Trabajar en el laboratorio Hammarlund está financiado por: NIH R01-01 y NS066082 T32GM007223, la Fundación Beckman y la Ellison Medical Foundation.

1. Montaje del sistema Los componentes específicos de nuestro sistema se describen a continuación. Cuando está bien ensamblado, el usuario debe ser capaz de enfocar el microscopio con una mano, mueve el escenario con el otro (ya sea con el ratón o el joystick), activar el láser con el pedal de pie, y tener una visión clara de la en- imagen de la pantalla. <ol><li> MicroPoint láser montado en el puerto de epi-fluorescencia de un microscopio compuesto. Utilizamos un 80i Nikon, pero cualquier ámbito de investigación de calidad en posición vertical o invertida debería funcionar. El sistema MicroPoint incluirá una dicroica personalizada, que debe coincidir con el fluoróforo que las etiquetas de las celdas que desea cortar. Células de corte marcado con fluoróforos alternativa requiere dicroicos adicionales. Además, un generador de impulsos y el pedal vienen con el sistema MicroPoint. </li><li> 100x, 1,4 NA objetivo de aceite para la realización de la cirugía y la evaluación de la regeneración, además de los objetivos adicionales que sean necesarios para la localización de la muestra en la diapositiva. Utilizamos una Nikon Plan Apo VC para la cirugía, y encontrar que un 4x es útil para el enfoque grueso y la búsqueda de la muestra. </li><li> Motorizados escenario con joystick. Un escenario con una precisión extremadamente alta y la repetibilidad es innecesaria, ya que el escenario sólo se utiliza para la orientación. Nosotros usamos un Prior II OptiScan (véase la discusión). </li><li> Cámara. La cámara tiene que proporcionar una velocidad suficiente para el enfoque y objetivo de la neurita etiquetados con el objetivo de 100x, mientras se visualiza la imagen en el monitor de la computadora. Preferimos atenuar la luz de la iluminación durante el procedimiento de axotomía para evitar posibles efectos de confusión de la foto-decoloración o daño (ver 1.7, abajo). De este modo, la cámara tiene que ser lo suficientemente sensible como para dar cabida a este nivel de reducción de la luz. Utilizamos un Hamamatsu Orca 05G, y encontrar que las imágenes de 16,3 Hz es suficiente. Cámaras equivalente podría ser sustituido. </li><li> Computadora, el monitor y las imágenes de software que puede manejar la cámara. Además, se utiliza el software de imágenes para manipular la platina con el ratón (ver discusión). </li><li> Aire mesa. Este requisito puede variar dependiendo de la ubicación, pero ya que la cirugía se realiza con un objetivo de 100x, nos encontramos con el aislamiento de vibraciones que son esenciales. </li><li> Suministro de luz con guía de luz y el mecanismo del obturador para iluminar el fluoróforo. La guía de luz se adhieren a la MicroPoint. El mecanismo del obturador es útil para reducir la intensidad de la iluminación de forma independiente del láser. Nosotros usamos un Prior Lumen 200 o una Leica EL6000, y atenuar hasta un 80% de intensidad de luz total para axotomía. </li></ol> 2. Láser de configuración Un protocolo detallado para alinear inicialmente y el enfoque del láser se suministra con el sistema láser MicroPoint. Suponemos que el procedimiento se ha seguido con éxito en la configuración inicial. Esto incluye la alineación del láser con el punto de mira en el ocular. Aquí les ofrecemos un protocolo para el mantenimiento regular de enfoque del láser y la intensidad. Como se indica en el manual de MicroPoint, el láser pulsado de nitrógeno es capaz de dañar gravemente el ojo humano. Se debe tener cuidado a no mirar directamente al rayo láser. Una vez instalado, el filtro de barrera de seguridad debe bloquear la radiación a través de los oculares. Corte de las neuronas de un organismo del tamaño de un grano de arena puede ser un reto. Desde el área de los daños causados ​​por el láser es muy pequeña, es esencial conocer la ubicación tridimensional de enfoque del láser para apuntar a la muestra con precisión. El enfoque