפתחות מתאימים cryopreservation, וכל השאר אמור להיות מושלך (אלא אם כן הנקבות הנמען סינכרוני זמינים עבור כיתה איכות 3 עוברים ושיעור שלאחר העברת ההריון של כ 25 % -30 נחשב מקובל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כיתה איכות 1 ו -2 morula קומפקטי עוברים דרך שלב הבלסטוציסט מורחבת בהגדלה 50X ≥ להבטיח כי pellucida zona של העובר תקין וכי יש חומר לא (למשל, תאים, ריר) דבקות pellucida zona. כל העובר עם סדוק או חסר zona pellucida או עם pellucida zona שיש חומר חסיד צריך להיות הפרדה מעוברים אחרים, או להיות מושלך או מעובד בנפרד. </li></ol> 2. עוברים כביסה להפחתת הסבירות של העברת מחלות 2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר zona pellucida-שלמים עוברים בהיקף מינימלי של המדיום העובר איזוטוני מחזיק לתוך הבאר הראשונה של המדיום עובר כביסה (למשל, פוספט שנאגרו מלוחים מוגבר עם אנטיביוטיקה שור סרום סרום אלבומין, עגל בן יומו, או פוליוויניל אלכוהול). שמור עוברים מן הנקבה כל התורם נפרד, אל תנסה לשטוף יותר מ -10 עוברים בבת אחת. העברת עוברים בהיקף מינימלי של המדיום לתוך לשטוף כל רצופים כדי להשיג דילול סדרתי ≥ 1:100, ולהיות בטוח לשימוש סטרילי טיפול העובר טיפים משתנים בין לשטוף כל רצופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עוברים דרך 4 שוטף יותר כמתואר 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם העברת מחלות ויראליות היא דאגה, לשטוף עוברים פעמיים בתמיסה טריפסין 0.25%, בפעם חשיפה סך בשילוב טריפסין של לא יותר מ 90 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שתי שוטף טריפסין, לשטוף עוברים פי 5 יותר במדיום העובר כביסה כמתואר 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף העובר הסופי, עוברים מקום לעובר איזוטוני מחזיק בינוני. </li></ol> 3. Dehydrating עוברים לפני cryopreservation 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעוברים יש להעביר בהיקף מינימלי של המדיום העובר איזוטוני מחזיק בפתרון hypertonic (1.4-1.5 ריכוז שן טוחנת) של סוכן cryoprotective (CPA), כגון אתילן גליקול או גליצרול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר עוברים לשבת בינוני הקפאה (hypertonic פתרון רו&quot;ח) עד שהם מגיעים לשיווי משקל אוסמוטי. מכיוון אתילן גליקול מחלחלת תאים עובריים במהירות רבה יותר מאשר עושה גליצרול, פעמים איזון הם בדרך כלל פחות עוברים אתילן גליקול (5 דקות) מאשר גליצרול (10 דקות). חלק מהזמן הזה ניתן להשיג איזון במהלך ואחרי עוברים נטענים לתוך קשיות (מתואר השלב הבא). </li></ol> 4. טוען עוברים לתוך קש פלסטיק 0.25 מ&quot;ל עבור cryopreservation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את התקע כותנה סוף קש 0.25 מ&quot;ל פלסטיק (11.5 ס&quot;מ אורך העבודה) להתקן טעינה העובר, וכן לשאוב כ 1.3 ס&quot;מ של פתרון רו&quot;ח hypertonic לתוך קשית שכותרתו כהלכה. מגוון פרוצדורות תיוג קיים, כולל השימוש בתוויות מודפסות המצורפת או תקע איטום קש או קש אחר מחובר עם מתאם קש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קש מפתרון רו&quot;ח, ואת לשאוב כ 0.15 ס&quot;מ של אוויר כדי ליצור בועות אוויר זעירות בתוך הקש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב עובר יחיד כ 0.8 ס&quot;מ של פתרון רו&quot;ח hypertonic לתוך הקש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קש מפתרון רו&quot;ח לשאוב כ 0.15 ס&quot;מ של אוויר כדי ליצור בועות אוויר זעירות second בתוך הקש (בועות אוויר לשרת פיזית לבודד את העובר בתוך הקשית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב כ 9.1 ס&quot;מ של פתרון רו&quot;ח למלא לגמרי את הקשית, להיות בטוח כדי למשוך בנפח מספיק של פתרון רו&quot;ח כדי ללחלח את polyvinylchloride (PVC) אבקת שקיים בתוך סוף כותנה התקע של הקש. הפתרון רו&quot;ח גורם אבקת PVC להגליד ואת החותם כי בסופו של הקש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הקצה השני של הקשית עם אבקת PVC, פלסטיק איטום תקעים קש, או אוטם חום. </li></ol> 5. הצבת עוברים לתוך מכונת דרג מבוקרת העובר הקפאת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבטיה או מתנול או חנקן נוזלי אדי מכונות הקפאת יכול להיות מתוכנת עבור cryopreservation של עוברים preimplantation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את קשיות המכילות את embry<html> os למכונת הקפאה שהטמפרטורה שלה כבר מקורר מ טמפרטורת הסביבה כדי -6 ° C. טען בקש תקע כותנה בסופו של דבר (אלא אם כן פלסטיק איטום קש תקעים או מתאמי קש נמצאים בשימוש, בהם כותנה מקרה בסוף תקע ממוקם מטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר עוברים לשבת בטמפרטורת זה לפחות 2 דקות לפני שתמשיך. </li></ol> 6. זרוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עוברים יש מקורר -6 ° C, להשתמש זוג מלקחיים בקירור בחנקן נוזלי (או מקל כותנה שקצהו שקוע חנקן נוזלי) כדי לגרום להיווצרות גבישי קרח בפתרון רו&quot;ח בתוך הקש ידי נגיעה מלקחיים (או כותנה מקל שקצהו) לעמודה של פתרון מעל או מתחת העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המים הפתרון רו&quot;ח יהיה להתגבש באזור חשוף חנקן נוזלי, וגבישי קרח יתפשט הטור של פתרון רו&quot;ח מיד סביב העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק עוברים על זריעת הטמפרטורה במשך 10 דקות לפני קירור נוסף. </li></ol> 7. התייבשות המשך של עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים מגניב בשיעור של 0.5 ° C / min עד לטמפרטורה של -34 ° C. זה קצב הקירור חשוב לוודא התייבשות המשיכה של העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק עוברים ב -34 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני הזינוק עוברים לתוך חנקן נוזלי (-196 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום cryopreserved עוברים לתוך הגביע שכותרתו כראוי (מלא חנקן נוזלי) מצורף מקל שכותרתו כראוי, ומקום את המקל לתוך מיכל של חנקן נוזלי דיואר לאחסון קצר או ארוך טווח. </li></ol> 8. הפשרת עוברים Cryopreserved <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את המכל לתוך הצוואר של חנקן נוזלי דיואר, להבטיח כי מיכל נשארת מתחת לקו הכפור של דיואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את מקל המכיל את העובר להיות מופשר, במהירות ובזהירות להסיר את קש מן הגביע, להיות בטוח שלא חם בקש אחרים הגביע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את מקש באוויר למשך 3-5 שניות (כדי להפחית את שכיחות סדוק zona pellucida 4), ​​ואז לצלול לתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים 25-30 שניות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קש מן האמבט במים, לנגב את קש (נזהרים שלא למרוח את הזיהוי העובר על הקש), להשתמש בהתקן קש חיתוך לחתוך את הקצה הלא כותנה תקע קש (אם באמצעות חום אטום או אבקת PVC ), או להסיר בזהירות את התקע איטום פלסטיק, או: <ol type="a" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטעון את קש לתוך המכשיר עובר העברה ולהעביר מהר ככל האפשר לנמען העובר סינכרוני (אבל רק אם העובר היה cryopreserved באמצעות אתילן גליקול כמו רו&quot;ח), או </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיק את הקצה הפתוח של הקשית מעל צלחת המכילה ריכוז 1.0 שן טוחנת של סוכרוז (תרכובת בלתי המחלחל), ולהשתמש זוג מספריים כדי לחתוך את התקע כותנה סוף הקש. תוכן קש צריך לזרום בחופשיות הפתרון סוכרוז, אבל דוחף עמודה קטנה של אויר דרך הקש עשוי להיות נחוץ אם בכלל בינוני שיורית קיימת בתוך הקש. אפשר עוברי להישאר פתרון סוכרוז למשך 10 דקות, ולאחר מכן להעביר עוברים לעובר איזוטוני מחזיק בינוני למשך 10 דקות. הערכת עוברים שלאחר ההפשרה, לטעון לתוך קש חדש, להעביר לנמען נקבות מתאים. </li></ol></li></ol> 9. נציג תוצאות: מגוון של גורמים עשויים להשפיע על ההריון לחיות שיעורי הילודה הנובע העברת קפוא מופשר עוברים preimplantation לנקבות הנמען סינכרוני 5. עוברים בשלבים התפתחותיים מתקדמים פחות morula קומפקטי או מתקדם יותר הבלסטוציסט מורחבת לעיתים קרובות אינם שורדים את תהליך cryopreservation כמו גם העוברים על morula קומפקטית, הבלסטוציסט מוקדם, הבלסטוציסט, ובשלבים הבלסטוציסט מורחבת של ההתפתחות העוברית. עוברים כיתה איכות 1 ו -2 תשואה גבוהה יותר לאחר ההפשרה שיעורי ההריון מאשר ציון איכות 3 עוברים (אשר בדרך כלל אינם cryopreserved בגלל שלאחר ההפשרה נמוכים ההריון). עוברים כשלה במהלך הקפאת העובר או העובר הפשרת ההליכים צפויים להפגין שיעורי ההריון מופחת. העוברים הועברו הנקבות הנמען אשר מחזורי הייחום אינם מסונכרנים עם זה של הנקבה תורם בדרך כלל לייצר שיעור ההריונות נמוך יותר. עוברים מיוצרים במבחנה או להשפיע בצורה כלשהי (למשל, ביופסיה או חצוי) בדרך כלל תשואה שיעור ההריונות נמוך יותר. בתנאים אופטימליים, שיעור ההריונות שהושגו לאחר העברת קפוא מופשר בעוברים נגזר vivo הוא בדרך כלל 60-70% בבקר 6,7, 65-75% בכבשים 8,9,10,11, ו - 60-70% ב עיזים 12,13,14,15. באופן דומה, שיעור ההריונות שהושגו לאחר העברת קפוא מופשר עוברי מבחנה מיוצר בדרך כלל 40-50% בבקר 6,16, 25-35% ב 17 כבשים, ו -% 30-40 ב 18 עזים. ble 1 &quot;/&gt; טבלה 1. שיעורי ההריון הצפוי בעקבות העברת עוברים מוקפאים, מופשרים של מינים מקומיים בעלי חיים מעלה גירה נקבות הנמען סינכרוני.

