Questo lavoro è stato sostenuto da NIH HL109478 (KNF). Gli autori riconoscono e ringraziano Gina Kim e Joann Taylor per la loro assistenza a isolare e mantenere il PASMC nella cultura.

La cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Northwestern University hanno approvato questo protocollo. 1. Pulmonary Artery Isolamento da topi neonati - Day One <ol><li> Preparare i completi M199 media - Mix 400 ml M199 con 100 ml (concentrazione finale = 20%) di calore FBS inattivato e 5 ml (concentrazione finale = 1%) penicillina / streptomicina. </li><li> Preparare i livelli di free M199 Media - Mix 500 ml M199 con 5 ml (concentrazione finale = 1%) penicillina / streptomicina. </li><li> Preparare la PA agarosio - Mix 0,05 g di agarosio, più 0.05 g particelle di ferro in 10 ml sterili, privi di siero M199 media. </li><li> Preparare il polmone agarosio - Mix 0.1 g di agarosio in 10 ml sterili, privi di siero M199 media. </li><li> Preparare la Collagenasi - Mix collagenasi in sterili, senza siero M199 supporti ad una concentrazione finale di 80 U / ml e poi filtro sterile questa miscela. </li&gt; <li> Impostare tutte le attrezzature prima del tempo prima di eutanasia il mouse. </li><li> Set PA agarosio e polmone agarosio a bollire a destra prima di eutanasia il mouse. </li><li> Euthanize il mouse nel vaso anestesia con isoflurano overdose e fare attenzione a non lasciare il mouse cucciolo a venire in contatto con l&#39;isoflurano. La resa migliore cella si ottiene quando le cellule sono raccolte immediatamente dopo la morte per evitare micro-coaguli che si formano nella circolazione dopo la morte. </li><li> Rimuovere il mouse dal vaso anestetico, fissare il mouse al bordo di funzionamento, e sterilizzare il mouse, strumenti e guanti con l&#39;alcol. </li><li> Caricare il bisturi con la lama e incidere il mouse dal collo all&#39;addome inferiore. </li><li> Aprire l&#39;addome sul lato sinistro del mouse, esporre il rene, e tagliare l&#39;arteria renale per permettere il mouse per exsanguinate, evitando così la formazione di coaguli nei piccoli vasi dei polmoni. </li><li> Usare le forbici per tagliare lungo il lato sinistro del toposterno per aprire il torace. </li><li> Usare con attenzione bisturi per tagliare il diaframma su entrambi i lati e aprire completamente la cavità toracica. Usare pinze o perni per tenere la cavità toracica aperta. </li><li> Attaccare il camper con un 27 G ½ pollice ago diretto verso la PA e nei profumi della RV / PA / polmoni con PBS sterile fino a quando i polmoni appaiono bianchi (tutto il sangue lavata della circolazione polmonare). Ciò richiederà circa 3-5 ml di PBS a seconda delle dimensioni del mouse. È importante lavare prima per prevenire la formazione di coaguli nei piccoli vasi polmonari. </li><li> Usare con attenzione smussa per esporre la trachea e filo uno sotto di sutura. </li><li> Mettete le pinze più piccole sotto la trachea per il supporto e posizionare il angiocatheter 24 G nella trachea. Posizionare il angiocatheter come se mettendo una flebo. </li><li> Fissare il angiocatheter nella trachea con la sutura infilato nel passo 1.16. </li><li> Fate bollire PA agarosio di acqua bollente, e miscelare bene. Raffreddare la AgaroSE a circa temperatura corporea agitando il ghiaccio. L&#39;agarosio deve rimanere in soluzione ma non essere così caldo che danneggia le cellule della PA. </li><li> Attaccare il camper con un 27 G ½ ago pollici e profumato il RV / PA / polmoni con PA agarosio fino a quando i polmoni appaiono grigie. Le particelle di ferro nella miscela agarosio renderanno i polmoni appaiono di colore grigio. Ciò richiederà circa 3-5 ml di agarosio PA seconda delle dimensioni del mouse. E &#39;anche importante procedere lentamente come iniettando troppo veloce potrebbe causare il ferro di infiltrarsi nella vie aeree. </li><li> Prendere l&#39;agarosio polmone di acqua bollente e miscelare bene. Poi raffreddare l&#39;agarosio a circa temperatura corporea agitando il ghiaccio. L&#39;agarosio deve rimanere in soluzione ma non essere così caldo che danneggia le cellule del polmone. </li><li> Redigere l&#39;agarosio polmone e allegare la siringa al angiocatheter G 24 nella trachea. Infondere l&#39;agarosio attraverso la trachea per gonfiare completamente i polmoni. I polmoni saranno easier per tritare (vedi punti successivi) se i polmoni sono opportunamente gonfiati. </li><li> Rimuovere il blocco cuore-polmone, e immergerlo in 25 ml di PBS freddo ghiaccio a solidificare l&#39;agarosio (~ 5 min). Utilizzare questo tempo per ripulire l&#39;area chirurgica. </li><li> Per i topi neonati (P7-P21), il miglior rendimento PASMC