de láser se encuentra con la diapositiva espejo. En primer lugar, comprobar que la localización del foco z láser coincide con el enfoque de la ruta de la imagen. A continuación, la posición xy del enfoque de daños está marcado con punto de mira en el software de imágenes. Centrándose en el plano z <ol><li> Presione el filtro de densidad neutra ND16 (Figura 1a). Usamos filtros de densidad neutra en el camino de epi-iluminación para atenuar el láser durante el enfoque. Para centrarse aún más fina, empuje, tanto en el ND16 y ND4 filtros fluorescentes. </li><li> Ajuste el láser MicroPoint a un pulso con el interruptor de vuelta a &#39;Select&#39; (Figura 1b), y luego mover la rueda de filtros a la correspondiente filtro de barrera largo de paso (Figura 1c). </li><li> Colocar la placa de espejo en el escenario y se centran en pequeños agujeros en ella con el objetivo de 4x con luz transmitida. </li><li> Añadir una gota de aceite de inmersión a la diapositiva espejo y volver a centrarse en agujeros con el objetivo de 100X. Abrir el obturador de la cámara con la ruta de la palanca de conmutación óptica (Figura 1d) y el disparador láser (Figura 1e). Si es necesario, reducir la intensidad de luz transmitida para que los bordes de los orificios son claras: esto ayuda a centrar con exactitud. </li><li> Presione el pedal. Esto debería producir un pequeño agujero en el espejo si el láser se enfoca correctamente. </li><li> Enfocar el microscopio ligeramente por encima del plano de la corredera de espejo y disparar el láser de nuevo. Esto debería hacer una aún más pequeñaagujero que el primer tiro, o no dejan marca en absoluto. Repita centrándose debajo de la diapositiva espejo. </li><li> Si un agujero no se produce en 2.5, o si un agujero más grande se produce cuando se enfoca por encima o por debajo de la superficie del espejo, reenfocar el láser con el anillo de enfoque en la cabeza la ablación. Verificar que el agujero sigue siendo alineada con el punto de mira en el ocular. Con el uso constante, el enfoque plano z rara vez necesita ser ajustado. </li></ol> Centrándose en el plano xy <ol start="8"><li> Siga los pasos del 2.1 al 2.3 anterior y presione el pedal para hacer un pequeño agujero en la diapositiva espejo. </li><li> Iniciar &#39;en vivo&#39; el modo de captura de &quot;tomar prestado&quot; los elementos del menú. En la &#39;medida&#39; barra de herramientas, seleccione &#39;ROI editor, a continuación, seleccione la herramienta de &quot;traición&quot; y arrastre el punto de mira para alinearlos con el centro del agujero de nuevo. Haga clic en &quot;Guardar retorno de la inversión&quot;, &quot;Salir del editor&quot; y luego y reanudar el modo de captura en vivo. </li><li> Activar el &quot;ratón XY&quot; en la configuración Elementos de manipular el escenario con el ratón. </li><li> Saque el filtro de densidad neutra (s) a la posición original (s), conjunto de los pulsos de láser a 10, y eliminar la diapositiva espejo. </li></ol> Ajuste de la potencia del láser <ol start="12"><li> La potencia del láser se debe ajustar a la potencia mínima necesaria para reducir la neurona de su elección. Ajustar la potencia al mover la placa atenuador (Figura 1 F) durante el corte gusanos vivos (descrito más adelante). Si la potencia del láser es muy alto, va a causar un daño periférico o explosión de un agujero en el gusano. Si la potencia del láser es muy baja, no va a romper la neurona. Una vez que el sistema ha sido establecido, la posición del atenuador rara vez necesita ser cambiado. Si el láser se debilita, y la placa atenuador debe moverse para continuar el corte, que podría ser una señal de que el medio de contraste en la celda de medio de contraste debe ser reemplazada (ver discusión). </li></ol> 3. Inmovilizar a los gusanos <ol><li> Prepare una solución de 3% agarosa fundida en M9 (KH2PO4 22mm, 42mm Na2HPO4, 85 mm de NaCl, 1 mM MgSO4). Dispense 5 ml de agarosa fundida en un tubo Falcon de 15 ml. Llenar otro tubo con agua. Colocar los tubos en un elemento de calefacción