<ol>
	<li>Lindner, G. M., Wright, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+embryo+morphology+and+evaluation.">Bovine embryo morphology and evaluation.</a> Theriogenology. 20, 407-416 (1983).</li><li>Stringfellow, D. A., Stringfellow, D. A., Givens, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+the+sanitary+handling+of+in+vivo+derived+embryos.">Recommendations for the sanitary handling of in vivo derived embryos.</a> Manual of the International Embryo Transfer Society. , 65-68 (2010).</li><li>Youngs, C. R., Leibo, S. P., Godke, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+cryopreservation+in+domestic+mammalian+livestock+species.">Embryo cryopreservation in domestic mammalian livestock species.</a> CAB Reviews: Perspectives in Agriculture, Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources. , (2010).</li><li>Rall, W. F., Meyer, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zona+fracture+damage+and+its+avoidance+during+the+cryopreservation+of+mammalian+embryos.">Zona fracture damage and its avoidance during the cryopreservation of mammalian embryos.</a> Theriogenology. 31, 683-692 (1989).</li><li>Spell, A. R., Beal, W. E., Corah, L. R., Lamb, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+recipient+and+embryo+factors+that+affect+pregnancy+rates+of+embryo+transfer+in+beef+cattle.">Evaluating recipient and embryo factors that affect pregnancy rates of embryo transfer in beef cattle.</a> Theriogenology. 56, 287-297 (2001).</li><li>Hasler, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+current+status+of+oocyte+recovery,+in+vitro+embryo+production,+and+embryo+transfer+in+domestic+animals,+with+an+emphasis+on+the+bovine.">The current status of oocyte recovery, in vitro embryo production, and embryo transfer in domestic animals, with an emphasis on the bovine.</a> J. Anim. Sci. 76, 52-74 (1998).</li><li>Hasler, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+frozen+and+fresh+embryo+transfer+pregnancy+rates+in+cattle.">Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in cattle.</a> Theriogenology. 56, 1401-1415 (2001).</li><li>Heyman, Y., Vincent, C., Garnier, V., Cognie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+frozen-thawed+embryos+in+sheep.">Transfer of frozen-thawed embryos in sheep.</a> Veterinary Record. 120, 83-85 (1987).</li><li>McGinnis, L. K., Duplantis, S. C., Youngs, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+sheep+embryos+using+ethylene+glycol.">Cryopreservation of sheep embryos using ethylene glycol.</a> Anim. Reprod. Sci. 30, 273-280 (1993).</li><li>Shelton, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+viability+of+fresh+and+frozen-thawed+sheep+demi-embryos.">Factors affecting viability of fresh and frozen-thawed sheep demi-embryos.</a> Theriogenology. 37, 713-721 (1992).</li><li>Bettencourt, E. M., Bettencourt, C. M., Silva, J. C. E., Ferreira, P., Matos, C. P., Ram&#227;o, R. J., Rocha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+rates+following+the+transfer+of+ovine+embryos+cryopreserved+using+three+protocols.">Fertility rates following the transfer of ovine embryos cryopreserved using three protocols.</a> Small Ruminant Research. 82, 112-116 (2009).</li><li>Chemineau, P., Procureur, R., Cogni&#233;, Y., Lef&#232;vre, P. C., Locatelli, A., Chupin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production,+freezing+and+transfer+of+embryos+from+a+bluetongue-infected+goat+herd+without+bluetongue+transmission.+Theriogenology.">Production, freezing and transfer of embryos from a bluetongue-infected goat herd without bluetongue transmission. Theriogenology.</a> 26, 279-290 (1986).</li><li>Baril, B., Casamitjana, P., Perrin, J., Vallet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+production+freezing+and+transfer+in+Angora,+Alpine+and+Saanen+goats.">Embryo production freezing and transfer in Angora, Alpine and Saanen goats.</a> Zuchthyg. 24, 101-115 (1989).</li><li>Guignot, F., Bouttier, A., Baril, G., Salvetti, P., Pignon, P., Beckers, J. F., Touz&#233;, J. L., Cogni&#233;, J., Traldi, A. S., Cogni&#233;, Y., Mermillod, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+vitrification+method+allowing+direct+transfer+of+goat+embryos.">Improved vitrification method allowing direct transfer of goat embryos.</a> Theriogenology. 66, 1004-1011 (2006).</li><li>Nowshari, M. A., Holtz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+goat+morulae+to+blastocysts+before+freezing.">In vitro culture of goat morulae to blastocysts before freezing.