deriva dalla combinazione di 2-3 cuccioli in una serie di celle. PASMC preferiscono essere in contatto con altre cellule per la salute e la crescita cellulare ottimale. Se un mouse viene utilizzato per l&#39;isolamento, allora le cellule sono molto scarse e non crescono bene. Quando si combinano gli animali, raccolta e raffreddare i blocchi cuore-polmone insieme e poi passare a tritare una volta tutti i blocchi di cuore-polmone sono stati rimossi dagli animali. </li><li> Passare alla cappa coltura cellulare per la sterilità da questo punto in poi. </li><li> Collocare i polmoni refrigerati nel coperchio del piatto di coltura 10 cm tissutale e trasferire il cuore, timo, trachea, e qualsiasi tessuto connettivo dai polmoni. </li><li> Spostare i polmoni al fondo del piatto di coltura 10 cm tissutalee aggiungere circa 1 ml ghiacciata PBS sterile. </li><li> Tritare i polmoni in pezzi molto piccoli (1-2 mm) con 2 bisturi. </li><li> Rompere la punta fuori di una sterile 5 ml pipetta sierologica. Pipetta tritata liquami polmone in sterile da 50 ml tubo conico. Utilizzare ulteriori sterile PBS freddo per lavare la piastra per assicurare che tutto il tessuto polmonare entra nel tubo da 50 ml. </li><li> Collocare la provetta da 50 ml sul magnete. Attendere per il tessuto contenente ferro per spostarsi lato del tubo vicino al magnete. A seconda del rapporto di contenente ferro vaso di tessuto polmonare, alcune delle navi possono ancora essere galleggiante, a questo punto. Aspirare il PBS fuori lentamente e con attenzione cercando di non aspirare il tessuto polmonare fluttuante poiché non è chiaro se contiene vasi. </li><li> Lavare il pellet polmone 3x con 5 ml di PBS sterile, nuovamente cercando di minimizzare la quantità di tessuto polmonare che viene aspirato. </li><li> Risospendere il pellet polmonare in 3 ml di collagenasi e versare in 60 millimetri piatto di coltura di tessuti. Noncercano di dispensare questo, i pezzi di polmone si attacchi al l&#39;interno della vostra pipetta. </li><li> Utilizzare un ulteriore 3 ml per sciacquare il tubo dopo la colata, e versare questo in 60 millimetri piatto di coltura di tessuti pure. </li><li> Luogo in 37 ° C di coltura tissutale incubatore per 1 ora. </li><li> Pipetta tessuto + collagenasi slurry su e giù con una G 15 smussato ago su una siringa da 5 ml fino a quando tutti i grandi pezzi polmonari sono interrotti. Il tessuto + collagenasi impasto sarà nuvoloso, a questo punto, senza pezzi di tessuto visibili. </li><li> Versare in una nuova sterile da 50 ml tubo conico e si attaccano al magnete. </li><li> Lavare il piatto di coltura tissutale con circa 5 ml di mezzi completi M199 per assicurare che tutto il tessuto sono stati raccolti, e versare questo nel tubo conico. </li><li> Aspirare al largo della collagenasi + supporti surnatante. Questa volta ci sarà molto poche miodesopsie, e un compatto contenente ferro pellet sarà sul lato del tubo conico accanto al magnete. </li><li> Lavare con 5 ml completo media 3x. Questo è necessario per inattivare la collagenasi. </li><li> Aggiungere 3 ml di mezzi completi, e mescolare su e giù un paio di volte per risospendere il pellet contenente ferro. </li><li> Versare il sedimento risospeso in un piatto di coltura di tessuti di 35 mm. Utilizzando un microscopio, ci saranno piccoli frammenti galleggiamento sia intorno con particelle di ferro contenute nel lume del vaso. </li><li> Posizionare la cultura piatto tessuto (etichettato piastra zero) nel tessuto culturale incubatore durante la notte. Le prime cellule a migrare fuori sulla piastra pari a zero sono circa il 50% e il 50% fibroblasti PASMC, sulla base di colorazione per i marcatori muscolari lisce. Questa piastra è chiamato a zero placcato ed infine scartato dopo i passi successivi arricchimento. </li></ol> 2. Pulmonary Artery Isolamento da topi neonati - Day Two <ol><li> Versate i media surnatante da piastra a zero in un tubo da 50 ml conica pulito. </li><li> Aspirare il surnatante media. Questa volta non ci sarà quasi nessuna mosche volanti, e una compatta di ferro containing pellet formerà sul lato del tubo conico accanto al magnete. </li><li> Lavare con 5 ml di mezzi completi 3x. </li><li> Aggiungere 3 ml di mezzi completi, e mescolare su e giù un paio di volte per risospendere il pellet contenente ferro. </li><li> Versare in un piatto di coltura di tessuti di 35 mm. Utilizzando un microscopio, piccoli frammenti di vasi che galleggiano intorno con particelle di ferro contenute nel lume del vaso si vedono. Questo sarà una piastra (Figura 1A). </li><li> Posizionare il piatto di coltura tissutale nella coltura tissutale