modular ajustado a 55 ° C. Rellene el elemento de calefacción con agua para crear baños de agua pequeño para cada tubo. Nota: agarosa se puede preparar en grandes cantidades por adelantado y refundido para experimentos posteriores. </li><li> Coloque dos capas de cinta de etiquetado en cada uno de los dos toboganes y una lámina limpia entre las diapositivas. Prescindir de una gota de agarosa usando una pipeta bombilla de plástico a la mitad de la lámina limpia y colocar otra perpendicular a la primera diapositiva de modo que el resultado de agarosa almohadilla es el espesor de dos pedazos de cinta (Figura 2). Eliminar una de las dos diapositivas de la almohadilla después de 30 segundos. Enjuague y almacenar la pipeta de plástico en el tubo lleno de agua halcón para su uso con las siguientes diapositivas. </li><li> Lugar el próximo, 3.5 L de 0,10 m o 0,05 m perlas de poliestireno en el centro de la almohadilla. Añadir gusanos 5.10 que expresa la proteína fluorescente en las neuronas de interés. Si las neuronas de interés son de distribución asimétrica en el lado derecho o izquierdo del gusano, utiliza una selección de platino para voltear los gusanos para que el lado correcto hacia arriba. Los gusanos se debe colocar en las diapositivas de 10 minutos de la preparación de las pastillas de agarosa. </li><li> Con cuidado, coloque una hoja de cubierta de los gusanos. Después de colocar la hoja de la cubierta, no se mueven lo relativo a la plataforma de agarosa ya que esto alterar la cutícula y destruir a los gusanos. Coloque el portaobjetos preparado en la platina del microscopio. </li></ol> 4. Cortar las neuronas <ol><li> La luz directa por los oculares con la palanca de conmutación óptica camino. Se centran en que el gusano se puede cortar con el objetivo de 4X, coloque una gota de aceite en la hoja de la cubierta, y el interruptor con el objetivo de 100X. Volver al camino óptico de la cámara. </li><li> Usa el ratón para mover la neurona de su elección en el centro de la cruz. Presione el pedal para disparar el láser y romper el proceso neuronal. Si es necesario, dos conjuntos de impulsos se pueden utilizar para cortar la neurona. Al principio, es útil para rastrear con precisión que las neuronas se han roto en los gusanos individuales con el fin de evaluar la regeneración posterior. Cuando se realiza correctamente, el láser axotomía produce una pequeña pausa en la neurona sin causar daños importantes en el tejido de la piel circundante o de otras neuronas (ver figura 3). En ciertos casos, una pequeña cicatriz puede formar alrededor de la zona de la lesión. </li><li> Recuperar los gusanos mediante la eliminación de la hoja de la cubierta en un movimiento ascendente directo, teniendo cuidado de que los gusanos permanecen en la plataforma de agarosa. No deslice el cubreobjetos off. A continuación, cortar la almohadilla alrededor de los gusanos con unas pinzas de punta fina y el lugar de la sección de agarosa en un plato recién sembrado NGM contiene OP50 8. Lugar 10 l de agua estéril M9 en la plataforma para liberar a los gusanos de las cuentas y eliminar de agarosa. </li></ol> 5. Puntuación para la regeneración de las neuronas <ol><li> Preparar agarosa al pad como se indica en el paso 2.2. </li><li> Gusanos lugar en 3.5 ymu, L de perlas de poliestireno. Tapar con un cubreobjetos. Las diapositivas se pueden preparar de forma secuencial, o bien todos los gusanos se pueden preparar con antelación y las diapositivas de mantenerse en platos de 10 cm la cultura, cada uno con un Kimwipe húmedo para mantener la humedad de agarosa. </li><li> Utilice el objetivo 100X para visualizar las neuronas cortadas. En muchas neuronas, un tronco neuronal distal a la zona de corte se mantendrá. Usamos la presencia de este remanente como un indicio de que la neurona se cortó de hecho (Figura 4). La presencia de esta cepa permite distinguir una neurona que se ha cortado y se regenera a partir de uno que no se corte. Nota: tanto los tocones distal y proximal inicialmente retractarse después de ser