</a> Theriogenology. 44, 983-988 (1995).</li><li>Machatkova, M., Hulinska, P., Reckova, Z., Hanzalova, K., Spanihelova, J., Pospisil, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+production+of+embryos+from+high+performance+cows+and+the+development+of+frozen-thawed+embryos+after+transfer:+a+field+study.">In vitro production of embryos from high performance cows and the development of frozen-thawed embryos after transfer: a field study.</a> Veterinarni Medicina. 53, 358-364 (2008).</li><li>Mart&#237;nez, A. G., Valc&#225;rcel, A., Furnus, C. C., de Matos, D. G., Iorio, G., de las Heras, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+in+vitro-produced+ovine+embryos.">Cryopreservation of in vitro-produced ovine embryos.</a> Small Ruminant Research. 63, 288-296 (2006).</li><li>Han, Y., Meintjes, M., Graff, K., Denniston, R., Zhang, L., Ziomek, C., Godke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caprine+offspring+born+from+fresh+and+frozen-thawed+in+vitro-produced+embryos.">Caprine offspring born from fresh and frozen-thawed in vitro-produced embryos.</a> Veterinary Record. 149, 714-716 (2001).</li><li>Leibo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-step+method+for+direct+nonsurgical+transfer+of+frozen-thawed+bovine+embryos.">A one-step method for direct nonsurgical transfer of frozen-thawed bovine embryos.</a> Theriogenology. 21, 767-790 (1984).</li><li>Voelkel, S. A., Hu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ethylene+glycol+as+a+cryoprotectant+for+bovine+embryos+allowing+direct+transfer+of+frozen-thawed+embryos+to+recipient+females.">Use of ethylene glycol as a cryoprotectant for bovine embryos allowing direct transfer of frozen-thawed embryos to recipient females.</a> Theriogenology. 37, 687-697 (1992).</li><li>Rall, W. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-free+cryopreservation+of+mouse+embryos+at+-196&#176;C+by+vitrification.">Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196&#176;C by vitrification.</a> Nature. 313, 573-575 (1985).</li><li>Notter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+genetic+diversity+in+livestock+populations+of+the+future.">The importance of genetic diversity in livestock populations of the future.</a> J. Anim. Sci. 77, 61-69 (1999).</li><li>Thibier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+retrieval+committee+statistics+of+embryo+transfer-+year+2008.+The+worldwide+statistics+of+embryo+transfers+in+farm+animals.">Data retrieval committee statistics of embryo transfer- year 2008. The worldwide statistics of embryo transfers in farm animals.</a> Embryo Transfer Newsletter. 27, 13-19 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מכיוון עוברים מורכב בעיקר מים, חשוב כי עוברי preimplantation להיות מיובש כראוי ומקורר לאט בהתאם לפרוטוקול המתוארים כאן, כדי למנוע היווצרות תאיים גביש קרח. לאחר תהליך הקירור החלה, חשוב לשמור על שינוי טמפרטורה חד כיווני, כדי למנוע תנודות הטמפרטורה. ייזום של היווצרות גבישים קרח (&quot;זריעה&quot;) בטמפרטורה מתאימה לפתרון רו&quot;ח ספציפי הוא קריטי. עשיית שינויים קירור זה איטי / שיטת הפשרה מהירה עבור cryopreservation העובר preimplantation כוללים את השיטה צעד אחד (שם העמודה האחרונה של המדיום נטען לתוך קש הוא סוכרוז במקום פתרון רו&quot;ח) 19 ואת שיטת ההעברה הישירה (שם עוברים מוקפאים ב אתילן גליקול הם הפשירו והועברו ישירות אל הרחם של נקבה הנמען מבלי להסיר את אתילן גליקול מן העובר) 20. כדי להפחית את עוצמת הקול של אתילן גליקול שהופקדו אל תוך הרחם של העברה ישירה (DT) נקבה הנמען, רצוי למלא את קש 0.25 מ&quot;ל עם 6 ס&quot;מ מחזיק בינוני לפני שתמשיך כפי שתואר לעיל. יצוין כי תקן וולונטרי שקיים בתוך תעשיית העברת מסחרי העובר כי עוברי preimplantation cryopreserved עבור DT צריך להיות קפוא צהוב בצבע קש ומאוחסנים בצבע צהוב גביעים של חנקן נוזלי דיואר. ענף מסחרי יש גם דרישות סימון ספציפיות עבור כל עוברי cryopreserved בה יש ללכת. חלופה אחת לשיטה זו vitrification 21, שיטה של שיווי משקל בלתי cryopreservation שם יותר מרוכז מאוד (6-8 מ &#39;) רו&quot;ח הפתרון הוא מקורר אולטרה במהירות גורם פתרון רו&quot;ח לשנות מנוזל מדינה &quot;זגוגיות&quot; ללא קרח היווצרות גבישים. Vitrification סביר יותר מתאים cryopreservation של עוברים כי הם פחות מתקדמים יותר מבחינה התפתחותית morula קומפקטי עקב רגישות מוגברת שלהם הטמפרטורה. טכניקה זו בקשה לשימור המשאבים הייחודיים germplasm 22, כמו גם את תעשיית העברה בינלאומית מסחרית עובר שם יותר מ 55% של כ 500,000 עוברי preimplantation שור הועבר בשנה הקלנדרית 2008 היו cryopreserved. 23