incubatore. </li></ol> 3. Pulmonary Artery Isolamento da topi neonati - Sesto giorno <ol><li> Versare il supporto supernatante dal piatto uno in una provetta conica da 50 ml pulito. Ripetendo questa operazione più volte assicura che tutte le cellule muscolari lisce residenti nella parete del vaso abbiano la possibilità di migrare via sopra una piastra di coltura cellulare. C&#39;è un ritorno diminuendo con ogni passo cioè ogni piatto avrà sempre meno cellule aderiscono. </li><li&gt; Refeed piatto uno con completi M199 media, e il luogo di nuovo nel tessuto culturale incubatore. </li><li> Aspirare il surnatante media. Questa volta non ci saranno quasi nessun miodesopsie, e un compatto contenente ferro pellet si forma sul lato del tubo conico accanto al magnete. </li><li> Lavare con 5 ml di mezzi completi 3x. </li><li> Aggiungere 3 ml di mezzi completi, e mescolare su e giù un paio di volte per risospendere il pellet contenente ferro. </li><li> Versare in un piatto di coltura di tessuti di 35 mm. Utilizzando un microscopio, piccoli frammenti di vasi che galleggiano intorno con particelle di ferro contenute nel lume del vaso si vedono. Questo sarà piastra due. </li><li> Posizionare il piatto di coltura tissutale nella coltura tissutale incubatore. </li></ol> 4. Pulmonary Artery Isolamento da topi neonati - Nono giorno <ol><li> Versare il surnatante multimediale dal tessuto cultura piatto piatto due in un tubo da 50 ml conica pulito. </li><li> Piastra refeed due con completi M199 media, e posto di nuovo nel tessuto della culturaincubatrice. </li><li> Aspirare il surnatante media. Questa volta non ci saranno quasi nessun miodesopsie, e un compatto contenente ferro pellet si forma sul lato del tubo conico accanto al magnete. </li><li> Lavare con 5 ml di mezzi completi 3x. </li><li> Aggiungere 3 ml di mezzi completi e mescolare su e giù un paio di volte per risospendere il pellet contenente ferro. </li><li> Versare in un piatto di coltura di tessuti di 35 mm. Utilizzando un microscopio, piccoli frammenti di vasi che galleggiano intorno con particelle di ferro contenute nel lume del vaso si vedono. Questo sarà piastra tre. </li><li> Posizionare il piatto di coltura tissutale nella coltura tissutale incubatore. </li></ol> 5. Pulmonary Artery Isolamento da topi neonati - Day Thirteen <ol><li> Aspirare i media off di piastre 1-3. </li><li> Lavare delicatamente le cellule con il caldo, PBS sterile. </li><li> Aggiungi una sottile pellicola di tripsina (~ 0,25-0,5 ml) tripsina ad ogni piatto per trypsinize le cellule. Cellule sono molto aderente e dovranno essere in tripsina nel tessuto culri incubatrice per circa 10 minuti per sollevare la piastra. </li><li> Celle di raccolta al largo delle piastre in 5 ml mezzi completi in una provetta da 50 ml attaccato al magnete per estrarre eventuali particelle di ferro residuo. </li><li> Lavare ciascuna delle piastre con un ulteriore 0,5 ml di mezzi completi e aggiungere quel supporto per il tubo da 50 ml. </li><li> Questa volta, prendere il surnatante dei media (non aspirare), e scartare il ferro particella pellet. </li><li> Piastra le cellule in 5 ml completi M199 media in un piatto di 60 millimetri di avere cellule confluenti in pochi giorni. In alternativa, la piastra le cellule in 10 ml completi M199 media in un cm piastra 10 e PASMC prenderanno circa altre 1-2 settimane per raggiungere confluenza. </li></ol> 6. Pulmonary Artery Isolamento da topi neonati - Day Fourteen <ol><li> Cambiare il supporto per nuovi completi M199 mezzi per rimuovere ogni residuo di tripsina. Ci sarà una popolazione sottile di PASMC sulla coltura tissutale piatto (Figura 1B). </li></ol> 7. Routine Cura <ol><li> Cambiare il supporto per nuovi completi M199 dei media circa 2 volte a settimana. </li><li> Quando si divide queste cellule, sono richieste circa 10 min in incubatrice in un film di tripsina (0,25-0,5 ml) per le cellule per sollevare la piastra. Utilizzando il film tripsina permette replating del PASMC senza far mai fermare le cellule. Se viene usato troppo tripsina, allora il PASMC devono essere centrifugate a girare la tripsina, o le cellule non readhere alla piastra. A volte, dopo la filatura giù per le cellule, è difficile ottenere il PASMC risospeso in completi M199 media. </li><li> Nelle osservazioni, il PASMC isolato si comportano come le cellule muscolari lisce in modo affidabile per 4-5 passaggi, ma le cellule isolate si macchia di cellule muscolari lisce marcatori fino al passaggio 7. Contare il primo pool di 60 millimetri o 10 cm Piatto del giorno tredici come passaggio 2 (placcatura dopo la prima esposizione a tripsina). </li></ol>