cortado. </li><li> Evaluar la regeneración. Una variedad de parámetros se puede determinar. Un simple ensayo es determinar si la neurona lesionada se ha formado un cono de crecimiento (Figura 4) y se regenera, o no (Figura 4b). Por otra parte, la longitud de las neuritas se puede rastrear y comparar. </li></ol> 6. Los resultados representativos A modo de ejemplo, se describe la caracterización de la regeneración del ácido γ-aminobutírico (GABA), las neuronas motoras. Estas neuronas, que residen en el cordón nervioso ventral y ampliar los procesos de forma circunferencial para el cordón nervioso dorsal, son esenciales para la locomoción adecuado 9. Las neuronas GABA pueden ser visualizadas por expresar un fluoróforo genéticamente codificados, como la proteína verde fluorescente (GFP), bajo el control de la UNC o -47 -25 unc promotores (cepas EG1285 y CZ1200, respectivamente, disponibles en el C. elegans Centro Genético ). Monte L4-etapa gusanos como se describe, dar la vuelta a los gusanos que las neuronas GABA sobre su costado derecho son hacia arriba, y colocar el cubreobjetos. Cortar 1-3 de las comisuras posterior de cada gusano, a medio camino entre los cordones dorsal y ventral. Evite cortar las comisuras que se cruzan o fasciculados con comisuras otros, ya que son difíciles de calificar más adelante. Recuperar los gusanos como se describe. 18 a 24 horas después de axotomía éxito, los gusanos se han recuperado de la cirugía y la exhibición de locomoción normal y la puesta de huevos comportamientos. Deseche los gusanos que han muerto o están enfermos. Vuelva a colocar el resto tal como se describe, y evaluar la regeneración. Por lo general, tienen por objeto evaluar al menos 30 neuronas corte por condición experimental. En oxIs12 animales, por lo general el 60-70% de las neuronas GABA cortada L4 se han puesto en marcha una estructura de cono de crecimiento, evidenciado por la ampliación de la membrana en la punta y la extensión de las neuritas varias ramas, y emigró desde el sitio de corte (Figura 4). En muchos casos, los conos de crecimiento se han migrado a reconectarse con el cordón nervioso dorsal, una comisura neuronal adyacente, o el muñón distal. El restante 30% de las neuronas se han iniciado o no el crecimiento, la formación de un muñón proximal al sitio de axotomía, o se han extendido sólo pequeñas filopodios (Figura 4b). <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. La UV láser pulsado sistema axotomía. Los componentes específicos son: (a) los filtros ND (b) Impulso de selección (c) la palanca de la rueda de filtros (d) La ruta de conmutación óptica palanca (e) disparo láser y (f) Una placa atenuador. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. La preparación de una plataforma de agarosa. Para preparar una plataforma de agarosa del grosor deseado, dos capas de cinta (verde) se colocan en dos diapositivas. Una diapositiva se coloca entre los dos primeros, y una gota de agarosa se añade a la lámina limpia. Por último, una cuarta diapositiva se coloca perpendicular a los tres primeros, lo que resulta en una plataforma que es el espesor de dos pedazos de cinta. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Representante de las neuronas GABA axotomies. En un experimento típico, GABA comisuras neurona se cortan a la mitad de la cara lateral del gusano. Una comisura cortada se muestra inmediatamente antes (izquierda) y después (derecha) axotomía. Todas las imágenes fueron tomadas con un objetivo de aceite de 100X. <img src="/files/ftp_upload/2707/2707fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Los resultados representativos de GABA axotomies neurona. 24 horas después de axotomía axones dañados se anotó para la regeneración. Un axón con la regeneración de un cono de crecimiento (flecha) se muestra en (a) mientras que una regeneración axonal no es visto como un muñón proximal (flecha) en (b). El muñón distal del axón de cada corte se muestra en cada panel (cabeza de flecha) y es una indicación de que el axón se ha roto.