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> BioLife בינוני להקפיא </td><td> Agtech, Inc </td><td> C18, C18A </td><td> 1.5 מ אתילן גליקול </td></tr><tr><td> אתילן גליקול Emcare להקפיא פתרון </td><td> ICPBio רפרודוקציה </td><td> IC8, IC10 </td><td> 1.5 מ אתילן גליקול </td></tr><tr><td> אתילן גליקול ViGro להקפיא פלוס </td><td> Bioniche לבריאות בעלי חיים </td><td> EVM835 </td><td> 1.5 מ אתילן גליקול </td></tr><tr><td> Emcare 10% גליצרול להקפיא פתרון </td><td> ICPBio רפרודוקציה </td><td> IC12 </td><td> 1.34 מ &#39;גליצרול </td></tr><tr><td> Emcare 1 M להפשיר סוכרוז </td><td> ICPBio רפרודוקציה </td><td> IC16 </td><td> סוכרוז 1.0 M </td></tr><tr><td> ViGro צעד אחד ההפשרה </td><td> Bioniche לבריאות בעלי חיים </td><td> EVM247, EVM847 </td><td> סוכרוז 1.0 M </td></tr><tr><td> ViGro להפשיר 1-2-3 פלוס </td><td> Bioniche לבריאות בעלי חיים </td><td> EVM248, EVM848 </td><td> 5%, 2.5%, 0% גליצרול עם 0.5, 0.5, סוכרוז 0.6% </td></tr><tr><td> Emcare CSU מפשיר ערכת </td><td> ICPBio רפרודוקציה </td><td> IC20 </td><td> 6%, 3%, 0% גליצרול עם סוכרוז 10.3% </td></tr><tr><td> BioLife מחזיק ובינוניים להעביר </td><td> Agtech, Inc </td><td> C15, C15A </td><td> שונה PBS BSA עם 0.4% (שור אלבומין) </td></tr><tr><td> Emcare פתרון מחזיק </td><td> ICPBio רפרודוקציה </td><td> IC2, IC4, IC6 </td><td> 0.4% BSA (אלבומין בסרום שור), מאגר מגבים (zwitterions אינרטי) </td></tr><tr><td> ViGro מחזיק פלוס </td><td> Bioniche לבריאות בעלי חיים </td><td> EVM024, EVM824 </td><td></td></tr><tr><td> SYNGRO אחזקות בינוני </td><td> Bioniche לבריאות בעלי חיים </td><td> ESM024, ESM224, ESM828 </td><td> מכיל hyaluronan; אין מוצרים מן החי </td></tr><tr><td> BioLife שונה D-PBS </td><td> Agtech, Inc </td><td> C06 </td><td> פוספט שונה של Dulbecco שנאגרו מלוחים </td></tr><tr><td> BioLife BSA שבר V </td><td> Agtech, Inc </td><td> B09 </td><td> lyophilized שור סרום אלבומין, חלק V </td></tr><tr><td> BioLife לאנטיביוטיקה antimycotic </td><td> Agtech, Inc </td><td> B01 </td><td> amphotericin-B, פניצילין G, סולפט סטרפטומיצין </td></tr><tr><td> BioLife טריפסין ערכת </td><td> Agtech, Inc </td><td> C22A </td><td> 25 גרם lyophilized טריפסין, מים סטריליים, סטרילי D-PBS </td></tr></tbody></table><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם הציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> Biol-Cool בקצב מבוקר במקפיא </td><td> FTS מערכות </td><td> BC-IV -40 </td><td> אמבטיה מתנול במקפיא </td></tr><tr><td> להקפיא במקפיא מבוקר בקרת קצב </td><td> Cryologic </td><td> CL2200 </td><td> חנקן נוזלי מקפיא </td></tr></tbody></table>