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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+Dismutase+and+Inhaled+Nitric+Oxide+Normalize+Phosphodiesterase+5+Expression+and+Activity+in+Neonatal+Lambs+with+Persistent+Pulmonary+Hypertension.">Superoxide Dismutase and Inhaled Nitric Oxide Normalize Phosphodiesterase 5 Expression and Activity in Neonatal Lambs with Persistent Pulmonary Hypertension.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 299, L109-L116 (2010).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

In questo manoscritto, si descrive per la prima volta l&#39;isolamento di PASMC da topi a P7, P14, e P21. Per ottenere questo risultato, un impasto di agarosio e 0,2 particelle di ferro m sono infusa attraverso il camper nella PA. A causa della piccola dimensione delle particelle di ferro, non possono passare attraverso il letto capillare polmonare e sono quindi depositati nel piccolo PA. I polmoni sono gonfiati, rimossi e dissociato. I vasi contenenti ferro sono estratti di soluzione con un magnete. In definitiva, i va...

Ipertensione polmonare è normale durante la vita intrauterina poiché la placenta funge da organo principale di scambio di gas e solo il 10% della gittata cardiaca viene fatto circolare attraverso il letto vascolare polmonare. In utero, pressione polmonare sono simili alle pressioni sistemiche dovute a elevata resistenza vascolare polmonare . Come gestazione progredisce, vi è una rapida crescita del piccolo PA all&#39;interno del polmone, preparando il feto per il drammatico aumento del flusso sanguigno polmonare che si verifica alla nascita 1. Quando la normale transizione perinatale fallisce nei neonati a breve termine e pieno termine, il risultato è l&#39;ipertensione polmonare persistente del neonato (PPHN). PPHN è una sindrome clinica causata da molte diverse patologie sottostanti. Tuttavia, tutti questi bambini condividono caratteristiche fisiopatologiche comuni come l&#39;elevata resistenza vascolare polmonare, ipossiemia, e shunt da destra a sinistra del flusso di sangue attraverso le connessioni persistenti fetali come il dotto arterioso o peramen ovale. PPHN colpisce 2-6 per 1.000 nati vivi e trasmette un rischio 8-10% di mortalità, così come significative a breve termine e lungo termine morbilità 2. Inoltre, molto basso peso alla nascita i neonati prematuri possono sviluppare ipertensione polmonare come conseguenza della loro malattia polmonare sottostante. La più comune malattia polmonare sottostante dei neonati prematuri è displasia broncopolmonare (BPD). Mentre il rischio complessivo di BPD è correlata con l&#39;età gestazionale e peso alla nascita, non è chiaro perché un sottoinsieme di questi bambini si sviluppa ipertensione polmonare significativa e come trattare in modo appropriato questi bambini. Scarsi risultati, tra ricoveri ospedalieri prolungati e aumento della mortalità, sono comuni 3-6. Storicamente, ovina PASMC fetale o suina PASMC fetale da animali sani sono stati utilizzati per studiare le vie di segnalazione coinvolte nel normale transizione vascolare polmonare dopo la nascita. Questi sono tipicamente isolati da quinta resistenza PA generazione di unn ovina o suina feto che viene consegnato ed eutanasia prima di ogni respirazione spontanea 7-9. Inoltre, alcuni ricercatori hanno isolato e utilizzato PASMC da leggermente più vecchio e respiro spontaneo agnelli e maialini a 3 giorni, 2 settimane e 4 settimane 10-12. Più recentemente, alcuni gruppi hanno isolato con successo ed utilizzato PASMC isolato da agnelli con PPHN per esaminare le alterazioni in vie di segnalazione dello stato della malattia 13-17. Queste cellule hanno dimostrato di essere un valido strumento per esaminare quali vie di segnalazione sono cruciali sia nel sistema vascolare polmonare normale e malato breve termine e durata. Tuttavia, essi non danno comprensione nei percorsi di segnalazione impattati nei neonati prematuri con ipertensione polmonare. Né permettono le possibilità di manipolazione genetica visto in modelli murini di malattia. Modelli di ratto e di topo sono stati a lungo utilizzati per modello BPD e più di recente vengono utilizzati per hy polmonare modellopertension derivanti da BPD 18-22. Ratti neonati sono allettanti per lavorare con per la loro dimensione più grande, ma soffrono anche per la mancanza di potenziale di modificazione genetica. Animali geneticamente modificati sono stati ampiamente utilizzati per studiare gli effetti di specifici obiettivi del gene su tutta la fisiologia degli animali in topi neonati, ma fino ad oggi nessuno ha precedentemente isolato con successo PASMC da questi piccoli topi. Isolando PASMC, maggiori informazioni sono disponibili su come