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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-synapse+ablation+and+long-term+imaging+in+live+C.+elegans.">Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 173, 20-26 (2008).</li><li>Pujol, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Innate+Immune+Responses+to+Infection+and+Wounding+in+the+C.+elegans+Epidermis.">Distinct Innate Immune Responses to Infection and Wounding in the C. elegans Epidermis.</a> Current biology. CB 18, 481-489 (2008).</li></ol>

Una variedad de sistemas de láser se han utilizado para cortar las neuritas en C. elegans, y varios estudios han examinado en detalle su funcionamiento 3,7,10,11. El láser MicroPoint utilizados en nuestro protocolo es un sistema llave en mano que es fácil de configurar y mantener, y está disponible a un bajo costo a los investigadores en comparación con un sistema de Ti-Zafiro láser. En comparación con un sistema de Ti-Zafiro, sin embargo, el láser MicroPoint se espera que cause daño a un área más grande, que puede ser perjudicial para algunas aplicaciones. Si un sistema de Ti-Zafiro es deseada, un protocolo de excelente en la construcción de un sistema está disponible 12. El protocolo actual se puede realizar en una variedad de neuronas en C. elegans, sin embargo, observamos que las diferencias en la capacidad de regeneración entre los distintos tipos de neuronas se espera 13. Además, diferentes orígenes transgénicos pueden afectar el éxito de regeneración. Aunque el porcentaje de regeneración de las neuronas GABA es bastante consistente entre las diferentes cepas transgénicas marcador, hemos observado un aumento global leve en la regeneración de juIs76 14 vs 15 oxIs12 gusanos. Las diferencias entre los marcadores de las neuronas de contacto también se han descrito 2. Nosotros preferimos para inmovilizar a los gusanos con microesferas en lugar de anestésicos como las cuentas de resultado más rápido y la inmovilización más consistente 16. Esto también es ventajosa, ya que son capaces de observar la regeneración libre de cualquier posible efecto de confusión debido a la anestesia 17. Una alternativa anestésica sin método de inmovilización es el uso de dispositivos de microfluídica. El uso de microfluidos para axotomía se ha descrito ampliamente 17-22. Nos encontramos con que con el uso constante, las funciones de láser mejor cuando la cumarina 440 en la celda de medio de contraste se cambia una vez por semana siguiendo el procedimiento descrito en el manual de MicroPoint. Si es necesario, el control deslizante de atenuación se puede utilizar para aumentar la potencia, pero esto puede ser un indicio de un colorante de edad o falta de alineación láser. Además, la celda tiene un tinte de vida útil limitada y eventualmente tendrá que ser reconstruido o reemplazado (Consulte Solución de problemas). Puede ser difícil de maniobrar la neurita objetivo en la mira de que marca el centro de láser, sobre todo si el animal está completamente paralizado. Nos encontramos con que una etapa de manual no es óptima para este propósito, aunque es ciertamente útil. Una etapa de mando con control motorizado es más preciso, y nos encontramos con que el uso de software que soporta la imagen arrastrando con el ratón para mover la platina es el mejor. Elementos de Nikon ofrece esta característica y se describe en este protocolo, pero el paquete micromanager libre, así como software de imagen, pueden tener una funcionalidad similar. Una forma diferente de la orientación fina para mover el foco de láser, en lugar del animal. Un galvanómetro orientación del haz mecanismo está disponible como un add-on para el láser MicroPoint, si este enfoque es el preferido. Además de su aplicación al estudio de la regeneración neuronal, el láser puede ser usado para la ablación de otros tipos de células, como piel, músculos o células especializadas, o para alterar las sinapsis neuronales específicos 23-27. Por otra parte, las vías que regulan la degeneración de las neuronas que acompaña a una lesión o enfermedad puede ser investigado con este sistema. Como tal, el uso de láseres pulsados ​​continuará para arrojar luz sobre dos de los factores genéticos y los cambios biológicos celular que facilitan la regeneración neuronal y otros procesos pertinentes. Solución de problemas: Aquí descritos son algunos de los problemas comunes y sus soluciones asociadas. <ol type="a"><li> El láser no es cortar correctamente. Esto es probable, ya sea porque el láser está fuera de foco (ver sección 2), o el tinte en la celda de medio de contraste debe ser repuesta (ver MicroPoint manual). Por otra parte, la célula de tinte deben ser reemplazados o reconstruidos. </li><li> Los gusanos se están moviendo en la plataforma de agarosa. Esto es generalmente un signo de que la plataforma de agarosa es demasiado húmedo. Nos encontramos con que las almohadillas deben dejarse durante aproximadamente 30 segundos antes de que los gusanos se colocan sobre ellos para evitar este problema. También puede intentar usar el menor tamaño (0,05 m) microesferas. </li><li> La recuperación de los gusanos es difícil e ineficiente. Esto puede ser causado por la eliminación cubreobjetos incorrecta o por una almohadilla seca de agarosa. Si la superficie es muy seca, usted puede notar que los axones desarrollar una apariencia de cuentas. En algunos casos, esto se debe a que los gusanos no se colocaron en la plataforma lo suficientemente rápido después que se hizo. Por otra parte, una madre vieja de la solución de agarosa puede tener una concentración superior al 3% después de la fusión repetida. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios </th></tr><tr><td> 0,05 m perlas de poliestireno </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 08691 </td><td></td></tr><tr><td> 0,10 m perlas de poliestireno </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 00876 </td><td></td></tr><tr><td> Agarosa GPG / LE </td><td> Estadounidense Bioanalytical </td><td> 00972 </td><td> Ultra pura </td></tr><tr><td> Falcon 14 ml de poliestireno de fondo redondo de tubo </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> 17 x 100 mm estilo, apirógena </td></tr><tr><td> Thermo Scientific normal precleaned portaobjetos </td><td> Erie Ciencia Empresa </td><td> 420-004T </td><td> 3 &quot;x 1&quot; x 1 mm </td></tr><tr><td> Cubreobjetos </td><td> VWR </td><td> 48366 205 </td><td> 18 mm x 18 mm N º 1 1 / 2 </td></tr><tr><td> KIMTECH Ciencia Kimwipes </td><td> Kimberly-Clark </td><td> 34155 </td><td></td></tr><tr><td> BD Falcon 100 x 15 mm Estilo de Petri </td><td> BD Biosciences </td><td> 351029 </td><td></td></tr><tr><td> Cinta en blanco 3/4w x 500 litros </td><td> TimeMed </td><td> T-512 </td><td></td></tr><tr><td> Inmersión en aceite </td><td> Nikon </td><td></td><td> Tipo A, nd = 1,515 </td></tr><tr><td> EG1285 o CZ1200 </td><td> C. elegans Centro Genético </td><td> http://www.cbs.umn.edu/CGC/strains/ </td><td></td></tr><tr><td> OptiScan II </td><td> Científica previa </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NIS-Elements Ar o Br </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La ablación con láser MicroPoint sistema </td><td> Fotónicos Científico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Compuesto microscopio </td><td> Nikon </td><td> Eclipse 80i </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu cámara </td><td> Hamamatsu Photonics </td><td> Modelo C8484-05G01 </td><td></td></tr><tr><td> Dell Precision T3400 PC con Intel Core 2 Duo </td><td> Dell </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Windows XP Professional </td><td></td><td> Microsoft </td><td> Versión de 2002, Serie Pack 3 </td></tr><tr><td> Doble baño seco Incubadora </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Controles analógicos </td></tr><tr><td> 4X Plan Fluor objetivo </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100X Plan Apo VC objetivo de aceite </td><td> Nikon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 / 45 pinzas </td><td> Dumont </td><td> 11251-35 </td><td> Dumoxel puntas estándar, también puede utilizar # 7 </td></tr><tr><td> Microscopio de disección </td><td> Nikon </td><td> SMZ800 </td><td> Con NI-150 Iluminador de alta intensidad </td></tr></tbody></table>