cryopreservation of preimplantation embryos of cattle, sheep, and goats

עוברים Preimplantation מן בקר, כבשים, עזים עשוי להיות cryopreserved לאחסון קצר או ארוך טווח. עוברים Preimplantation מורכב בעיקר מים, הימנעות היווצרות קרח תאיים קריסטל בתהליך cryopreservation היא בעלת חשיבות עליונה לשמור על כדאיות העובר. עוברים ממוקמים בפתרון hypertonic (1.4-1.5 מ &#39;) של סוכן cryoprotective (CPA), כגון אתילן גליקול (למשל) או גליצרול (GLYC) כדי ליצור שיפוע האוסמוטי המאפשרת התייבשות הסלולר. לאחר עוברים להגיע לשיווי משקל אוסמוטי בפתרון רו&quot;ח, שהם נטענים בנפרד הפתרון רו&quot;ח hypertonic לתוך 0.25 קשיות מ&quot;ל להקפאה. עוברים הם מכניסים למקפיא שיעור מבוקר בטמפרטורה של -6 ° C. היווצרות קרח קריסטל מושרה בתמיסה רו&quot;ח המקיפים את העובר, וגיבוש גורמת לעלייה בריכוז של רו&quot;ח החיצוני של העובר, ולגרום להתייבשות סלולרית נוספת. עוברים הם מקורר בקצב של 0.5 דקות ° / C, המאפשר התייבשות נוספת, לטמפרטורה של -34 מעלות צלזיוס, בטרם צלל לתוך חנקן נוזלי (-196 ° C). עוברים Cryopreserved חייב להפשיר לפני העברת לנמען (פונדקאית) נקבה. קשיות המכילות את העוברים יוסרו דיואר החנקן הנוזלי, שנערך באוויר החדר הטמפרטורה במשך 3 עד 5 שניות, והניח בתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים 25 עד 30 שניות. עוברים cryopreserved ב GLYC ממוקמות לתוך פתרון 1 M של סוכרוז במשך 10 דקות להסרה של רו&quot;ח לפני העברה לנמען (פונדקאית) נקבה. עוברים cryopreserved ב EG, לעומת זאת, ניתן להעביר ישירות אל הרחם של הנמען.