percorsi cambiano in risposta a stimoli ambientali e / o di modificazione genetica in particolare nella muscolatura liscia arteriosa polmonare. Ulteriormente, vivo PASMC può essere ripreso in tempo reale per esaminare rapidi cambiamenti molecole di segnalazione chiave come calcio e specie reattive 23-25. Recentemente abbiamo descritto l&#39;isolamento di successo di PASMC da topi adulti utilizzando una variazione della tecnica di Marshall et al. 26 usato per isolare ratto PASMC 23,25,26. Ora abbiamo adattato unnd esteso questa tecnica per piccoli topi 7-21 giorni di età (P7, P14 e P21). Il limite principale di questa nuova tecnica di isolamento PASMC è che richiede mouse multipli per generare cellule sufficiente per esperimenti e che le cellule crescono molto lentamente, che è caratteristica delle cellule muscolari lisce primarie. Nonostante questi limiti, crediamo che questa tecnica per isolare neonatale PASMC del mouse consentirà la migliore ricerca delle vie di segnalazione chiave coinvolti nello sviluppo di ipertensione polmonare e rappresenta un significativo passo avanti in questo campo.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bard Parker surgical blade handle</td>
			<td>BD</td>
			<td>371030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel surgical blades #10 (sterile)</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>4-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes (3 ml and 5 ml, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657 and 306646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (27 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiocatheter (24 G, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>381412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoject blunt cannula (15 G)</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>SWD202314Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutures</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9782896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynal magnet particle collector</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>120-01D</td>
			<td>This is a critical tool for the protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture plates (35 mm, 60 mm, and 10 cm, sterile)</td>
			<td>BD</td>
			<td>353001, 353004, and 353003</td>
			<td>Any brand of tissue culture plates will be fine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors (4 &#189; inch stainless steel)</td>
			<td>American Diagnostic Corporation</td>
			<td>3424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps (4 inch stainless steel)</td>
			<td>Quick Medical</td>
			<td>L5-5004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199 media</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>TX16777-164NWU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Hyclone/Thermo Scientific</td>
			<td>SH3091003</td>
			<td>Heat inactivate at 55 &#176;C for 45 min. For consistency in results, lot match all serum and obtain from same vendor.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron particles (iron (II, III) oxide powder)</td>
			<td>Aldrich Chemical Company</td>
			<td>#31,006-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase (made to 80 U/ml)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Butlet Schein</td>
			<td>NDC 11695-6776-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE2000-U with a Cascade Photometrics 12-bit camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE2000-U</td>
			<td>Any good light microscope will be fine to observe PASMC in culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-desmin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D-8281</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-smooth muscle myosin</td>
			<td>Biomedical Technologies</td>
			<td>BT-562</td>
			<td>Use at 1:2,000 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-red anti-rabbit secondary</td>
			<td>Molecular Probes/Invitrogen</td>
			<td>R-6394</td>
			<td>Use at 1:200 dilution for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse TE-300 fluorescent microscope and Cool Snap digital camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE300</td>
			<td>Any good epifluorescence microscope will be fine for immunostaining.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>BML-AK800-0001</td>
			<td>This is the only colorimetric PDE enzyme activity assay available.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sildenafil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PZ-0003</td>
			<td>A PDE5-selective inhibitor is required for the PDE enzyme activity to determine specificity of cGMP hydrolysis.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice

L&#39;ipertensione polmonare è una causa importante di morbilità e mortalità nei neonati. Storicamente, sono stati fatti significativi studio delle vie di segnalazione coinvolte nella contrazione del muscolo liscio vascolare in PASMC di pecora fetale. Mentre pecore fanno un eccellente modello di ipertensione polmonare termine, sono molto costosi e non hanno il vantaggio di manipolazione genetica presente nei topi. Viceversa, l&#39;incapacità di isolare PASMC da topi era una limitazione significativa di tale sistema. Qui abbiamo descritto l&#39;isolamento di colture primarie di topo PASMC da P7, P14, P21 e topi utilizzando una variazione della tecnica precedentemente descritta di Marshall et al. 26 precedentemente utilizzato per isolare ratto PASMC. Questi PASMC murino rappresentare un nuovo strumento per lo studio delle vie di segnalazione nel periodo neonatale. Brevemente, un impasto di 0,5% (w / v) di agarosio + 0,5% di particelle di ferro in M199 media sta infuse nel letto vascolare polmonare attraverso il ventricolo destro (RV). Gliparticelle di ferro sono 0,2 micron di diametro e non possono passare attraverso il letto capillare polmonare. Così, le logge di ferro nelle piccole arterie polmonari (PA). I polmoni sono gonfiati con agarosio, rimosso e dissociato. I vasi contenenti ferro sono tirato giù con una calamita. Dopo collagenasi (80 U / ml) e l&#39;ulteriore trattamento dissociazione, i vasi vengono posti in coltura tissutale in piatto M199 terreni contenenti il ​​20% di siero fetale bovino (FBS) e antibiotici (M199 mezzi completi) per consentire la migrazione delle cellule nel piatto di coltura . Questa piastra iniziale di cellule è una miscela 50-50 di fibroblasti e PASMC. Così, la discesa procedura è ripetuta più volte per ottenere una popolazione PASMC più puro e rimuovere eventuali residui di ferro. Smooth identità delle cellule muscolari è confermata da immunoistochimica per la muscolatura liscia e miosina desmin.

Durante e dopo l&#39;isolamento, PASMC sono esaminate sia al microscopio ottico e da immunoistochimica per marcatori di cellule muscolari lisce. Al microscopio ottico all&#39;inizio del protocollo, PASMC sono visti migrazione sulla cultura piatto tessuto dal piccolo ferro contenente vasi (Figura 1A). Dopo la messa in comune piastre da uno a tre il giorno tredici, poi le particelle di ferro non sono più visti come quelli che sono stati tirati fuori nella fase finale di messa in comune. Invece, una popol...