in vivo laser axotomy in c. elegans

Las neuronas se comunican con otras células a través de los axones y las dendritas, las extensiones delgadas membranas que contienen las especialidades pre-o post-sináptica. Si una neurona se daña por una lesión o enfermedad, se pueden regenerar. Factores de las células intrínsecas y extrínsecas influyen en la capacidad de una neurona para regenerarse y recuperar la función. Recientemente, el nematodo C. elegans se ha convertido en un organismo modelo excelente para identificar los genes y las vías de señalización que influyen en la regeneración de las neuronas 1-6. La principal forma de iniciar la regeneración neuronal en el C. elegans es mediada por láser de corte, o axotomía. Durante axotomía, un proceso marcado con fluorescencia neuronal se corta con pulsos de alta energía. Inicialmente, la regeneración neuronal en el C. elegans fue examinada usando un láser de femtosegundos amplificados 5. Sin embargo, estudios posteriores han demostrado que la regeneración de un láser pulsado convencional puede ser utilizado para cortar con precisión las neuronas in vivo y obtener una respuesta similar de regeneración 1,3,7. Se presenta un protocolo para llevar a cabo in vivo con láser axotomía en el gusano utiliza un láser pulsado MicroPoint, un sistema de llave en mano que está fácilmente disponible y que se ha utilizado ampliamente para la ablación de células específicas. Se describe la alineación del láser, el montaje de los gusanos, el corte neuronas específicas, y la evaluación de la regeneración posterior. El sistema ofrece la posibilidad de cortar un gran número de neuronas de gusanos múltiples durante un experimento. Por lo tanto, el láser axotomía como se describe aquí es un sistema eficiente para la iniciación y el análisis del proceso de regeneración.

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In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Un protocolo para cortar las neuronas<em&gt; C. elegans</em&gt; Con un láser pulsado MicroPoint se presenta. Se describe la configuración del sistema, la inmovilización de los gusanos, y la ruptura de neuronas marcadas. Las ventajas incluyen un sistema de costo relativamente bajo y la capacidad de separar los procesos neuronales o células de la ablación<em&gt; In vivo</em&gt;.

En vivo láser axotomía en C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

18.2K vistas.  Yale University School of Medicine. Un protocolo para cortar las neuronas C. elegans Con un láser pulsado MicroPoint se presenta. Se describe la configuración del sistema, la inmovilización de los gusanos, y la ruptura de neuronas marcadas. Las ventajas incluyen un sistema de costo relativamente bajo y la capacidad de separar los procesos neuronales o células de la ablación In vivo.