Watch this Scientific Journal Video about Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats at JoVE.com

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

עוברים Preimplantation ניתן cryopreserved לאחר מיקום בפתרון cryoprotective hypertonic לגרום להתייבשות הסלולר. לאחר איזון, היווצרות קרח קריסטל מושרה בפתרון המקיף את העובר. התייבשות נוספת מתרחשת כאשר העובר הוא מקורר לאט לטמפרטורות שמתחת לאפס לפני צולל לתוך חנקן נוזלי לאחסון.

Cryopreservation של עוברים Preimplantation של בקר, כבשים ועזים

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

cryopreservation-of-preimplantation-embryos-of-cattle-sheep-and-goats

Research

JoVE Journal

Biology

30.6K Views.  Iowa State University. עוברים Preimplantation ניתן cryopreserved לאחר מיקום בפתרון cryoprotective hypertonic לגרום להתייבשות הסלולר. לאחר איזון, היווצרות קרח קריסטל מושרה בפתרון המקיף את העובר. התייבשות נוספת מתרחשת כאשר העובר הוא מקורר לאט לטמפרטורות שמתחת לאפס לפני צולל לתוך חנקן נוזלי לאחסון.

Video: Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection של 6.5 עוברים DPC עכבר

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Plastic sections maintain true tissue morphology in thin sections of tissue that can be immunostained with fluorescent secondary antibodies, making this method more useful than paraffin-embedded or frozen sections for many types of tissue. The method for staining, plastic embedding, and sectioning is demonstrated in this video.

פלסטיק הטבעת ואת חתך של עוברים Xenopus laevis

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

הר שלם כפול באתרו הכלאה של עוברים צ&#39;יק מוקדם

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse embryos could be frozen and stored at -196 &deg;C and, a few years later, Parkening et al. 3 reported the birth of live offspring resulting from in vitro fertilization (IVF) of cryopreserved oocytes. Since then, the use of cryopreservation techniques has rapidly spread to become an essential component in the practice of human and animal assisted reproduction and in the conservation of animal genetic resources. Currently, there are two main methods used to cryopreserve oocytes and embryos: slow freezing and vitrification. A wide variety of approaches have been used to try to improve both techniques and millions of animals and thousands of children have been born from cryopreserved embryos. However, important shortcomings associated to cryopreservation still have to be overcome, since ice-crystal formation, solution effects and osmotic shock seem to cause several cryoinjuries in post-thawed oocytes and embryos. Slow freezing with programmable freezers has the advantage of using low concentrations of cryoprotectants, which are usually associated with chemical toxicity and osmotic shock, but their ability to avoid ice-crystal formation at low concentrations is limited. Slow freezing also induces supercooling effects that must be avoided using manual or automatic seeding 4. In the vitrification process, high concentrations of cryoprotectants inhibit the formation of ice-crystals and lead to the formation of a glasslike vitrified state in which water is solidified, but not expanded. However, due to the toxicity of cyroprotectants at the concentrations used, oocytes/embryos can only be exposed to the cryoprotectant solution for a very short period of time and in a minimum volume solution, before submerging the samples directly in liquid nitrogen 5. In the last decade, vitrification has become more popular because it is a very quick method in which no expensive equipment (programmable freezer) is required. However, slow freezing continues to be the most widely used method for oocyte/embryo cryopreservation. In this video-article we show, step-by-step, how to collect and slowly freeze hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

In this video-article we present a step-by-step demonstration on how to collect and cryopreserve hamster oocytes with high post-thaw survival rates. The same procedure can also be applied to successfully freeze and thaw mouse embryos at different stages of preimplantation development.

איסוף cryopreservation של ביציות ועוברים אוגר עכבר

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation עוברים Medaka והשתלות Cell עבור דור של מפלצות

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...