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Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Abbiamo sviluppato una nuova tecnica e riproducibile per isolare colture primarie di cellule muscolari lisce delle arterie polmonari (PASMC) da topi giovani come P7, consentendo in tal modo una migliore studio delle vie di segnalazione coinvolte nella contrazione delle cellule muscolari lisce neonatale e relax.

Isolamento di polmonare cellule muscolari lisce di topi neonati

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

isolation-of-pulmonary-artery-smooth-muscle-cells-from-neonatal-mice

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Abbiamo sviluppato una nuova tecnica e riproducibile per isolare colture primarie di cellule muscolari lisce delle arterie polmonari (PASMC) da topi giovani come P7, consentendo in tal modo una migliore studio delle vie di segnalazione coinvolte nella contrazione delle cellule muscolari lisce neonatale e relax.

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Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ from internal stores, and allows multiple cells to be monitored simultaneously to assess, for example, coupling in syncytial tissue. Subcellular Ca2+ transients are common in smooth muscle, yet are difficult to measure accurately because of the problems caused by their stochastic occurrence, over an often wide field of view, in an organ that it prone to contract. To overcome this problem, we've developed a series of imaging protocols and analysis routines to acquire and then analyse, in an automated fashion, the frequency, location and amplitude of such events. While this approach may be applied in other contexts, our own work involves the detection of local purinergic Ca2+ transients for locating transmitter release with submicron resolution. 
ATP is released as a cotransmitter from autonomic nerves, where it binds to P2X1 receptors on the smooth muscle of the detrusor and vas deferens. Ca2+ enters the smooth muscle, resulting in purinergic neuroeffector Ca2+ transients (NCTs). The focal Ca2+ transients allow the optical monitoring of neurotransmitter release in a manner that has many advantages over electrophysiology. Apart from the greatly improved spatial resolution, optical recording has the additional advantage of allowing the recording of transmitter release from many distinguishable sites simultaneously. Furthermore, the optical plane of focus is easier to maintain or correct during long recording series than is the repositioning of an intracellular sharp microelectrode. 
In summary, a method for imaging of Ca2+ fluorescence is outlined which details the preparation of tissue, and the acquisition and analysis of data. We outline the use of several scripts for the analysis of such Ca2+ transients.

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Details methods for high-resolution Ca2+ imaging of smooth muscle within isolated organs, including: preparation of the tissue, image acquisition and data analysis.

Focale Ca 2 + Rilevamento transitoria nel muscolo liscio

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

Isolamento di cellule umane ombelicale muscolatura liscia arteriosa (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolamento dei neonatale extraepatico colangiociti

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

L&#39;isolamento di Murine coronarica vascolari cellule muscolari lisce

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Measuring Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells Using Click Chemistry

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease processes. For these reasons, measuring proliferation is a common tool used to assess cell function. Cell proliferation can be measured simply by counting; however, this is an indirect means of measuring proliferation. One common means of directly detecting cells preparing to divide is by incorporation of labeled nucleoside analogs. These include the radioactive nucleoside analog 3H-thymidine plus non-radioactive nucleoside analogs such as 5-bromo-2&#8217; deoxyuridine (BrdU) and 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU). Incorporation of EdU is detected by click chemistry, which has several advantages when compared to BrdU. In this report, we provide a protocol for measuring proliferation by the incorporation of EdU. This protocol includes options for various readouts, along with the advantages and disadvantages of each. We also discuss places where the protocol can be optimized or altered to meet the specific needs of the experiment planned. Finally, we touch on the ways that this basic protocol can be modified for measuring other cell metabolites.

Proliferation is a critical part of cellular function, and a common readout used to assess potential toxicity of new drugs. Measuring proliferation is, therefore, a frequently used assay in cell biology. Here we present a simple, versatile method of measuring proliferation that can be used in adherent and non-adherent cells.

Misurazione della proliferazione delle cellule muscolari lustiche vascolari utilizzando la chimica dei clic

The ability of a cell to proliferate is integral to the normal function of most cells, and dysregulation of proliferation is at the heart of many disease ...