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Investigación

Neurociencias

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimagen Funcional Utilizando ultrasonidos hematoencefálica perturbación de la barrera y la RM-manganeso mayor

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

La cuantificación automática de la fluorescencia en el Synaptic<em&gt; C. elegans</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps shape attention and also protects cells from over-stimulation. Adaptation within the olfactory circuit of C. elegans was first described by Colbert and Bargmann1,2. Here, the authors defined parameters of the olfactory adaptation paradigm, which they used to design a genetic screen to isolate mutants defective in their ability to adapt to volatile odors sensed by the Amphid Wing cells type C (AWC) sensory neurons. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor3 for 30 min they will adapt their responsiveness to the odor and will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~1 hr. When wildtype C. elegans animals are exposed to an attractive AWC-sensed odor for ~1 hr they will then ignore the adapting odor in a chemotaxis behavioral assay for ~3 hr. These two phases of olfactory adaptation in C. elegans were described as short-term olfactory adaptation (induced after 30 min odor exposure), and long-term olfactory adaptation (induced after 60 min odor exposure). Later work from L'Etoile et al.,4 uncovered a Protein Kinase G (PKG) called EGL-4 that is required for both the short-term and long-term olfactory adaptation in AWC neurons. The EGL-4 protein contains a nuclear localization sequence that is necessary for long-term olfactory adaptation responses but dispensable for short-term olfactory adaptation responses in the AWC4. By tagging EGL-4 with a green fluorescent protein, it was possible to visualize the localization of EGL-4 in the AWC during prolonged odor exposure. Using this fully functional GFP-tagged EGL-4 (GFP::EGL-4) molecule we have been able to develop a molecular readout of long-term olfactory adaptation in the AWC5. Using this molecular readout of olfactory adaptation we have been able to perform both forward and reverse genetic screens to identify mutant animals that exhibit defective subcellular localization patterns of GFP::EGL-4 in the AWC6,7. Here we describe: 1) the construction of GFP::EGL-4 expressing animals; 2) the protocol for cultivation of animals for long-term odor-induced nuclear translocation assays; and 3) the scoring of the long-term odor-induced nuclear translocation event and recovery (re-sensitization) from the nuclear GFP::EGL-4 state.

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Here we describe a molecular readout of long-term olfactory adaptation in Caenorhabditis elegans. The Protein Kinase G, EGL-4, is necessary for stable adaptation responses in the primary sensory neuron pair called AWC. During prolonged odor exposure EGL-4 translocates from the cytosol to nucleus of the AWC.

Una lectura molecular de adaptación a largo plazo olfativa en<em&gt; C. elegans</em

During sustained stimulation most sensory neurons will adapt their response by decreasing their sensitivity to the signal. The adaptation response helps ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Formación de imágenes in vivo de calcio neuronal en C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this protocol focuses on how to image dividing neuroblasts, which are found underneath the epidermal cells and may be important for epidermal morphogenesis. Tissue formation is crucial for metazoan development&#160;and relies on external cues from neighboring tissues. C. elegans is an excellent model organism to study tissue morphogenesis in vivo due to its transparency and simple organization, making its tissues easy to study via microscopy. Ventral enclosure is the process where the ventral surface of the embryo is covered by a single layer of epithelial cells. This event is thought to be facilitated by the underlying neuroblasts, which provide chemical guidance cues to mediate migration of the overlying epithelial cells. However, the neuroblasts are highly proliferative and also may act as a mechanical substrate for the ventral epidermal cells. Studies using this experimental protocol could uncover the importance of intercellular communication during tissue formation, and could be used to reveal the roles of genes involved in cell division within developing tissues.

Visualizing Neuroblast Cytokinesis During C. elegans Embryogenesis

This protocol describes how to image dividing cells within a tissue in Caenorhabditis elegans embryos. While several protocols describe how to image cell division in the early embryo, this protocol describes how to image cell division within a developing tissue during mid late embryogenesis.

Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogénesis

This protocol describes the use of fluorescence microscopy to image dividing cells within developing Caenorhabditis elegans embryos. In particular, this ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser Nanocirugía del cerebelo Los axones<em&gt; En Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

En vivo de imágenes de Dauer-específica neuronal Remodelación en C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...